MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN . i
TÓM TẮT . ii
ABSTRACT . iv
LỜI CAM ĐOAN KẾT QUẢ . vi
MỤC LỤC . vii
DANH SÁCH BẢNG . xi
DANH SÁCH HÌNH . xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . xvii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu . 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát . 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể . 3
1.3. Nội dung nghiên cứu . 3
1.4. Ý nghĩa nghiên cứu . 3
1.5. Tính mới của luận án . 4
1.6. Thời gian thực hiện: . 4
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 5
2.1. Khái quát về hiện trạng nuôi tôm nước lợ . 5
2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới . 5
2.1.2. Tình hình dịch bệnh tôm nuôi trên thế giới . 6
2.2. Tình hình và dịch bệnh trên tôm nuôi nược lợ tại Việt Nam . 8
2.2.1. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam . 8
2.2.2. Tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi ở Việt Nam . 9
2.3. Một số bệnh đường ruột thường gặp trên tôm nước lợ . 11
2.3.1. Bệnh trùng 2 tế bào Gregarinosis . 11
2.3.2. Vermiform trong hệ tiêu hóa tôm . 14
viii
2.3.3. Bệnh chậm lớn do Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) . 17
2.4. Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) . 24
2.5. Hội chứng phân trắng (WFS) . 34
2.6. Đặc điểm của một số loài thảo dược có tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản . 38
2.6.1. Ổi (Psidium guajava L.) . 38
2.6.2. Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaraia) . 38
2.6.3. Rau mui: Wedelia biflora (L.) DC. . 41
2.7. Nghiên cứu sử dụng thảo dược phòng trị bệnh ở động vật thủy sản . 41
211 trang |
Chia sẻ: minhanh6 | Ngày: 13/05/2023 | Lượt xem: 1418 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Đặc điểm bệnh học của mầm bệnh vibrio spp. và vi bào tử trùng hiện diện trong đường ruột của tôm nước lợ, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
y sự sai khác giữa các nhóm vi khuẩn A1, A3, B1, B2 khi so sánh
với các chủng vi khuẩn chuẩn lần lượt bao gồm V. parahaemolyticus 428, V. vulnificus
509, V. cholerae non-01 và V. alginolyticus 552 (Buller, 2004), riêng đối với các chủng
vi khuẩn thuộc nhóm A2 ghi nhận thấy có sự sai khác ở chỉ tiêu arginine và gelatine,
các chỉ tiêu còn lại gần giống với chủng V. haveyii 581. Đối với các chỉ tiêu thuộc nhóm
phản ứng lên men các loại đường cho thấy, nhóm glucose, mannose, inositol, sorbitol,
rhamnose đều cho kết quả giống nhau giữa các chủng kiểm tra và các chủng chuẩn. Chỉ
tiêu sinh hoá lên men các loại đường còn lại có sự khác biệt tuỳ loài.
A
B
C
D
E
78
Nhìn chung, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý hoá cơ bản cho thấy các chủng vi
khuẩn phân lập được đều có độ tương ứng cao khi so sánh với các chủng mẫu được nêu
trong nghiên cứu về vi khuẩn lây nhiễm trên động vật thuỷ sản của Buller (2004). Sự
sai khác ở một số chỉ tiêu có thể được giải thích do sự khác biệt về địa lý hoặc vật chủ
lây nhiễm của chủng vi khuẩn đó. Vì vậy, để xác định được chính xác đến loài của các
chủng vi khuẩn Vibrio spp. phân lập và tăng độ tin cậy. Nghiên cứu sử dụng phương
pháp giải trình tự gene 16s rRNA để kiểm tra khẳng định loài của các chủng vi khuẩn.
4.5.2. Định danh thông qua kỹ thuật sinh học phân tử PCR
4.5.2.1. Kết quả ly trích đoạn gen 16S rRNA
Sau khi kiểm tra các chỉ tiêu sinh hoá cơ bản và định danh sơ bộ bằng kit API 20E,
24 chủng vi khuẩn được tiến hành ly trích DNA nhằm định danh đến loài bằng phương
pháp giải trình tự gen 16s rRNA. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch, ủ ở
28℃, sau 24 giờ, chọn khuẩn lạc thuần và tiến hành tách chiết DNA, thực hiện phản
ứng PCR với cặp mồi 27F-1492R, khuếch đại vùng 16S rRNA của vi khuẩn. Sản phẩm
PCR có kích thước 1500 bp.
Trong nghiên cứu này, 24 chủng vi khuẩn (STT 1-24) đều được nhận diện bởi đoạn
gen 16S rRNA và cho kết quả tốt, các băng xuất hiện trên phổ điện di rõ, đồng nhất và
không có sản phẩm phụ, kích thước sản phẩm khuếch đại là 1500 bp (Hình 4.21). Từ
kết quả PCR, tất cả các dòng vi khuẩn được giải trình tự gen 16S rRNA.
Hình 4.21. Sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA của các chủng vi khuẩn trên gel
agarose 1,5%. M: thang 100 bp; (+): mẫu đối chứng dương; (-) mẫu đối chứng âm; giếng 1-24
mẫu vi khuẩn nghiên cứu
Theo Vaerewijck et al., (2001) vi khuẩn được định danh thông qua các phản ứng
sinh hóa tương đối chính xác. Tuy nhiên, các qui trình kỹ thuật này khá phức tạp và tốn
79
kém, hơn nữa, một số loài vi khuẩn thường không được ghi nhận đầy đủ các đặc điểm
sinh hóa khiến cho việc nhận diện chính xác trở nên khó khăn hơn (Khamis et al., 2003).
Cho đến nay, với sự phát triển của kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 16S rRNA đã giúp
việc định danh ngày càng đơn giản hóa và một cách đặc hiệu (Wang et al., 2003; Wu et
al., 2006).
4.5.2.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của các dòng vi khuẩn
Các mẫu được tiến hành giải trình tự gene và sử dụng phần mềm Blast Nucleotic
để so sánh với trình tự DNA của các dòng vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI.
Kết quả giải trình tự được thể hiện trong Bảng 4.4. Kết quả so sánh trình tự của các
chủng vi khuẩn (1-24) với trình tự đoạn gene 16S rRNA có độ tương đồng 94-99% trên
cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI cho thấy, có 08 chủng vi khuẩn (17-24) tương đồng
với trình tự vi khuẩn V. alginolyticus; có 07 chủng vi khuẩn (10-16) tương đồng với
trình tự vi khuẩn V. cholerae; có 02 chủng vi khuẩn (4-5) tương đồng với trình tự vi
khuẩn V. harveyi; có 03 chủng vi khuẩn (1-3) tương đồng với trình tự vi khuẩn V.
parahaemolyticus; có 04 chủng vi khuẩn (6-9) tương đồng với trình tự vi khuẩn V.
vulnificus.
Thông qua kết quả giải trình tự gen 16s rRNA của các chủng vi khuẩn Vibrio spp.
phân lập trên tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu bệnh đường tiêu hoá cho thấy sự tương
đồng cao của các chủng Vibrio đối với các chủng chuẩn trên ngân hàng gen. Ngoài ra,
kết quả còn thể hiện sự giống nhau khi so sánh với định danh bằng phương pháp truyền
thống bằng các chỉ tiêu sinh lý hoá, tuy nhiên độ tin cậy của phương pháp định danh
bằng kỹ thuật sinh học phân tử sẽ cao hơn do sự đặc trưng trong bộ gen của mỗi loài.
Bảng 4.4. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA vi khuẩn Vibrio spp.
STT Mã vi khuẩn Loài vi khuẩn
Độ tương đồng
(%)
Ký hiệu Genbank
1 CM1HPB1 V. parahaemolyticus 98 NR_118928.1
2 CM3HPA1 V. parahaemolyticus 94 NR_119058.1
3 BTIA1 V. parahaemolyticus 99 NR_119058.1
4 CM2IA2 V. harveyi 98 NR_119054.1
5 CM3HPA2 V. harveyi 98 NR_119054.1
6 CM1IA4 V. vulnificus 98 NR_118570.1
7 CM2HPA4 V. vulnificus 99 NR_117906.1
8 CM3IA4 V. vulnificus 99 NR_117906.1
9 BTIA4 V. vulnificus 99 NR_119061.1
10 CM2IB1 V. cholerae 99 NR_119051.1
11 CM3HPB1 V. cholerae 99 NR_119051.1
12 STIB1 V. cholerae 98 NR_115936.1
13 STHPB1 V. cholerae 98 NR_119302.1
14 STIB1.1 V. cholerae 99 NR_119051.1
15 BTIB1 V. cholerae 98 NR_119302.1
16 BTIB1.1 V. cholerae 99 NR_119302.1
17 CM3HPB2 V. alginolyticus 99 NR_113781.1
80
18 CM3IB2 V. alginolyticus 98 NR_122059.1
19 CM3IB2.1 V. alginolyticus 98 NR_121709.1
20 CM3HPB2.1 V. alginolyticus 99 NR_113781.1
21 CM3IC1 V. alginolyticus 98 NR_122050.1
22 CM2IB2 V. alginolyticus 99 NR_122060.1
23 CM2HPB2 V. alginolyticus 99 NR_118258.1
24 STIB2 V. alginolyticus 99 NR_118258.1
4.6. Kết quả nhận diện gen độc lực của các chủng vi khuẩn Vibrio spp.
Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen độc lực cho thấy V. parahaemolyticus BTIA1
có mang 3 gen PirBVP, toxR và toxRS. Kế tiếp, V. cholerae CM3HPB1 có mang gen
PirBVP, tlh và không có sự xuất hiện của gen toxR và toxRS. Ngược lại, chủng vi khuẩn
V. vulnificus CM2HPA4 có mang của gen toxR, toxRS nhưng không mang gen PirBVP và
tlh. Chủng vi khuẩn V. alginolyticus CM3IC1 chỉ ghi nhận mang gen toxRS (Bảng 4.5)
Bảng 4.5. Sự hiện diện của các gen độc lực trong các chủng Vibrio spp. gây bệnh
TT Chủng vi khuẩn PirBVP tlh toxR toxRS
1 V. alginolyticus CM3IC1 - - - +
2 V. cholerae CM3HPB1 + + - -
3 V. vulnificus CM2HPA4 - - + +
4 V. parahaemolyticus BTIA1 + - + +
Ghi chú: (+): biểu hiện độc lực; (-): không biểu hiện độc lực.
Theo nghiên cứu của Quảng và ctv. (2020) thì 100% các chủng V.
parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bị bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tại tỉnh
Thừa Thiên Huế có chứa gen PirBVP và 50% đã được ghi nhận có mang gen toxR.
Trong khi đó, gen tlh và toxR được ghi nhận hiện diện 100% ở các chủng V.
parahaemolyticus phân lập từ tôm bệnh AHPND. Kết quả giải trình tự gen của 4 chủng
vi khuẩn cũng cho thấy độc lực khác nhau ở các gen.
Gen toxR: Kết quả khuếch đại trình tự của các chủng vi khuẩn Vibrio spp cho thấy
có hai trong bốn gen đều xuất hiện vạch DNA ở kích thước 367 bp (Hình 4.22). Kết quả
này phù hợp với nghiên cứu cuả Quảng và ctv., (2020) khi xác định các gen độc tố của
các chủng Vibrio gây bệnh được 7/14 mẫu nghiên cứu, phân lập chứa vùng gen toxR.
Gen toxRS: Có 3 trong 4 chủng vi khuẩn Vibrio spp phân tích dương tính với đoạn
trình tự gen ToxRS. Kết quả khuếch đại trình tự DNA cho thấy kích thước băng đạt
khoảng 1347 bp của đoạn gen toxRS (Hình 4.23). Kết qủa này cũng tương đồng với kết
quả nghiên cứu xác định các gen độc tố của các chủng Vibrio gây bệnh của Supansa
Bunpa et al., (2017).
Gen tlh: Chỉ có chủng V. cholerae CM3HPB1 dương tính với đoạn trình tự gen tlh
xuất hiện vạch DNA ở kích thước trên 450 bp (Hình 4.22). Kết qủa có sự khác biệt so
với nghiên cứu của Mustapha et al., (2013), cụ thể các mẫu có phản ứng tại vị trí là số
81
(3) ba mẫu còn lại tại vị trí 1, 2, 4 không có băng màu xuất hiện điều này có thể giải
thích do thực khuẩn thể kích hoạt gen gây độc tố của dòng vi khuẩn Vibrio spp.
Hình 4.22. Sản phẩm PCR các gen độc tố của Vibrio spp. M (Ladder 100bp)
1: V. vulnificus CM2HPA4, 2: V. alginolyticus CM3IC1, 3: V. cholerae CM3HPB1,
4: V. parahaemolyticus BTIA1
Gen PirBVP: Tương tự với các gen mục tiêu toxR, toxRS, tlh. Gen độc lực primer B
có kết quả khuếch đại trình tự chuỗi mục tiêu 392 bp của đoạn gen tdh ở dòng vi khuẩn
Vibrio spp cho thấy trong bốn chủng phân tích có hai chủng có sự xuất hiện vạch DNA
ở kích thước trên 392 bp (Hình 4.23). Kết qủa phù hợp với nghiên cứu của Quảng và
ctv. (2020), tác giả cho rằng primerB và các gen toxR, toxRS, tdh đều có khả năng nhận
diện độc lực của các vi khuẩn Vibrio.
Hình 4.23. Sản phẩm PCR các gen độc tố của Vibrio spp. M (Ladder 1kb)
1: V. vulnificus CM2HPA4, 2: V. alginolyticus CM3IC1, 3: V. cholerae CM3HPB1,
4: V. parahaemolyticus BTIA1
Kết quả cho thấy V. parahaemolyticus có chứa hầu hết các gen gây độc ngoại trừ
gen tlh, tương đồng với nghiên cứu của Fri et al., (2017), chỉ ra rằng hầu hết loài
V. parahemolyticus (97,0%; 32/33) âm tính với gen tlh. Theo nghiên cứu của
Asgarpoorv et al., (2018), trong số 70 mẫu tôm trong nghiên cứu chỉ có 2 (2,8%) dòng
Vibrio mang gen tlh. Theo nghiên cứu của Lopatek et al., (2018), gen tlh chỉ được xác
định ở 3 trong số 104 (2,9%) V. parahaemolyticus phân lập được phân tích. Từ sản phẩm
Primer toxR Primer tlh
1 2 3 4 M M 1 2 3 4
367bp
450bp
1 2 3 4 M M 1 2 3 4
Primer pirBvp Primer toxRS
1347bp
392bp
b
82
PCR cho thấy V. parahaemolyticus biểu hiện gen toxR với kích thước băng điện di
khoảng 367 bp tương đồng với Cầm và ctv., (2020), nghiên cứu về tính kháng kháng
sinh của 30 dòng V. parahaemolyticus cho thấy tất cả các mẫu định danh đều có sự hiện
diện của gen toxR. Trong nghiên cứu của Asgarpoorv et al., (2018) thì gen toxR xuất
hiện ở 12/70 mẫu tôm được phân tích. Vibrio parahaemolyticus mang gen độc tố PirBVP
là một trong những tác nhân gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tính (AHPND) (Aranguren,
2020). Sản phẩm PCR cặp mồi PirBVP xuất hiện băng điện di khoảng 392bp phù hợp
với công bố của Quảng (2020).
Ở chủng vi khuẩn V. alginolyticus chỉ biểu hiện độc lực toxRS, một loại gen có khả
năng sản xuất hemolysin, điều này khác biệt so với nghiên cứu của Xie et al., (2005) là
trong 64 mẫu vi khuẩn V. alginolyticus đều không biểu hiện gen độc tố toxRS. Kết quả
PCR cho thấy chủng vi khuẩn V. cholerae biểu hiện 2 độc lực tlh và PirBVP. Các gen
gây bệnh tương đồng với V. parahaemolyticus và các yếu tố quyết định độc lực của
V. cholerae được phân bố rộng rãi trong một số loài Vibrio (V. parahaemolyticus,
V. cholerae non-O1, V. mimicus, V. hollisae, V. fluvialis và V. alginolyticus) (Nishibuchi
et al., 1996; Sechi et al., 2000). Điều này lý giải cho việc có một số gen gây bệnh đặc
trưng của một số chủng vi khuẩn lại hiện diện ở chủng khác trong cùng một loài.
V. vulnificus là chủng vi khuẩn cơ hội gây nhiễm trùng huyết, chủng vi khuẩn này
là nguyên phát khi bệnh nhân mẫn cảm ăn phải động vật giáp xác đã nhiễm V. vulnificus.
Sự lây nhiễm thành công bởi vi khuẩn gây bệnh, nói chung, được thiết lập bằng cách
phối hợp biểu hiện của các yếu tố độc lực khác nhau trong cơ thể sống (Lee et al., 2000).
Vì vậy việc xác định các gen gây độc có mặt ở chủng vi khuẩn V. vulnificus là cần thiết.
Kết quả PCR cho thấy dòng vi khuẩn V. vulnificus biểu hiện hai độc lực toxR và toxRS
tương đồng với nghiên cứu của Lee et al., (2000). Nhóm nghiên cứu trên đã chứng minh
rằng toxR được biểu hiện ở V. vulnificus ở kích thước mong đợi và cho thấy rằng toxRS
có thể điều chỉnh sản xuất hemolysin V. vulnificus.
4.7. Xác định độc tính của các chủng Vibrio spp.
Dựa vào kết quả định danh vi khuẩn và tỷ lệ xuất hiện của các nhóm vi khuẩn
Vibrio spp. trên tôm bệnh đường ruột, đề tài tiến hành chọn đại diện 1 chủng vi khuẩn
(V. cholerae CM3HPTB1, V. alginolyticus CM3IC1, V. vulnificus CM2HPA4 và V.
parahaemolyticus BTIA1) cho mỗi loài vi khuẩn được phân lập từ tôm có dấu hiệu phân
trắng để tiến hành gây cảm nhiễm và xác định khả năng gây bệnh. Các chủng vi khuẩn
được phục hồi và tiêm cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng có trọng lượng từ 10-12 g
với nồng độ vi khuẩn từ 103-106 CFU/mL, thí nghiệm theo dõi trong 14 ngày.
Tỷ lệ sống của tôm ở nghiệm thức đối chứng là 100% trong suốt quá trình thí
nghiệm cảm nhiễm, đều này chứng tỏ rằng hệ thống bố trí thí nghiệm ổn định, không có
sự nhiễm chéo trong suốt quá trình thí nghiệm. Sau thời gian cảm nhiễm, giá trị độc lực
83
và dấu hiệu bệnh lý được theo dõi và ghi nhận có sự khác biệt phụ thuộc vào từng loài
vi khuẩn được gây cảm nhiễm.
Bệnh gây ra do vi khuẩn Vibrio spp. hay “Vibriosis” là một trong những bệnh phổ
biến và gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm nói chung và nghề nuôi tôm nước lợ nói riêng.
Trong đó, V. aginolyticus, V. cholerae, V. vulnificus và V. parahaemolyticus được xác
định có liên quan đến các bệnh như hội chứng trên ấu trùng Zoae II, bệnh hoại tử gan
tụy cấp tính, bệnh nhiễm trùng-hoại tử gan tụy, bệnh trên vỏ tôm, bênh hoại tử đuôi và
bệnh đỏ thân trên tôm nước lợ. Bốn loài vi khuẩn này thường được tìm thấy trong quá
trình phân lập vi khuẩn ở đường ruột trên tôm bị hội chứng phân trắng (Cao et al., 2015;
Limsuwan., 2010; Truong et al., 2021).
4.7.1. Chỉ tiêu chất lượng nước ở thí nghiệm cảm nhiễm
Trong suốt quá trình thí nghiệm cảm nhiễm, các chỉ tiêu môi trường nước như
nhiệt độ, pH, NH3/NH4+ NO2 và độ kiềm ở các nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức
gây cảm nhiễm với 4 chủng vi khuẩn đều nằm trong ngưỡng thích họp, không có sự
khác biệt lớn giữa các nghiệm thức. Điều này cho thấy các yếu tố môi trường không gây
ảnh hưởng đến quá trình thí nghiệm cảm nhiễm (Bảng 4.6).
Bảng 4.6. Các chỉ tiêu môi trường trong thời gian thí nghiệm
Chỉ tiêu
Nghiệm thức
Đối
chứng
V.
alginolyticus
CM3IC1
V. cholerae
CM3HPTB1
V. vulnificus
CM2HPA4
V.
parahaemolyticus
BTIA1
Nhiệt độ
(oC)
27,1-
30
27,3-29,9 27,3-29,7 27,2-29,6 27,2-30
pH 7,1-8,0 7,0-8,2 7,0-8,3 6,9-8,3 6,9-8,2
NH3/NH4+
(mg/L)
0 0-0,5 0-0,5 0-0,5 0-0,5
NO2 (mg/L) 0-2 0-2 0-2 0-2 0-2
Kiềm (mg
CaCO3/L)
107,4-
125,3
107,4-143,2 107,4-143,2 107,4-143,2 107,4-143,2
4.7.2. Khả năng gây bệnh của V. cholerae trên tôm
Chủng vi khuẩn V. cholerae CM3HPTB1 phân lập từ tôm mắc hội chứng phân
trắng, bằng phương pháp tiêm sau khi gây cảm nhiễm 10 ngày, đề tài ghi nhận các biểu
hiện bệnh lý giống nhau ở các nghiệm thức thí nghiệm như gan tụy sưng và nhạt màu,
phân lỏng, ruột rỗng hay bị đứt đoạn. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn này không gây tôm
chết, tỷ lệ chết của tôm ghi nhận là 0% ở tất cả các nghiệm thức cảm nhiễm khi so sánh
với kết quả của một số các nghiên cứu cảm nhiễm V. cholerae với phương pháp hoặc
giai đoạn tôm khác nhau (Hình 4.24).
Theo Cao et al., (2015b). Khi cảm nhiễm trên tôm thẻ chân trắng có trọng lượng
7,22g bằng phương pháp cho ăn thức ăn có bổ sung vi khuẩn V. cholerae chủng BB31
84
phân lập từ tôm bệnh phân trắng tại Trung Quốc, ở liều lượng 1×108 CFU/g thức ăn
trong 18 ngày gây tỷ lệ chết lên đến 73,33%. Trên chủng V. chorelae phân lập từ tôm
thẻ chân trắng bệnh vàng chân tại Trung Quốc ghi nhận được khả năng gây chết cao trên
giai đoạn tôm thịt trọng lượng 11,26g và gây chết hơn 90% chỉ trong 7 ngày sau cảm
nhiễm bằng phương pháp ngâm ở nồng độ 5×106 CFU/mL (Cao et al., 2015a). Tôm thẻ
chân trắng đoạn giai đoạn PL15-20 cũng thể hiện tính mẫn cảm cao với V. cholerae với
giá trị LD50 là 4,6 × 104 CFU/mL khi thực hiện bằng phương pháp ngâm (Joseph et al.,
2015). Qua đó cho thấy, chủng V. cholerae CM3HPTB trong nghiên cứu này có giá trị
độc lực thấp trên tôm thẻ chân trắng giai đoạn thịt với nồng độ gây chết >106 CFU/mL
khi thực hiện bằng phương pháp tiêm.
Hình 4.24. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. cholerae phân lập từ tôm bị hội
chứng phân trắng. Gan tụy sưng, nhạt màu, phân lỏng, có màu vàng nâu
Vi khuẩn V. cholerae được ghi nhận hiện diện với tỷ lệ cao trên gan tụy và được
xác định có khả năng gây bệnh trên một số loài tôm nuôi, với độc lực và khả năng gây
bệnh của V. cholerae đối với tôm thẻ chân trắng phụ thuộc vào chủng vi khuẩn được
phân lập theo từng nhóm dấu hiệu bệnh lý đặc trưng, giai đoạn phát triển của tôm và
phương pháp cảm nhiễm được sử dụng (Albuquerque et al., 2013; Suzita et al., 2007;
Joseph et al., 2015).
Một trong những triệu chứng rối loạn tiêu hoá của bệnh đường ruột trên tôm thẻ
chân trắng bị nhiễm Vibrio spp., (Schmidt et al., 1979; Faruque et al., 1998). Theo Gao
et al., (2019) & Hannan et al., (2019), nguyên nhân dẫn đến dấu hiệu gan tụy sưng to,
nhạt màu là do sự tấn công của vi khuẩn làm phá vỡ lớp nền của ống gan tụy, giảm các
không bào, gây mất cấu trúc, hoại tử tế bào biểu mô và hình thành nên các ổ viêm. Các
dấu hiệu tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Joseph et al., (2015) trên
tôm thẻ chân trắng và tôm sú giai đoạn PL15-20 cảm nhiễm với chủng vi khuẩn V. cholerae
85
O139 phân lập từ tôm sú bệnh tại Ấn Độ. Các biến đổi trên rối loạn chức năng tiêu hóa
và ảnh hưởng đến sức khỏe tôm nuôi dẫn đến tôm thường hoạt động yếu, lờ đờ, giảm
hoặc bỏ ăn, thức ăn đường tiêu hóa thường không liên tục hoặc rỗng ruột (Hannan et al.,
2019; Gao et al., 2019). Ở các nghiệm thức có mật độ vi khuẩn cảm nhiễm càng cao thì
dấu hiệu bệnh lý càng rõ ràng hơn.
4.7.3. Khả năng gây bệnh của V. alginolyticus
Chủng vi khuẩn V. alginolyticus CM3IC1 cũng được phân lập từ tôm mắc hội
chứng phân trắng, theo dõi nghiệm thức sau khi gây cảm nhiễm tôm có các dấu hiệu như
gan tụy sưng và nhạt màu, phân lỏng, ruột rỗng. Tuy nhiên, biểu hiện bệnh ở thời gian
sớm hơn, chỉ sau 8 ngày sau cảm nhiễm (Hình 4.25)
Hình 4.25. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. alginolyticus phân lập từ tôm bệnh
phân trắng. Gan tụy sưng, nhạt màu, phân lỏng, có màu vàng nâu
Tương tự như trong thí nghiệm với vi khuẩn V. cholerae, nồng độ gây chết V.
alginolyticus CM3IC1 cũng được xác định nằm trong khoảng nồng độ > 106 CFU/mL
khi thực hiện bằng phương pháp tiêm. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hsieh
et al., (2008) & Chen et al., (2015), khi nồng độ gây chết tôm cảm nhiễm V. alginolyticus
trên tôm thẻ chân trắng được ghi nhận trên các liều 105-5,6 × 105 CFU/g mà không ghi
nhận được ở nồng độ thấp hơn.
V. aginolyticus được xác định có liên quan đến nhiều bệnh khác nhau trên giáp
xác, điển hình là hội chứng Zoae, hoại tử gan tụy do nhiễm khuẩn và bệnh có liên quan
đến vỏ (Valete & Wan., 2021). Trong điều kiện phòng thí nghiệm, vi khuẩn V.
alginolyticus được xác định gây chết và biểu hiện một số các dấu hiệu bệnh lý trên tôm
càng xanh với các dấu hiệu đục cơ, hoại tử trên mang, mất phụ bộ, gan tụy sậm màu và
mềm nhũn (Ajadi et al., 2019). Ngoài ra, còn gây chết liên tục trên tôm thẻ chân trắng
86
khi cảm nhiễm có biểu hiện đục cơ với các dấu hiệu đỏ phụ bộ (đuôi, vây râu và chân
bơi) (Liu et al., 2004).
4.7.4. Khả năng gây bệnh của V. vulnificus
Ở nghiệm thức cảm nhiễm với chủng V. vulnificus CM2HPA4, theo dõi tôm và ghi
nhận một số các biểu hiện điển hình là đường ruột đứt khúc hoặc rỗng ruột kèm theo
gan tụy biểu hiện nhạt màu, gan sưng to, mềm nhũn và có dịch (Hình 4.26).
Hình 4.26. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. vulnificus phân lập từ tôm
bệnh phân trắng. Gan tụy sưng, nhạt màu, ruột rỗng
Chủng vi khuẩn V. vulnificus CM2HPA4 thể hiện khả năng gây chết cao trên tôm
thẻ chân trắng khi cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm. Ở tất cả các nghiệm thức cảm
nhiễm, tôm bắt đầu chết sau 12 giờ và tăng liên tục trong 5 ngày sau cảm nhiễm ở nghiệm
thức tiêm nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL, trong 3 ngày ở nghiệm thức tiêm 105 CFU/mL
và trong 2 ngày ở các nghiệm thức khác, sau đó dừng chết cho đến ngày 14. Kết thúc
thí nghiệm, tôm chết 100% ở nghiệm thức tiêm vi khuẩn 106 CFU/mL và giảm dần theo
nồng độ vi khuẩn được tiêm với tỷ lệ 70%, 40% và 23,3% tương ứng với mật độ vi
khuẩn từ 105-103 CFU/mL. Nồng độ gây chết 50% (LD50) của vi khuẩn V. vulnificus
trong thí nghiệm là 1,5 × 104 CFU/mL (Hình 4.27).
Vi khuẩn V. vulnificus là loài vi khuẩn phổ biến thường xuất hiện nhiều ở các vùng
cửa sông và vùng biển trên toàn thế giới, được xác định gây hiện tượng đỏ thân trên tôm
sú giai đoạn PL20 và gây chết sớm hàng loạt trên tôm càng xanh (M. rosenbergii) giai
đoạn zoea và hậu ấu trùng. Giá trị LD50 cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm trên tôm
sú là 6,54 × 103 CFU/mL và theo thứ tự là 1,16 × 106 CFU/mL và 1,45 × 106 CFU/mL
tương ứng với hai giai đoạn tôm càng xanh (Thakur et al., 2003; Li et al., 2019). Tuy
nhiên, trên tôm thẻ chân trắng, các nghiên cứu về độc lực cũng như khả năng gây bệnh
của loài vi khuẩn này vẫn còn nhiều hạn chế.
87
Hình 4.27. Tỉ lệ chết (%) trên tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm vi khuẩn V. vulnificus chủng
CM2HPA4 sau 14 ngày. Control: đối chứng, V3-6: tiêm vi khuẩn nồng độ 103-106 CFU/mL
Theo Alday et al., (2002), sau khi tiêm vi khuẩn V. vulnificus vào trong huyết
tương, tấn công vào tế bào máu và các mô liên kết, sau đó di chuyển đến các vùng xung
quanh các ống gan tụy, ruột giữa, manh tràng ruột giữa và cơ quan lympho. Tại đây, vi
khuẩn sẽ tiếp tục tấn công và gây ảnh hưởng đến các cơ quan dẫn đến biểu hiện các dấu
hiệu bệnh lý. Từ kết quả thí nghiệm cho ta thấy khả năng gây bệnh và giá trị độc lực cao
của V. vulnificus CM2HPA4 được sử dụng trong nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng khi
so sánh với chủng vi khuẩn V. vulnificus phân lập từ tôm bệnh phân trắng tại Ấn Độ
trong nghiên cứu của Mastan & Begum (2016), không ghi nhận được dấu hiệu bệnh lý
và tỷ lệ chết nào trên tôm khi tiêm ở liều 105 CFU/g.
4.7.5. Khả năng gây bệnh của V. parahaemolyticus
Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus BTIA1 sau khi cảm nhiễm cũng ghi nhận
dấu hiệu bệnh lý như gan tụy bị teo, ruột rỗng (Hình 4.28)
Hình 4.28. Dấu hiệu bệnh lý tôm cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ tôm
bệnh phân trắng. Gan tụy teo, dai, nhạt màu, ruột rỗng
.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4
T
Ỉ
L
Ệ
C
H
Ế
T
(
%
)
NGÀY CẢM NHIỄM
Control V3 V4 V5 V6
88
Các dấu hiệu bệnh lý trên tôm sau cảm nhiễm tương tự như mô tả của Nguyễn
Trọng Nghĩa và Oanh (2015) khi cảm nhiễm V. parahaemolyticus BL2 phân lập từ tôm
bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. Đây là dấu hiệu cho thấy gan tụy tôm bị hoại tử, giảm các
tế bào biểu mô, các tế bào bị thoái hóa, bong tróc và hình thành nên các ổ vi khuẩn được
bao quanh bởi các tế bào máu. Ngoài ra, V. parahaemolyticus có thể gây ra các tổn
thương cục bộ, đỏ thân và đỏ phụ bộ trên tôm thẻ chân trắng (Mastan & Begum., 2016).
Giá trị LD50 trên tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm V. parahaemolyticus BTIA1 phân
lập từ tôm mắc hội chứng phân trắng trong nghiên cứu được xác định là 2,7 × 105
CFU/mL. Không ghi nhận tôm chết ở nghiêm thức tiêm nồng độ 103 CFU/mL. Tuy
nhiên, ở các nghiệm thức tiêm các nồng độ 104-106 CFU/mL, tôm bắt đầu chết sau 18
giờ cảm nhiễm và đồng loạt dừng chết sau 2 ngày cảm nhiễm đến khi kết thúc thí
nghiệm. Tỷ lệ chết ghi nhận tương ứng với từng nồng độ cảm nhiễm là 13,3%, 23,3%
và 53,3% (Hình 4.29).
Hình 4.29. Tỉ lệ chết (%) trên tôm thẻ chân trắng cảm nhiễm vi khuẩn V. parahaemolyticus
chủng BTIA1 sau 14 ngày. Control: đối chứng, P1-6: tiêm vi khuẩn nồng độ 103-106 CFU/mL
Thông qua kết quả LD50 cho thấy chủng V. parahaemolyticus BTIA1 phân lập từ
tôm nhiễm hội chứng phân trắng trong nghiên cứu thể hiện khả năng gây bệnh trên tôm
và có giá trị độc lực cao hơn so với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus S05 được phân
lập từ tôm thẻ chân trắng mắc hội chứng phân trắng tại Trung Quốc khi thực hiện bằng
phương pháp bơm vi khuẩn ngược từ đường hậu môn (Wang et al., 2020). Tuy nhiên,
các biểu hiện bệnh lý trên tôm cảm nhiễm V. parahaemolyticus BTIA1 trong nghiên cứu
có sự tương đồng với thí nghiệm của Wang et al., (2020) trên V. parahaemolyticus S05
với dấu hiệu như ruột rỗng và gan tụy sưng, nhạt màu. Trong các trường hợp này gan
tụy tôm cảm nhiễm bị mất cấu trúc hình sao, các tế bào B, R, F giảm số lượng hoặc tiêu
biến, lòng ống gan tụy mở rộng và giảm độ dày của các tế bào biểu mô gan tụy. Theo
nhận định của Jayasree et al., (2006), vi khuẩn V. parahaemolyticus là một trong những
tác nhân gây nên bệnh Vibriosis và bệnh hoại tử cấp tính, gây thiệt hại đáng kể trên tôm
nuôi nước lợ thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng trong những năm gần đây.
.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4
T
Ỉ
L
Ệ
C
H
Ế
T
(
%
)
NGÀY THEO DÕI
Control P3 P4 P5 P6
89
Nhìn chung, qua các thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của 4 chủng vi khuẩn
(thuộc 4 loài khác nhau) phân lập trên tôm mắc hội chứng phân trắng cho thấy tất cả các
chủng vi khuẩn này đều có khả năng gây ảnh hưởng đến đường tiêu hóa của tôm. Đề tài
ghi nhận một số dấu