Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phầm PCR

KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẦM PCR TÓM TẮT Đặt vấn đề: Xét nghiệm HCV genotype là xét nghiệm mà các bác sĩ lâm sàng cần xác định trước khi bắt đầu điều trị bệnh nhân nhiễm HCV để có thể quyết định thời gian điều trị. Có nhiều phương pháp để xác định genotype HCV, tuy nhiên tiêu chuẩn nhất và hữu dụng lâm sàng nhất vẫn là giải trình tự vùng 5’-NC. Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện xét nghiệm giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA trên vùng 5’-NC của HCV, phân tích các kết quả và rút ra các kinh nghiệm chủ yếu. Vật liệu và phương pháp: Các mẫu huyết thanh sau khi thu thập sẽ được tách chiết RNA cùng với RNA chứng nội tại được cho vào mẫu và tổng hợp thành cDNA từ dịch ly trích này. Thực hiện phản ứng real-time PCR dùng mồi và các đoạn dò Taqman đặc hiệu định lượng HCV có trong mẫu ban đầu. Tiến hành giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại này, so sánh với ngân hàng gene để định các subtype của HCV. Phân tích các kết quả và rút các kinh nghiệm chủ yếu. Kết quả: Từ tháng 1/2007 đến tháng 5/2008, tác giả đã áp dụng kỹ thuật này để định kiểu gene HCV cho 2000 trường hợp với kết quả ghi nhận được: 58% thuộc subtype 1b, 8% thuộc subtype 1a, 5% thuộc subtype 1c, 10% thuộc subtype 2a, 0,4% thuộc subtype 2b và 17% thuộc subtype 6a. Kết luận: Từ kết quả trên chúng ta nhận thấy các bệnh nhân nhiễm HCV ở Việt Nam hầu hết đều tập trung vào subtype 1b và 6a. Trong nghiên cứu này, tác giả đã đưa ra được kỹ thuật tốt nhất để vừa định lượng, vừa định type trên cùng một sản phẩm khuếch đại có chứa hỗn hợp DNA đích và DNA chứng nội tại, đồng thời chứa cả hệ thống chống ngoại nhiễm mà không làm ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng của xét nghiệm. Một ưu điểm nữa của phương pháp giải trình tự là có thể cho kết quả phân biệt được từng loại subtype trong khi các phương pháp khác sẽ có một tỉ lệ không cho subtype hay thậm chí không phân biệt được subtype. ABSTRACT APPLY THE DIRECT SEQUENCING OF THE QPCR PRODUCTS TO DO THE HCV GENOTYPING. Nguyen Thanh Bao, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 13 - Supplement of No 1 - 2009: 243 - 248 Background: HCV genotyping is one of the testing that the physicians need to indicate before dicide the specific treatment on the HCV infected patients. There are many methods for HCV genotyping, however, the most effective and sensitive is the direct sequencing of the PCR product specific the 5’-NC of the virus. Objective: Set up the techniques for genotyping of HCV by direct sequencing the qPCR product specific to 5’-NC of viral genome, and carry out the analysis of the results and the outcome experiences. Materials and methods: The collected patients sera were added with the RNA- internal control and then were extracted the total RNA which were carried out the cDNA synthesis. The qPCR using specific primers and taqman probes were done to quantify the RNA-HCV copies in the samples. The qPCR products were sequenced and the collected sequences were aligned to the library of HCV genotype sequences to get the results of HCV genotyping. Results: From 1/2007 to 5/2008, authors applied these techniques on 2000 samples and the analysed results revealed that: 58% were belong to subtype 1b, 8% belong to subtype 1a, 5% belong to subtype 1c, 10% belong to subtype 2a, 0.4% belong to subtype 2b and 17% belong to subtype 6a. Conclusions: The received results demonstrated that most of the HCV infected patients in Viet Nam are infected with genotype 1b and 6a. In this study, the authors have proved that this testing will not only do the quantity but also do the genotyping of the HCV by direct sequencing of the qPCR products which contain the target sequence DNA. Another advantage of this testing is the internal control products and build-in contamination system did not influence to the sequencing results. Besides that, sequencing always results the subtype while other methods will give a low ratio or even can not differentiate the subtype of HCV. ĐẶT VẤN ĐỀ Trước khi chỉ định điều trị đặc hiệu, xét nghiệm định lượng và định kiểu gene virus viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm là một xét nghiệm tối cần thiết mà bác sĩ phải chỉ định cho bệnh nhân(Error! Reference source not found.). Phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)(Error! Reference source not found.) và phương pháp giải trình tự với hệ thống giải trình tự kín của Trugene(Error! Reference source not found.) là hai phương pháp được nhiều nhà lâm sàng chấp nhận để xác định kiểu gene HCV dùng trong chẩn đoán. Tuy nhiên, do giá thành khá cao nên xét nghiệm xác định kiểu gene HCV chưa được chỉ định rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu hành HCV là khá cao trên thế giới (5 - 8% người bình thường có nhiễm HCV)(Error! Reference source not found.) và dĩ nhiên nguy cơ dẫn đến một tỷ lệ khá cao bị xơ gan và ung thư gan (4%)(Error! Reference source not found.). Trong các nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã xây dựng thành công kỹ thuật xác định kiểu gene HCV bằng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR định lượng nhắm vào vùng 5’-NC. Nghiên cứu lần này nhắm đến mục đích phân tích kết quả và đúc kết các kinh nghiệm của việc triển khai xét nghiệm này trên 2000 mẫu định kiểu gene HCV được thực hiện vừa qua. VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đây là nghiên cứu tiền cứu cắt ngang với đối tượng là các mẫu huyết thanh được đã xác định dương tính HCV qua xét nghiệm HCV-RNA (+). Các mẫu này được nhiều phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí nghiệm NK- Biotek với yêu cầu định lượng và định kiểu gene HCV. Để phát hiện và định lượng được HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử dụng bộ thử nghiệm RT TQ real- time PCR (reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman probe) do công ty Nam Khoa sản xuất theo các thuốc thử và qui trình đã được chúng tôi nêu trong các nghiên cứu trước(Error! Reference source not found.). Thử nghiệm real-time PCR được thực hiện trên máy IQ5 của Biorad. Sản phẩm real-time PCR cho kết quả real-time PCR (+) được làm tinh sạch để thu nhận sản phẩm PCR với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR (PCR clean-up kit) do Promega sản xuất (Cat. #A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được điện di và định lượng nồng độ DNA bằng máy Gentquant của Pharmacia và sau này được chúng tôi định lượng bằng điện di trên chíp điện di và thiết bị điện di chip bio-analyzer của Agilent. Sau đó, thực hiện phản ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch bằng kit và thiết bị CEQ8000 của Becman Coulter và sau này chúng tôi còn thực hiện thêm trên kit và thiết bị ABI 3130XL. Kết quả giải trình tự được lên NCBI blast qua internet để so sánh với gene bank và lên local blast của phần mềm miễn phí bio-edit để so sánh với thư viện HCV genotype mà chúng tôi tự tạo để có được kết quả genotype. KẾT QUẢ Trong thời gian từ 17/01/07 đến 17/07/08, có tất cả 2000 mẫu huyết thanh dương tính HCV-RNA được làm xét nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu 5’-NC theo qui trình trên. Tất cả 2000 mẫu HCV-RNA dương tính này cũng đã được chúng tôi đồng thời xác định genotype của HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của qui trình qPCR trên. Kết quả định lượng tương ứng với kết quả xác định genotype của 234 mẫu trong 2000 mẫu được chúng tôi phân tích và trình bày trong bảng 1 cho thấy 100% các mẫu cho kết quả phát hiện và định lượng dương tính HCV-RNA đều cho được kết quả định được genotype HCV dù kết quả định lượng có thấp đến mức tối thiểu (là 445 copies/ml huyết thanh trong nghiên cứu này). Kết quả này cho phép nhận định là phương pháp định genotype HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của phản ứng real-time PCR dùng taqman probe mà chúng tôi áp dụng đạt được độ nhạy phát hiện tương đương độ nhạy phát hiện của RT TQ real-time PCR. Bảng 1: Kết quả định genotype so với kết quả định lượng Kết quả định lượng copies/ml Số mẫu Genotype(số mẫu) 100 – 999 1* 1b(1) 1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1) 10.000 – 99.999 57 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11) 100.000 – 999.999 123 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30) 1.000.000 – 9.999.999 37 1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4) 10.000.000 – 99.999.999 2** 1(1), 1b(1) Tổng cộng 234 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2), 2a/2c(2), 6a(46) * Mẫu có kết quả định lượng thấp nhất là 445copies/ml huyết thanh. **mẫu cao nhất có kết quả định lượng là 13.792.596 copies/ml. Biểu đồ 1 dưới đây trình bày tỷ lệ phần trăm các genotype HCV của 2000 mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết quả cho thấy có đến 1.156 (57,8%) các mẫu là thuộc genotype 1b, 348 (17,4%) thuộc genotype 6a, 198 (9,9%) genotype 2a, 156 (7,8%) genotype 1a, 108 (5,4%) genotype 1c, 24 (1,2%) genotype 6b, 8 (0,4%) genotype 2b. Trong kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, kết quả chỉ có thể tốt khi có sản phẩm PCR thuần nhất, không bị các sản phẩm phụ. Các kết quả điện di của sản phẩm PCR sau khi tinh sạch rất là rõ nét, dù nồng độ HCV trong một số mẫu là khá thấp. Điều này chứng tỏ qui trình RT real-time PCR phát hiện và định lượng HCV-RNA mà chúng tôi đang áp dụng là tối ưu và hoàn chỉnh. Đa số các trường hợp các trình tự giải được có chiều dài phù hợp với chiều dài mà chúng tôi dự đoán, là từ 190bp đến < 200bp. BÀN LUẬN Định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên vạch của Bayer đều dựa trên một đoạn nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’- NC. Đây là cả hai phương pháp được FDA và y học chấp nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng. Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều trường hợp không thể phân biệt được các subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không cần thiết phải có thiết bị giải trình tự vốn được xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt kỹ thuật, do vậy InoLIPA có thể triển khai thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí nghiệm lâm sàng nào có trang bị phương tiện cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA phải thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả năng bị ngoại nhiễm là khá cao và đây chính là lí do giải thích được tại sao có khá nhiều trường hợp InoLIPA có kết quả không thể xác định được genotype(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.). Để có thể khắc phục được nhược điểm này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công một qui trình thực hiện RT-PCR với PCR mix cực kỳ nhạy cảm chỉ cần dùng mồi vòng trong của HCV-InoLIPA và có thêm khả năng chống được ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại nhờ có chứa dUTP và UNG; và chính nhờ cải tiến quan trọng, HCV-InoLIPA có khả năng áp dụng được rộng rãi tại Việt Nam(Error! Reference source not found.). Tuy vậy khả năng triển khai sử dụng HCV-InoLIPA tại Việt Nam cũng còn khá xa vời vì giá thành hãy còn khá cao (#100USD/mẫu) so với điều kiện kinh tế của nhiều bệnh nhân cũng như khả năng tài chính của các bệnh viện hiện nay. Về phương pháp giải trình tự của Trugene, các nhà sản xuất khuyến cáo nên thực hiện trên sản phẩm PCR của Roche Amplicor, và đây chính là một trở ngại khá lớn vì giá thành của Roche Amplicor dành cho HCV rất đắt (trên 120 USD/mẫu thử). Ngoài giá thành của Roche Amplicor, các vật liệu tiêu hao khác đi kèm với thử nghiệm giải trình tự cũng phải đến trên 60 USD nữa, do vậy giá thành của một thử nghiệm genotype HCV bằng giải trình tự của Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới 180 USD. Trong thời gian qua, chúng tôi đã nghiên cứu thành công một bộ thử nghiệm RT-PCR với PCR mix dùng cặp mồi hoàn toàn tương thích với hệ thống Trugene nhờ vậy mà phòng thí nghiệm không nhất thiết phải sử dụng Roche Amplicor làm RT- PCR(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.). Chính nhờ áp dụng thành công này mà hiện nay giá xét nghiệm HCV genotype tại trung tâm Medic chỉ còn không qua 120 USD/một mẫu thử. Tuy vậy, giá thành này cũng hãy còn khá cao để có thể được chỉ định rộng rãi cho các bệnh nhân. Ngoài ra, Trugene là một hệ thống hoàn toàn kín, chỉ được dùng để đáp ứng yêu cầu định genotype HCV của lâm sàng do vậy kết quả chỉ có thể hiển thị được trên màn hình và in ra giấy, do vậy nhà nghiên cứu không thể có được kết quả trên một tập tin vi tính để có thể làm blast search hay nghiên cứu phylogenetic. Thư viện HCV là một thư viện được xây dựng sẵn và người dùng có thể cập nhật thêm các kết quả của mình (thực hiện trên chính máy giải trình tự của Trugene) vào thư viện này, nhưng không thể lấy thư viện này ra bên ngoài cũng như không thể đăng nhập được một trình tự có được từ các máy giải trình tự khác để search trên thư viện này. Đây chính là một bất tiện đặc biệt cho các nhà nghiên cứu khi muốn nghiên cứu sâu thêm về HCV genotype trên các kết quả có được từ các nguồn khác nhau. Phương pháp giải trình tự để định genotype HCV do chúng tôi phát triển và trình bày trong công trình nghiên cứu này được thực hiện trên một trình tự dài không quá 200bp của một sản phẩm PCR dài khoảng 240-250bp, kết quả từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu một đoạn đích tương tự của Trugene và InoLIPA trên vùng 5’-NC. Chính điều này đảm bảo tính chính xác của kết quả định genotype HCV do chúng tôi phát triển không khác gì kết quả định genotype bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene vì đoạn trình tự đích của phương pháp của chúng tôi và đoạn trình tự đích của phương pháp Trugen gần như phù hợp nhau hoàn toàn. Sở dĩ chúng tôi nghiên cứu thành công được công trình này là nhờ chúng tôi có được các thành công trong nghiên cứu thiết kế được mồi để chế tạo bộ thử nghiệm RT-PCR phát hiện HCV tương thích cho thử nghiệm định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.). Ngoài ra, việc nghiên cứu thành công bộ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe để phát hiện và định lượng HCV-RNA trên một đoạn đích đến 240-250bp mà chúng tôi đã nghiên cứu và áp dụng tại khá nhiều phòng thí nghiệm tại Việt Nam(Error! Reference source not found.) là một bước đi đột phá (phá vở qui luật là real-time PCR dùng taqman probe chỉ cho kết quả tối ưu khi sản phẩm khuếch đại không quá 150bp, chứng minh qua các kết quả trình bày trong biểu đồ 2-A) và chính nhờ vậy đã góp nên một yếu tố rất quan trọng để giảm được giá thành của xét nghiệm định genotype bằng kỹ thuật giải trình tự này vì không cần thiết phải thực hiện một RT- PCR để có sản phẩm PCR dành riêng cho giải trình tự. Giá thành định genotype HCV bao gồm cả định lượng HCV-RNA hiện nay của chúng tôi có khả năng sẽ không quá 50 USD/mẫu. Kết quả của công trình nghiên cứu cho thấy đa số các mẫu huyết thanh được gửi đến xét nghiệm định lượng HCV-RNA là thuộc genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% còn lại phân phối vào các genotype khác như genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype 2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b (1%), genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b (<1%). Chúng tôi không cho rằng tỷ lệ này phản ánh thật sự đúng tần số lưu hành các genotype HCV trong các người nhiễm HCV tại Việt Nam mà chỉ nói lên được tần số genotype trong các bệnh nhân sắp, đang và đã điều trị đặc hiệu bệnh viêm gan mạn tính do HCV. Chính trên đối tượng nghiên cứu này nên chúng ta thấy tỷ lệ genotype 1b (là genotype đáp ứng kém với điều trị đặc hiệu) là đến 55% với đa số có giá trị định lượng HCV-RNA khá cao (từ 100.000 đến 10.000.000 copies/ml). Có một số nhà nghiên cứu cho là nếu định genotype bằng giải trình tự vùng 5’-NC sẽ không cho kết quả chính xác mà phải giải trình tự vùng NS5B trên bộ gen của HCV. Sở dĩ các nhà nghiên cứu này quan niệm như vậy vì đã có một số y văn trên thế giới chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ có thể phân biệt được các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’-NC(Error! Reference source not found.), cũng như là phân biệt được type 6 với subtype 1b(Error! Reference source not found.) hay 1a và 1b chính xác hơn(3). Tuy nhiên các nghiên cứu như vậy hãy còn khá ít, và kết quả chính xác hay không lại còn tùy thuộc vào thư viện gen mà chúng ta dùng để phân tích trình tự giải được(Error! Reference source not found.). Ngoài ra, dù hiện nay đã có nhiều cải thiện trong thử nghiệm RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng NS5B, nhưng hãy còn kém nhạy cảm xa so với thử nghiệm trên vùng 5’-NC, do vậy quan niệm được nhiều người thừa nhận nhất hiện nay là: định genotype dựa trên giải trình tự vùng 5’-NC vẫn là thích hợp và hữu dụng nhất cho lâm sàng vì độ nhạy cảm cao, còn vùng NS5B chỉ nên dùng cho các nghiên cứu dịch tễ học về sự phân bố các genotype HCV vì khả năng phân biệt các subtype cao(Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.,Error! Reference source not found.). KẾT LUẬN Bằng phương pháp giải trình tự một đoạn DNA đích dài dưới 200bp của sản phẩm PCR kết quả từ thử nghiệm RT-PCR dùng mồi và Taqman probe đặc hiệu vùng 5’-NC, chúng tôi đã định được genotype của HCV trong huyết thanh của bệnh nhân bị viêm gan mạn tính do nhiễm HCV. Nghiên cứu này đã mở ra được một khả năng ứng dụng rộng rãi không chỉ nhờ giá thành xét nghiệm thấp giúp cho các bác sĩ điều trị không ngần ngại khi cho chỉ định xét nghiệm cho bệnh nhân, mà còn có thể triển khai được tại nhiều phòng thí nghiệm hiện đang có máy giải trình tự mà vẫn ít hay chưa có hướng ứng dụng trong y học như thực tế hiện nay chúng ta vẫn thường gặp.