Khóa luận Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon)

dịch bệnh chung ở trên cho thấy để phát triển bền vững nghề nuôi tôm đòi hỏi phải kết hợp rất nhiều yếu tố quan trọng như nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi tôm thịt, các vấn đề về dinh dưỡng và môi trường, đồng thời không kém phần quan trọng đó là nghiên cứu các tác nhân gây bệnh để tìm ra những biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả. 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú. Môi trường nước gồm một loạt các thông số tác động đến sự sinh trưởng và tái sản xuất của sinh vật. Ở điều kiện bình thường thì giữa sinh vật (vật chủ ), nguồn bệnh và môi trường giữ trạng thái cân bằng, bất cứ sự phá vỡ cân bằng nào đều có thể gây bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, nguồn gốc chính của việc phát sinh bệnh là vấn đề môi trường dù rằng trong bản thân nội tại của vật chủ có sự tồn tại của mầm bệnh, đây không nên xem là nguyên nhân chính sinh ra bệnh. Cơ chế kháng bệnh của tôm chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu, điều này có hạn chế so với động vật có xương sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không có và không tạo ra được kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập. Các phân tử có hoạt tính miễn dịch trong huyết tương (hemolymph) của tôm gồm hai dạng chủ yếu là huyết bào (hemocyte) và các phân tử lectin. Từ máu của giáp xác có thể phân lập được ba nhóm tế bào là bạch cầu không hạt, bạch cầu bán hạt và bạch cầu có hạt. Trong đó bạch cầu không hạt chủ yếu là những thực bào loại bỏ các thể lạ xâm nhập bao gồm virus, vi khuẩn và các tế bào nấm. Số lượng tế bào thực bào chiếm từ 2 - 28 % trong tổng số các tế bào máu. Sự thực bào có thể xảy ra tại nơi bị tổn thương, trong các mô và cơ quan lọc của hệ thống tuần hoàn và đôi khi cả chính trong thể dịch. Hiệu quả của sự thực bào phụ thuộc vào tác nhân xâm nhập, cũng như các yếu tố sinh lý của ký chủ và môi trường. Bạch cầu bán hạt đóng vai trò đầu tiên trong việc phát hiện và bắt giữ các thể lạ có kích thước lớn, và trợ giúp cho hoạt động thực bào thông qua sự hoạt hoá của hệ thống Pro-phenoloxydase. Kết quả của quá trình hoạt hoá này là các sản phẩm oxy hoá được hình thành có hoạt tính cao và do đó rất độc đối với vi sinh vật. Lectin là phân tử glycoprotein có khả năng gắn với phần đường của các phân tử khác, đặc biệt ở các tác nhân lạ. Điều kỳ lạ là vi khuẩn, virus, độc tố cũng có thể có lectin bề mặt. Các phân tử lectin này một mặt có thể giúp nối kết tác nhân lạ với huyết bào tôm, hoạt hóa chúng làm tăng hoạt động thực bào và hoạt tính kháng khuẩn. Mặt khác vi khuần, virus cũng có thể sử dụng lectin để sáp nhập vào tế bào tôm ở vị trí các thụ thể để khởi đầu cho quá trình nhiễm trùng. Ngoài các bạch cầu kể trên thì ở giáp xác có các tiểu quần thể bạch cầu đảm nhiệm chức năng như tế bào diệt tự nhiên, tiêu diệt tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus và tế bào ngoại lai. Như vậy tôm cũng có đáp ứng miễn dịch tế bào và dịch thể đối với tác nhân virus nhưng không có tế bào tạo ra kháng thể và không có sự bảo vệ đặc hiệu chống lại tác nhân lạ. Vì vậy sự nhiễm virus dai dẳng tồn tại hiển nhiên trong cơ thể tôm. Vì thế việc tăng cường sức đề kháng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản thuộc nhóm giáp xác không thể dựa vào việc sử dụng các loại vaccin mà chủ yếu là các biện pháp tăng cường hiệu quả đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thông qua cải thiện điều kiện môi trường nuôi và sử dụng các chất kích thích miễn dịch. 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú. 2.4.1 Tác nhân gây bệnh. Bệnh đốm trắng được xem là bệnh nguy hiểm và gây hậu quả nghiêm trọng nhất đến ngành nuôi tôm công nghiệp. Bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1993. Virus dạng hình trứng, kích thước 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kilodalton. Vỏ bao có 2 lớp protein VP28 và VP 19; nucleocapsid có 3 lớp VP26, VP24 và Vp15. Nhân có cấu trúc DNA sợi đôi ( dsDNA ): không có thể ẩn ( Occlusion body ). Khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm rất yếu và mềm vỏ do các đốm trắng (nên gọi là bệnh đốm trắng) có đường kính từ 0,5 – 2 mm, hiện rất rõ ở dưới vỏ kitin. Đốm trắng là chất đọng lại không bình thường của muối canxi bởi biểu bì vỏ kitin. Khi đã thấy rõ dấu hiệu này thì tôm chết rất nhanh. 2.4.2 Khu vực phân bố. Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, sau đó bệnh lan rộng ra khắp khu vực Châu Á và trên thế giới. Dịch bệnh được phát hiện trước tiên ở Đài Loan năm 1992, Trung Quốc 1993, sau đó là Nhật, Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ 1995). Bệnh đã làm giảm nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên. 2.4.3 Ký chủ. Hầu hết các loài tôm he đều có thể nhiễm bệnh này. Một số loài tôm he có thể nhiễm ngoài tự nhiên như P. monodon, P. japonicus, P. chinensis, P. indicus, P. merguiensis, P. seriferus, P. vannamei. Một số tôm he đã bị nhiễm trong điều kiện thí nghiệm như P. stylirotris, P. aztecus, P. duorarum, P. setifecus,… Một điều nguy hiểm là ngoài tôm he, một số loài của Metapenaeus spp cũng bị nhiễm, và một số giáp xác khác như cua (Scylla serrata, Callapa lophos,…), tôm hùm (Parulinus spp), tôm càng xanh (Macrobrachium rosrnbergii), Artemia,…cũng có thể bị nhiễm trong tự nhiên và trong cảm nhiễm nhân tạo. Mặt khác bệnh này có thể xảy ra ở hầu hết giai đoạn phát triển của tôm. Người ta đã gặp bệnh này ở Postlarvae 20 ngày tuổi, tôm mẹ, nhưng thường xảy ra nhất là ở Post 50 – 70 ngày tuổi. Rajendran và CTV (1999) đã nghiên cứu thực nghiệm ở bờ biển Đông Nam Ấn Độ bằng cách lấy virus bệnh đốm trắng từ tôm sú nhiễm bệnh tiêm hoặc cho ăn với 5 loài tôm nước mặn (P. monodon, P. indicus, P. semisulcatus, Metapenaeus monoceros), 2 loài tôm nước ngọt (Macrobrachium rosenbergii, M. idella), 4 loài cua (Scylla serrata, S. tranquebarica, Metapograpsus sp, Sesarma sp) và 3 loài tôm hùm (Panulirus homarus, P. ornatus, P. polyphagus). Tất cả các loài thí nghiệm đều nhiễm virus bệnh đốm trắng. Các loài tôm nhiễm bệnh thực nghiệm đều có dấu hiệu bệnh lý và mô bệnh học như tôm sú nhiễm bệnh tự nhiên. Tỷ lệ dồn tích trong vòng 5 – 7 ngày đối với tôm tiêm virus, 7 – 9 ngày đối với tôm cho ăn virus. Hai loài cua (S. serra và tranquebarica) và tôm hùm không có dấu hiệu bệnh lý. Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự nhiên: tôm sú (P. monodon), tôm thẻ (P. indicus), tôm rảo (Metapenaeus ensis), tôm đất (M. lysianassa) (theo Lý Thị Thanh Loan, 2003); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Bùi Quang Tề, 2003). 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền. Sự phát sinh và bùng nổ bệnh đốm trắng phụ thuộc rất nhiều vào khí hậu, thời tiết và môi trường ao nuôi. Bệnh sẽ xảy ra nếu tôm mang virus và các yếu tố thủy lý, thủy hóa biến động rất lớn vượt ra ngoài ngưỡng sinh thái thích hợp. Bệnh lan truyền theo chiều dọc (từ bố mẹ sang con) và theo chiều ngang (qua nước và thức ăn, các loại giáp xác hoang dã trong ao và do tôm khoẻ ăn con bị nhiễm bệnh đốm trắng). Kết quả theo dõi tôm sú nuôi tại Hải Phòng và Hà Tĩnh năm 2003 của Bùi Quang Tề cho thấy lan truyền theo chiều ngang là chính. 2.4.5 Cơ chế xâm nhập. Theo L .M.passano, đây là dạng DNA virus, hình que ngắn. Khi xâm nhập vào tôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận như nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi thâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm số lượng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào, virus tiếp tục phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào sau đó lan truyền ra môi trường nước, tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập tấn công. Hoặc tôm khoẻ ăn tôm bị nhiễm virus cũng tạo điều kiện cho virus tấn công vào ký chủ mới. Nếu virus không tìm được ký chủ mới nó chỉ có thể sống được trong môi trường nước khoảng 24 giờ. 2.4.6 Bệnh lý Có thể chia bệnh virus đốm trắng thành hai dạng. Dạng 1 là bệnh cấp tính gây tỷ lệ chết cao trong vòng 2 tuần. Bệnh thường gặp ở các loài tôm: P. monodon, P. indicus và P. penicilatus. Dạng 2 là bệnh tiềm ẩn, virus đặc biệt này tồn tại trong các loài tôm Macrobrachium sp, các loại cua tự nhiên, tôm hùm tự nhiên thường không có dấu hiệu bệnh lý rõ rệt. Tuy nhiên một số nhà khoa học khác đã chia bệnh virus đốm trắng xuất hiện ở tôm he thành 3 dạng chính theo các dấu hiệu bệnh. Trong dạng I bệnh xuất hiện (cấp tính và thứ cấp tính) mức độ phá huỷ nhiều ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết trong vòng 7 – 10 ngày và dấu hiệu bệnh lý thể hiện rõ nhất là xuất hiện các đốm trắng dưới vỏ. Tỷ lệ tôm chết từ trung bình đến cao, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm từ trung bình đến cao. Dạng II tôm chết cấp tính. Bệnh xuất hiện tác động làm tôm chuyển màu đỏ, mức độ phá huỷ rất mạnh ở các mô bị nhiễm virus, tỷ lệ tôm chết hầu hết trong vòng từ 2 – 3 ngày, tỷ lệ mẫu kiểm tra bị nhiễm rất cao. Dạng III bệnh xuất hiện mãn tính tổ chức mô phá huỷ thấp không có đốm trắng và không có màu đỏ, tỷ lệ tôm chết kéo dài từ 15 - 28 ngày. 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay. 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến. Hiện nay có nhiều phương pháp để phát hiện bệnh như phát hiện bệnh: mô học, lai tại chỗ (In Situ Hybridization), PCR (Polymerase Chain Reaction), kính hiển vi điện tử. Năm 1997, Lightner đã đưa ra bản đánh giá chung các phương pháp được ứng dụng để chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng. Bảng 2.2: Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm sú bằng các phương pháp khác nhau (Lightner, 1997). Phương pháp chẩn đoán WSSV Kết quả Kính hiển vi quang học + + Kính hiển vi phản quang + Kính hiển vi nền đen + + Kính hiển vi điện tử truyền suốt + Kính hiển vi điện tử quét - Kháng thể huỳnh quang - ELISA với PABs - ELISA với MABs - Mô học ++ DNA mẫu dò + + PCR + + + Từ bảng đánh giá trên cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy và độ chính xác cao. Vì vậy hiện nay người ta thường sử dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú. 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR. Nguyên tắc: PCR là một kỹ thuật in-vitro (trong ống nghiệm). Bằng kỹ thuật này, một chuỗi phân tử DNA đặc thù nằm giữa hai vùng của một chuỗi đã biết có thể được khuếch đại bởi một chu kỳ nhiệt được lặp đi lặp lại. Mỗi chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn chính: Biến tính chuỗi DNA kép thành mạch đơn, ở nhiệt độ 92 – 95oC, chuỗi xoắn kép DNA sẽ tách thành 2 mạch đơn. Bắt cặp giữa đoạn mồi và (primers) và mạch DNA đơn, sự bắt cặp theo chiều 3’ của sợi DNA mục tiêu ở nhiệt độ khoảng 45 – 55oC. Tổng hợp mạch DNA bổ sung từ điểm bắt cặp giữa đoạn mồi (primers) và mạch DNA đơn nhờ enzyme DNA polymerase, từ đầu 3’ của primers ở nhiệt độ khoảng 70 – 75oC. Mỗi chu kỳ DNA gồm 3 giai đoạn chính trên. Số chu kỳ được thực hiện là từ khoảng 25 – 40 chu kỳ. Số lượng đoạn gen được khuếch đại, theo lý thuyết là 2n, với n là số chu kỳ. Trong những năm gần đây, công nghệ PCR đã được nâng lên một tầm cao mới với sự ra đời của Realtime PCR. Đây là kỹ thuật dựa trên nền PCR thông thường nhưng có nhiều ưu điểm hơn. Realtime PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ được theo dõi trực tiếp. Hệ thống Realtime PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Realtime PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời đó là nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành. Để có được tín hiệu Realtime phản ứng đang diễn ra người ta sử dụng phẩm nhuộm hoặc các probe đặc hiệu. Các phẩm nhuộm như Ethidium Bromide, SYBR green, Hoechst dye khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang. Tuy nhiên các phẩm nhuộm này không cho kết quả đặc hiệu vì nó có thể chèn vào cả những DNA cần tìm và DNA không cần tìm. Vì vậy người ta thường sử dụng các probe hơn, Các probe sẽ phát sáng khi gắn bổ sung với DNA đích và không phát sáng khi ở dạng tự do. 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật. 2.6.1 Alkaloid. Theo R. F. Raffauf (Plant alkaloids: Aguide To Their Discovery and Distribution, 1996), có hơn 10.000 alkaloid khác nhau được khám phá trên 300 họ thực vật khác nhau. Alkaloid là một hợp chất hữu cơ thường có một hay nhiều vòng carbon, có chứa nitơ và có tác dụng dược lý hiệu quả trên cơ thể người và động vật. Alkaloid có tính kiềm và khi gặp acid tạo những muối có hoạt tính sinh học mạnh và đặc hiệu, có tác dụng lâm sàng rõ ràng như dùng thuốc giảm đau, thuốc gây tê đặc biệt là morphine, điều trị tăng huyết áp, rối loạn tinh thần, khối u, và thuốc chống vi khuẩn,… Ngoài ra các alkaloid có tác dụng diệt ký sinh trùng, trị nguyên sinh động vật như quinin, emezin, conessin. Tác dụng kháng khuẩn của berberin, quinon là quan trọng hơn cả. Theo Ukita Mizuno và Tamura (1994) nhận thấy thì berberin có tác dụng tốt đối với vi khuẩn tụ cầu khuẩn, trực khuẩn. Berberin có nhiều trong họ thực vật Ranunculaceae, Rutacea, Menispermaceae. Alkaloid thay đổi trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Yếu tố khí hậu, đất đai và cách thu hái, bảo quản cũng ảnh hưởng đến sự thay đổi của alkaloid trong cây. Hầu hết alkaloid đều có vị đắng, không màu hay có màu vàng như Berberin, màu đỏ như Sangkinarine,… 2.6.2 Flavonoid. Flavonoid có trong hầu hết các loại thực vật, và được lưu trữ nhiều trong hạt, ở hoa, vỏ trái cây, hay trong vỏ cây. Theo báo cáo của nhiều tác giả cấu trúc của hợp chất của phân tử bao gồm 2 vòng benzen và 3 carbon nằm ngoài 2 vòng. Là sắc tố màu vàng trong cây, màu sắc đậm nhạt thay đổi theo từng loại cây. Có vị đắng hơi chua. Flavonoid đã được nghiên cứu về hiệu quả thúc đẩy quá trình oxy hoá các chất, dùng trong các trường hợp chuyển hoá cơ bản giảm. Các gốc tự do như superoxide (O2-), hydroxyl (OH-), hydoperoxy (H2O2), lipidperoxide, có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế vi khuẩn, có khả năng chống viêm, chống dị ứng, chống virus, chống ung thư,…ngoài ra các gốc oxygen này cũng có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể. Ngoài 2 hoạt chất kể trên thì trong thực vật còn rất nhiều hoạt chất khác như acid hữu cơ, acid béo chưa bão hoà, anthraquinon, glycoside, saponin, tinh dầu,…cũng có tác dụng trong công tác phòng và trị bệnh ở người và động vật. 2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản. Trong thiên nhiên, cây cỏ rất nhiều chủng loại nhưng số loài cây có hoạt chất sinh học chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ so với tổng số các loài cây. Chúng đã và đang được sử dụng rộng rãi trong các ngành dược phẩm, hương liệu và mỹ phẩm. Trong nuôi trồng thủy sản, các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được quan tâm để thay thế các hoá chất khử trùng, diệt mầm bệnh, diệt tạp độc hại và các thuốc kháng sinh chữa bệnh cho thủy sản nuôi trồng. Trên cơ sở thử kháng sinh đồ của các cây thuốc, Hà Ký và cộng tác viên (1995) đã phối chế thành thuốc KN - 04 - 12 mà thành phần chủ yếu là các cây thuốc và vitamin với tỷ lệ rất thấp từ 0,1 – 0,5 % tổng khối lượng của chế phẩm thuốc và các phụ gia. Thuốc KN - 04 - 12 đã và đang được sử dụng trộn vào thức ăn cho cá ăn, định kỳ 1,5 - 2 tháng 1 lần cho ăn với liều lượng 0,2 kg thuốc cho 100 kg cá ăn trong 1 ngày, và cho ăn liên tục 3 ngày để phòng trị bệnh đốm đỏ lở loét cho cá trắm cỏ nuôi lồng. Tỷ lệ cá bệnh tại Hà Nội, Tuyên Quang, Hà Bắc, … năm 1993 là 29 %, năm 1994 là 50 %, tỷ lệ cá không bị nhiễm trong phòng bệnh là 90 %. Bùi Quang Tề (1985) đã nghiên cứu dùng hạt cau trị giun tròn ký sinh trong ruột cá trê (Spiritectus clariasi), liều dùng 4 gam hạt cau/kg cá/ngày, ăn liên tục trong 3 ngày và trị bệnh sán dây (Bothriocephalus gowkongensis) ký sinh trong ruột cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus), liều dùng 1 gam hạt cau/1 gam thức ăn, cho ăn liên tục trong 7 ngày. Theo thông tin khoa học công nghệ và kinh tế thuỷ sản (2003) thì vi khuẩn Vibrio harveyi và Vibrio alginolyticus là hai tác nhân gây bệnh ở tôm sú đều được kiểm soát một cách hiệu quả bằng cách sử dụng MSMS. Chiết xuất methanol chứa chất chuyển hoá thứ cấp ở biển (MSMS) từ cải biển (Ulva fasciata) và bọt biển (Dendrilla nigra) đều tỏ ra hoạt động có hiệu quả trong việc kháng khuẩn. Thử nghiệm với liều 1000mg/kg thức ăn chứa U.fasciata và / hoặc 500mg/kg thức ăn chứa Dnigra được xem là hiệu quả nhất. Phan Xuân Thanh và cộng tác viên (2002) đã chọn một số loại cây có hoạt chất chính là 2 - hydroxy 6 – pentadeca - trienylbenzoat để làm nguyên liệu sản xuất ra một số loại thuốc phòng trị bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra như bệnh phát sáng, bệnh đóng rong, bệnh mang đen, bệnh mang vàng, bệnh đốm đỏ, bệnh mòn đuôi và hoại tử phụ bộ trên tôm sú, … Liều dùng trong phòng bệnh, cứ 15 ngày xử lý thuốc 1 lần với nồng độ 0,5 – 1 ppm. Liều dùng trong trị bệnh ở nồng độ 1 – 3 ppm, sau 3 – 5 ngày lặp lại lần 2. Theo S. Direkbusarakom, L. Ruangpan, Y. Ezura và M. Yoshimizu (1998), dịch chiết từ lá cây Clinacanthus nutans trộn với thức ăn viên theo liều lượng 1 g/kg thức ăn có khả năng ức chế hoạt động virus gây ra bệnh đầu vàng (Yellow - Head Rhabdovirus) trên tôm sú (P. monodon). Hiệu quả bảo vệ tôm sú khỏi virus này trong điều kiện thí nghiệm là 57,6 %. Đây là một trong số rất nhiều công trình nghiên cứu dùng các hợp chất thảo dược để hạn chế một số bệnh gây chết hàng loạt cho đối tượng nuôi thuỷ sản. Từ đó cho thấy việc tập trung nghiên cứu và ứng dụng các loại dịch chiết từ thảo dược vào thực tiễn sản xuất và một hướng đi đúng và đầy triển vọng. PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện. Thời gian thực tập: từ tháng 3 - 8 / 2005 Địa điểm: - Bộ môn Dược lý – Trung tâm Quốc gia Quan trắc và Cảnh báo Môi trường - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2. - Trại Thực nghiệm Thuỷ sản Thủ Đức. 3.2 Vật liệu nghiên cứu. 3.2.1 Vật liệu sinh học. Mẫu tôm sú bị nhiễm virus đốm trắng đã được giữ lạnh ở nhiệt độ -20oC. Tôm sú khoẻ mạnh không bị nhiễm virus đốm trắng được thu từ các ao nuôi tôm tại Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh. Tôm có trọng lượng từ 8-12 g/con. 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất. 3.2.2.1 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm. - Máy khuếch đại gen, bồn điện di, máy ly tâm, bàn đọc UV (White/UV transillminator), pipetman các loại, tủ đông, tủ gia nhiệt, các loại cân, tube eppendorf, kéo, kẹp,… - Máy Realtime PCR, các bộ Kit Realtime,… - Các loại hóa chất thường dùng: Cồn 95% dùng cố định mẫu. Hóa chất dùng trong quy trình khuếch đại DNA virus như NAOH - SDS, dung dịch PCR, các primer… Hóa chất dùng trong phân tích mẫu nước như NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,… DMSO dùng làm dung môi hoà tan các hợp chất thử. Các hợp chất chiết xuất từ thảo dược: B, D2, M 3.2.2.2 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm ướt. - Bể kính bố trí thí nghiệm, máy sục khí, máy bơm nước, hệ thống lọc nước, các dụng cụ đo môi trường nước. - Hoá chất dùng khử trùng nước trước và sau khi bố trí thí nghiệm như chlorine, thuốc tím. 3.3 Phương pháp nghiên cứu. 3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus. Sử dụng mẫu tôm đã bị nhiễm virus đốm trắng WSSV, lấy phần mang hay chân bơi cho vào dung dịch TN 1X. Sau đó đồng nhất mẫu trong eppendorf bằng chày đã thanh trùng. Ly tâm lạnh hỗn hợp ở 4oC, tốc độ 13000 vòng/phút/10 phút để loại bỏ phần tử lớn. Dùng pipetman hút nhẹ dịch trong và cho vào eppendorf khác. Tiếp tục huyền phù eppendorf chứa phần tử lớn trong dung dịch TN1X lần 2 và làm tương tự các thao tác trên để thu tiếp dịch trong. Hỗn hợp dịch trong của 2 lần ly trích trên được lọc qua màng lọc virus có kích thước lỗ 0,45 µm, thu nhận chất lọc và bảo quản dịch virus ở -20oC. 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm Dịch chiết virus và hỗn hợp dịch virus và thuốc được cảm nhiễm trên tôm sú không nhiễm bệnh đã được nuôi thuần từ 7 – 10 ngày bằng cách tiêm 0,05 ml dịch chiết virus hoặc hỗn hợp dịch virus và thuốc vào đốt cơ bụng thứ 2 hay 3. 3.3.3 Phương pháp thu mẫu. Sau khi cảm nhiễm, theo dõi tôm dựa vào các dấu hiệu lâm sàng, tiến hành thu mẫu tôm bằng cách lấy phần mang cho vào cồn 95 % để cố định mẫu. 3.3.4 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính (Non – stop single tube semi – nested PCR). Dùng để kiểm tra sự hiện diện của virus gây hội chứng đốm trắng trong mẫu hỗn hợp sau khi trộn chung dịch virus và hợp chất thuốc. Phương pháp này không sử dụng dung dịch NaOH - SDS để ly trích DNA như thông thường. Ngoài ra các bước khác tiến hành như một phản ứng PCR bình thường. Sau khi chuẩn bị mẫu và chạy phản ứng PCR, tiến hành điện di trên gel Agarose và đọc kết quả, nhận biết sự hiện diện của WSSV nhờ so sánh kích thước của chúng với thang DNA chuẩn cùng với mẫu đối chứng dương và âm. 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng (Realtime PCR). Cũng như PCR định tính, phương pháp PCR định lượng dựa trên sự khuếch đại một đoạn DNA đặc hiệu của bộ gen virus WSSV. Tuy nhiên khác với phương pháp PCR định tính sản phẩm sau khi khuếch đại phải đem điện di và đọc kết quả trên bàn đọc UV, sản phẩm khuếch đại trong phương pháp PCR định lượng được đánh dấu bằng probe (mẫu dò) được thiết kế gắn chất phát huỳnh quang (FAM) ở đầu 5’ và chất hấp thu huỳnh quang (ở đầu 3’). Trong khi chạy PCR, đầu đọc iQ Realtime sẽ phát hiện các sản phẩm khuếch đại đặc hiệu bằng cách nhận biết và thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra ở bước 60o trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ hoạt tính 5’ - 3’exonuclease của Taq polymerase tách đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang của probe ra khỏi khuôn mẫu, lúc này FAM ở dạng tự do sẽ phát quang và được thu nhận và xử lý. Nếu probe không gắn được vào khuôn hoặc hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease không có thì chất phát huỳnh quang phát ra bao nhiêu sẽ bị hấp thu bấy nhiêu. Mẫu thử chứa nhiều DNA đích ban đầu sẽ có chu kỳ ngưỡng phát hiện sớm hơn là mẫu thử có ít DNA đích. Sau khi kết thúc chương trình, kết quả được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và biết được nồng độ virus ban đầu của mẫu thử dựa vào các nồng độ DNA chuẩn và chúng ta sẽ đo được nồng độ DNA trong các mẫu thử bằng đường biễu diễn chuẩn (Standard curve) hiển thị mối quan hệ giữa các chu kỳ ngưỡng với các nồng dộ DNA trong các mẫu chuẩn. 3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường. Đo nhiệt độ nước bằng nhiệt kế bách phân (100oC) và đo mỗi ngày 1 lần vào một giờ cố định. Độ mặn S (%) được xác định bằng khúc xạ kế vào lúc trước khi thả tôm và khi thêm hoặc thay nước. pH được đo bằng máy đo pH. Xác định độ tiêu hao Oxy hoá học (COD) trước khi bố trí thí nghiệm: Oxy hoá mẫu nước bằng Permanganat Kali, sau đó tiến hành chuẩn độ bằng Thiosulphate Natri sử dụng hồ tinh bột làm chất chỉ thị. Xác định Oxy hoà tan (DO) theo phương pháp chuẩn độ Winkler trước khi bố trí thí nghiệm. 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm. 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thí nghiệm được thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Các hợp chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau. Dịch chiết virus WSSV. Trộn lẫn dịch chiết virus và mỗi loại hợp chất thử đã được pha ở các nồng độ khác nhau. Ủ hỗn hợp dịch virus và hợp chất thử trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30oC. Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA. Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). 3.4.2 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ướt. Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết được khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau. Các lô thí nghiệm tiêm hỗn hợp dịch chiết virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau sau khi ủ 2 giờ. Lô đối chứng âm không tiêm virus WSSV Lô đối chứng dương tiêm dịch chiết virus WSSV Tôm sú khoẻ kích cỡ 8 – 12 g/con Theo dõi và ghi nhận hàng ngày về tình trạng sức khoẻ của tôm. Tiến hành thu mẫu những con chết (nếu có). Sau 14 ngày Thu toàn bộ mẫu kiểm tra lại bằng kỹ thuật Realtime PCR và đánh giá kết quả . Sơ đồ 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau. PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng. Hiệu quả trực tiếp của các hợp chất B, M, D2 đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) được thử nghiệm bằng cách cho 250 µl dịch chiết WSSV và 250 µl với mỗi hợp chất B, M, D2 ở các nồng độ khác nhau vào các eppendorf (1 ml) và ủ hỗn hợp trong 2 giờ ở nhiệt độ (28 - 30oC), sau đó kiểm tra sự tồn tại của virus trong hỗn hợp bằng kỹ thuật PCR định tính nhưng không dùng NaOH - SDS trong quá trình tách chiết DNA virus. Việc không sử dụng NaOH - SDS trong quá trình tách chiết DNA virus nhằm hạn chế hoá chất tác dụng lên virus, làm phơi trần DNA virus, như thế sẽ không đánh giá được tác dụng của các hợp chất lên virus WSSV. Sản phẩm PCR sau đó được đem điện di và chụp hình kết quả. 4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2. 1 2 3 4 5 6 7 M Hì