Luận án Khảo sát tính chất động lực học của một số hạt nano bằng phương pháp tương quan huỳnh quang trên hệ đo tự xây dựng

mật độ tương ứng với cường độ của tín hiệu ánh sáng. Như vậy việc đếm số xung điện trong một khoảng thời gian nhất định, hay còn gọi là kỹ thuật đếm photon, là phương pháp đo đạc tín hiệu quang với hiệu suất cao bằng các đầu thu có hệ số khuếch đại lớn. Các đầu thu được sử dụng trong luận án đều ở dạng mô-đun tự xây dựng, trong đó các mạch điều khiển, phần làm lạnh, thiết kế chống nhiễu đều tự chế tạo và tích hợp với sensor thương mại. 39 Đầu thu nhân quang điện PMT: Các đầu thu nhân quang điện (photomultiplier tube - PMT) là các đầu thu có hệ số khuếch đại cao dựa trên hiệu ứng quang điện. Nhân quang điện bao gồm photocathode và một số lớn các dynode, hay các tầng khuếch đại, đặt trong chân không. Cao áp giữa photocathode và dynode tạo ra một điện trường lớn nhằm gia tốc các điện tử đã được bứt ra khỏi photocathode (điện tử sơ cấp) hay từ dynode (điện tử thứ cấp). Do vậy hệ số khuếch đại của các nhân quang điện đạt được rất cao, lên tới 106 hay 107 lần. Sensor của hãng Hamamatsu (Nhật bản) được lựa chọn để chế tạo đầu thu PMT hoạt động trong dải phổ rộng từ 230 đến 700 nm (hình 2.7), đồng thời có dòng tối cực đại thấp (dưới 102 counts/s). Sensor và nguồn cao áp được mua riêng lẻ và được tích hợp trong vỏ đồng chống nhiễu với nguồn cấp cho cao áp là nguồn một chiều 15 V. Thiết kế này cho phép chống nhiễu cao tần hiệu quả cho đầu thu. Hình 2.7. a) Đáp ứng phổ và b) đặc trưng khuếch đại của PMT. Đầu thu được đặt cố định trên giá đỡ. Nhờ các khớp nối đầu thu có thể được tháo lắp khỏi hệ đo hoặc thay thế dễ dàng, thuận tiện mà vẫn đảm bảo tính ổn định về quang học và cơ học cho hệ đo. Tín hiệu từ PMT được khuếch đại bằng bộ khuếch đại xung trước khi đưa vào mô-đun đếm photon. Bộ khuếch đại xung có đáp ứng nhanh và có hệ số khuếch đại cao. Các xung điện ứng với đơn photon được giãn thành các xung có độ rộng lớn hơn, cỡ 10 ns, có thể đo trực tiếp trên dao động ký thương mại PicoScope với tốc độ lấy mẫu trung bình tới 100 Msamples/giây. Bộ khuếch đại được thiết kế gồm hai kênh, hệ số khuếch đại được chọn cho mỗi kênh là 10 và sử dụng nguồn một chiều  5 V. Lối vào và lối ra được phối hợp trở kháng 50 . Mạch điện được thiết kế đảm bảo a) b) 40 cho hoạt động tại tần số cao (500 MHz) với một mặt được phủ đồng hoàn toàn chống nhiễu. Đầu thu photodiode thác lũ APD: được thiết kế và chế tạo trên cơ sở đầu thu thương mại chưa tích hợp nguồn cấp điện, mạch điện tử và phần làm lạnh. Để có thể thu các tín hiệu yếu, đầu thu được đặt trong vỏ nhôm dày chống nhiễu, thiết kế để làm lạnh xuống < -10oC bằng pin peltier với hệ tản nhiệt bằng nước bơm liên tục qua vỏ để giảm dòng tối của đầu thu xuống cỡ 500 - 600 xung/s. Để tránh hiện tượng đóng băng trên đầu thu, dòng khí trơ (nitơ hoặc argon) được thổi liên tục qua đầu thu trong quá trình đo. APD có độ nhạy cao trong vùng ánh sáng nhìn thấy bước sóng 300 – 700 nm. Tín hiệu từ PMT hoặc từ APD được quan sát trực tiếp bằng dao động ký để kiểm tra và căn chỉnh hệ đo. Các tín hiệu sau đó được ghi nhận và xử lý bằng mô-đun đếm photon để có đường tương quan FCS. Trong trường hợp sử dụng đồng thời hai đầu thu để lấy tương quan chéo giữa hai kênh (hình 2.8), tín hiệu được chia đôi thông qua một bộ chia chùm. Nhờ quá trình lấy tương quan chéo giữa hai đầu thu, có thể loại bỏ ảnh hưởng của hiện tượng nhiễu do có xung phụ (afterpulse) đi kèm ngay sau xung chính của APD, thu được hàm tương quang ứng với thời gian trễ ngắn  < 10-5 s. 1. APD 1 2. APD 2 3. Đường dẫn khí trơ 4. Đường dẫn nước làm lạnh Hình 2.8. Hệ đo sử dụng hai đầu thu APD. Mô-đun đếm photon là mô-đun thương mại PicoHarp 300 (hãng PicoQuant) phát hiện đơn photon với thời gian phân giải cực ngắn cỡ vài ps. Ngoài ra còn sử dụng mô-đun đếm photon tự thiết kế dựa trên mảng logic lập trình được (FPGA) đếm số photon huỳnh quang trong một khoảng thời gian cỡ μs. 41 2.3.3. Tính toán đường tương quan thực nghiệm Số liệu đếm photon được xử lý sử dụng thuật toán multi-tau để tính toán đường tương quan thực nghiệm. Cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được qua kỹ thuật đo đơn photon được tập hợp trong các khoảng thời gian rất nhỏ (gọi là các bin thời gian), có độ rộng từ 0,1 s tới 0,1 s. Hàm tương quan thực nghiệm được tính theo công thức: 𝐺(𝜏) = ∑ 𝑛௜ 𝑛௜ାଵெିଵ௜ (∑ 𝑛௜ெିଵଵ )ଶ − 1 (2.1) trong đó ni là cường độ huỳnh quang (số photon) tại bin thời gian i với độ rộng của mỗi bin thời gian là τ, M là tổng số bin. Với mỗi giá trị  có một giá trị G() tương ứng. Tính toán các đường tương quan được tích hợp trong phần mềm chuyên dụng đi kèm với mô-đun PicoHarp 300. Với mô-đun đếm photon tự thiết kế, các bước tính toán được thực hiện trên phần mềm do nhóm nghiên cứu tại Viện Vật lý tự phát triển. Đường đo tương quan thực nghiệm sau đó được so sánh (fit) với một hàm lý thuyết dựa trên các giả thiết về khuếch tán và các quá trình xảy ra khi có kích thích quang đối với các phân tử chất màu hoặc hạt nano trong mẫu. Từ đó tìm ra các thông số của thể tích đo, thời gian khuếch tán của chất màu/hạt nano, số phân tử/hạt trong thể tích đo, trạng thái tự do hay liên kết của các đối tượng phát quang ... Phần mềm thương mại OriginLab với chức năng fit hàm không tuyến tính được sử dụng cho mục đích này. 2.3.4. Căn chỉnh hệ đo Hệ đo được căn chỉnh để đảm bảo chùm laze kích thích hội tụ trong một thể tích tối ưu cho đo đạc FCS (thể tích nhỏ, phân bố cường độ kích thích dạng hàm Gauss), đồng thời thu được tín hiệu huỳnh quang lớn nhất có thể. Do tín hiệu thu được từ các đơn hạt/đơn phân tử là các tín hiệu có cường độ rất thấp nên căn chỉnh hệ là bước đòi hỏi nhiều thời gian và kinh nghiệm. Căn chỉnh hệ được thực hiện như sau:  Trước hết, tiến hành chỉnh vị trí của các thành phần trong bộ lọc không gian sao cho sao cho chùm tia laze qua thấu kính thứ nhất hội tụ đúng vào pinhole 20 μm, vị trí của thấu kính thứ hai cách pinhole đúng bằng tiêu cự của thấu kính. Chùm laze ra khỏi bộ lọc không gian là chùm song song. 42  Chỉnh các gương quang học để chùm tia laze đi song song với mặt bàn và hợp với gương lưỡng chiết một góc 45o.  Vật kính hiển vi được đặt vuông góc với mẫu bằng cách chỉnh giá đỡ vật kính. Chỉnh vị trí của gương phản xạ cao để phương truyền của chùm tia laze trùng với trục của vật kính hiển vi.  Lắp đặt thấu kính hội tụ, pinhole 50 m trong các ống giữ của phần thu tín hiệu. Lắp đặt phin lọc để loại bỏ ánh sáng kính thích và chỉnh vị trí thấu kính hội tụ để huỳnh quang phát ra từ mẫu hội tụ đúng vào pinhole.  Sau khi lắp đặt PMT, bộ khuếch đại và kết nối máy tính, chỉnh lại vị trí của pinhole thu huỳnh quang và vật kính hiển vi sao cho cường độ huỳnh quang thu được từ mẫu đạt cực đại. 2.3.5. Tương quan tán xạ SCS Đo đạc SCS được thực hiện trên cơ sở hệ đo tương quan huỳnh quang. Đối với các hạt nano không phát quang, tín hiệu tán xạ từ được sử dụng để xây dựng đường tương quan. Đây là ứng dụng mở rộng của hệ đo FCS để xác định kích thước cho cả các hạt không phát huỳnh quang. Nguyên lý đo và các phương trình hàm tương quan không thay đổi. Do đó, hệ đo và các cấu tử quang, cơ quang, điện tử được giữ nguyên như trong đo đạc FCS. Tuy vậy, cần thu tín hiệu tán xạ từ hạt nano nên không đưa các phin lọc băng hẹp vào hệ đo để loại ánh sáng tán xạ. 2.3.6. Hiệu ứng chống bó Hệ đo FCS được sử dụng để đo đạc hiệu ứng chống bó theo cấu hình HBT (hình 2.9). Để có cấu hình HBT, bố trí thí nghiệm bao gồm một bộ chia chùm phân cực (Thorlabs) để chia chùm tia huỳnh quang phát ra từ mẫu thành 2 kênh. Hệ FCS cần có hai photodiode thác lũ (APD) hoạt động ở chế độ đếm đơn photon để phát hiện tín hiệu của đơn photon tại mỗi kênh. Các xung điện thể hiện các photon từ đầu ra của APD được lấy tương quan để có hàm G() dùng mô-đun đo đạc PicoHarp 300. APD silic có hiệu suất lượng tử trên 60% trong vùng đỏ (đến 90% tại bước sóng nhạy nhất là 850 nm), cho phép phát hiện đơn photon ở độ nhạy rất cao so với ống nhân quang điện PMT. 43 Hình 2.9. Cấu hình giao thoa kế Hanbury-Brown-Twiss. 2.3.7. Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu đo 20 l dung dịch chất màu (RB, R6G) hoặc hạt nano (chấm lượng tử, nano silica, cacbon nanodot, nano bạc) hoặc ADN với nồng độ thích hợp được đưa lên một coverslip có độ dày 0,13 – 0,17 mm. Các coverslip này được làm sạch và làm khô trước mỗi thí nghiệm. Các mẫu ADN Hỗn hợp hai ADN sợi đơn được chuẩn bị trong đệm SSPE (đệm phosphate có chứa NaCl và EDTA, pH 7,4) với các nồng độ như sau: [ADN phát quang] = 3 nM [ADN bổ trợ] = 3 M. Đóng cặp hai ADN sợi đơn được tiến hành ở nhiệt độ 25oC hoặc nhiệt độ cao. Đóng cặp ở nhiệt độ cao được tiến hành bằng cách ủ hỗn hợp phản ứng ở 95oC trong 5 phút, sau đó để nguội xuống nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Sau khi đã tiến hành đóng cặp hai sợi ADN, streptavidin được thêm vào dung dịch để đạt được nồng độ cuối = 3 M. Đo đạc FCS được tiến hành ở nhiệt độ 25oC. Các mẫu chất màu và chấm lượng tử trong dung dịch saccarozơ 10 µl dung dịch chất màu RB (nồng độ 10-7 M) hoặc chấm lượng tử CdTe/CdS trong nước được thêm vào 90 µl dung dịch saccarozơ sao cho nồng độ cuối của saccarozơ nằm trong khoảng 0 - 46%. Đo đạc FCS được thực hiện ở nhiệt độ 25oC. 44 2.4. Các phương pháp bổ trợ đặc trưng vật liệu 2.4.1. Phổ huỳnh quang Phổ huỳnh quang cho biết vùng phát xạ của chất màu hoặc các hạt nano. Từ các thông tin này, lựa chọn các cấu tử quang học và các đầu thu cho hệ đo FCS phù hợp với đối tượng cần đo. Các kết quả đo tính chất phát quang của chất màu và hạt nano sử dụng trong luận án được thực hiện trên phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse (Varian) tại Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam. Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn Xenon. Dải phổ cho phép đo đạc của máy là từ 200 nm đến 900 nm. Thời gian sống huỳnh quang Thời gian sống của chấm lượng tử CdTe được xác định từ đo đường chống bó (antibunching) của chấm lượng tử, thực hiện trên hệ FCS tự xây dựng. Đây là thời gian sống trung bình của các đơn hạt. 2.4.2. Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến UV-VIS Phổ hấp thụ được sử dụng để khảo sát bước sóng kích thích phù hợp cho đối tượng cần đo. Phổ hấp thụ được đo tại Viện Vật lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam trên máy UV-2600 (Shimadzu). Dải phổ đo được của máy nằm trong khoảng 190 nm – 1400 nm. 2.4.3. Hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Trong luận án, TEM được sử dụng để tìm hiểu kích thước vật lý của các chấm lượng tử. Ảnh TEM được chụp trên máy JEM1010 (JEOL) ở thế gia tốc 80 kV tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương hoặc máy JEM-2100 (JEOL) ở thế gia tốc 200 kV tại Viện Khoa học Vật liệu. Mẫu đo TEM được chuẩn bị bằng cách nhỏ một giọt dung dich mẫu lên lưới đồng phủ cacbon và làm khô ở nhiệt độ phòng. 2.4.4. Tán xạ ánh sáng động (DLS) Tán xạ ánh sáng động và phân bố kích thước hạt của mẫu được xác định trên thiết bị Zetasizer-Nano ZS (Malvern) tại Viện Khoa học Vật liệu. Nguồn sáng là laze bán dẫn bước sóng 532 nm, công suất 10 mW. Thiết bị có dải đo kích thước từ 0,6 nm – 6,0 µm. Góc thu tán xạ = 173o. Kết quả đo tán xạ ánh sáng động cho biết kích thước thủy động lực học của hạt và phân bố kích thước hạt. 45 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xây dựng và đặc trưng hệ đo FCS 3.1.1. Cấu hình hệ đo FCS Các chi tiết quang học của hệ đã được lựa chọn để phù hợp với mục tiêu ứng dụng đo đạc cho các đối tượng phát quang trong vùng ánh sáng nhìn thấy (300 – 700 nm) và đảm bảo đo đạc được đến mức độ đơn phân tử với độ ổn định cao và hiệu suất thu tín hiệu cao. - Laze kích: Hệ FCS xây dựng trong luận án sử dụng kích thích đơn photon. Lựa chọn laze Nd:YAG loại compact bơm bằng laze bán dẫn của hãng Sinolaser (Trung Quốc) phát liên tục ở bước sóng cơ bản 532 nm, công suất 100 mW, đường kính chùm laze 2,5 mm. Laze được ổn định về cường độ dòng điện nuôi và nhiệt độ của cả khối bằng pin Peltier cùng mạch điện phản hồi. Loại laze này gọn nhẹ, dễ sử dụng, giá thành không quá cao. Bằng cách sử dụng các phin lọc trung tính có độ sâu quang học (OD) từ 0,5 đến 3,0 đặt sau đầu phát laze, cường độ laze có thể thay đổi trong khoảng từ 100 mW đến 100 W. Cường độ laze nằm trong khoảng vài W đến vài mW trước khi đưa vào vật kính hiển vi. - Bộ lọc không gian: Pinhole đặt giữa hai thấu kính hội tụ, tại tiêu điểm của mỗi thấu kính. Pinhole có đường kính 20 μm, có thể dịch chuyển theo ba chiều nhờ đặt trên một giá dịch chuyển z có độ dịch chuyển cỡ mili-mét và một giá vi dịch chuyển xy có độ dịch chuyển cỡ μm để điều chỉnh chính xác vị trí của pinhole. Sau khi đi qua bộ lọc không gian, chùm laze có dạng Gauss ở mode TEM00 (hình 3.1), chuẩn trực; kích thước chùm được mở rộng > 6 mm, lớn hơn kích thước cửa sổ (aperture) của vật kính hiển vi. - Các gương lái là các gương bạc với độ phản xạ lớn hơn 90% được sử dụng để dẫn chùm laze, được lắp trên các giá gương chuyên dụng có thể chỉnh hướng của chùm tia laze. - Gương lưỡng chiết: phân tách giữa chùm sáng kích thích và tín hiệu huỳnh quang. Chùm laze kích thích phản xạ gần như hoàn toàn trên gương này nhưng huỳnh quang từ mẫu thì truyền qua. 46 - Gương điện môi băng rộng: được đặt sau gương lưỡng chiết, có tác dụng phản xạ chùm laze tới vật kính hiển vi, cũng đồng thời phản xạ huỳnh quang phát ra từ mẫu tới phần thu tín hiệu. Lựa chọn dùng gương hiệu suất cao để nâng cao hiệu suất thu nhận ánh sáng huỳnh quang rất yếu từ từng phân tử chất màu hoặc hạt nano đơn lẻ. Hình 3.1. Bộ lọc không gian tạo chùm sáng ở mode TEM00. - Vật kính hiển vi: là loại dùng trong dầu của hãng Edmund Optics có giá thành thấp hơn khoảng 10 lần loại so với vật kính có cùng tính năng thường dùng trong kính hiển vi quang học của các hãng lớn như Nikon, Olympus. Vật kính có độ phóng đại 100x và khẩu độ số (numerical aperture, NA) = 1,25. Khẩu độ số lớn hơn 1 là yêu cầu cần thiết để đạt được độ phân giải cao và thể tích kích thích cỡ femto-lít. Các giá dịch chuyển giúp điều chỉnh vị trí của vật kính nhằm hội tụ chùm sáng kích thích tại vị trí mong muốn trong mẫu đo. Hình 3.2 trình bày một phần của khối quang học kích thích mẫu và thu tín hiệu huỳnh quang, cho thấy vị trí lắp đặt gương lưỡng chiết, gương điện môi băng rộng và vật kính hiển vi. 47 1. Giá đỡ mẫu 2. Cọc đồng giữ giá đỡ mẫu 3. Vật kính hiển vi 4. Các giá đỡ và giá dịch chuyển vật kính 5. Gương điện môi băng rộng hiệu suất cao 6. Gương lưỡng chiết Hình 3.2. Một phần khối quang học kích thích mẫu và thu tín hiệu huỳnh quang. - Phin lọc phát xạ: phù hợp để đo mẫu phát quang ở vùng bước sóng > 550 nm. - Thấu kính hội tụ trong phần thu tín hiệu huỳnh quang: thấu kính phẳng lồi, mạ chống phản xạ trong vùng từ 350 -700 nm có tiêu cự f = 150 mm. - Pinhole trong phần thu tín hiệu huỳnh quang có đường kính 50 μm. Sử dụng pinhole trong phần thu để loại bớt các phần ánh sáng nằm ngoài vùng hội tụ của ánh sáng kích thích, giúp thu hẹp kích thước vùng quan sát. Về thực chất, đây là cấu hình của kính hiển vi đồng tiêu cho phép quan sát mẫu ở một vùng không gian 3 chiều với chiều z chỉ khoảng một vài μm. Mẫu cố định tại một vị trí trên giá đỡ mẫu trong quá trình đo. Các cọc đỡ lớn có đường kính 2 inch được sử dụng cho mẫu và vật kính giúp giảm thiểu rung lắc. Phin lọc phát xạ, thấu kính hội tụ, pinhole thu tín hiệu huỳnh quang được đặt trong các ống cố định trên các cọc quang học. Các ống này đảm bảo cho phần thu tín hiệu huỳnh quang không bị ảnh hưởng bởi ánh sáng từ bên ngoài. Phin lọc có thể tháo lắp dễ dàng bằng cách tháo lắp ống giữ. Kết quả xây dựng hệ FCS được trình bày trên bảng 3.1 và hình 3.3. 48 Bảng 3.1. Các thành phần chính của hệ đo FCS đã xây dựng trong luận án Thành phần Thông số Nguồn gốc Nguồn kích thích Kích thích đơn photon sử dụng laze Nd-YAG bơm bằng laze diode phát liên tục ở bước sóng 532 nm, công suất cực đại 100 mW Trung Quốc Bộ lọc không gian  Pinhole 20 m  Thấu kính phẳng lồi f = 60 mm  Thấu kính phẳng lồi f = 150 mm Thorlabs Vật kính hiển vi Vật kính dùng trong dầu, độ phóng đại 100x, khẩu độ số NA = 1,25 Edmunds Optics Gương lưỡng chiết  Truyền qua > 85% trong vùng ánh sáng 584-700 nm  Phản xạ > 90% trong vùng từ 380-550 nm. Thorlabs Gương điện môi phản xạ cao Phản xạ trong vùng từ 400 nm đến 750 nm. Hiệu suất phản xạ > 99% Thorlabs Phin lọc phát xạ  Phin lọc giao thoa băng dài truyền qua 80% trong vùng bước sóng > 550 nm, chặn ánh sáng trong vùng 220-550 nm.  Các phin lọc băng hẹp phù hợp với tính chất phát quang của đối tượng đo. Thorlabs Chroma Cấu hình đồng tiêu Pinhole kích thước 50 μm trong phần thu tín hiệu Thorlabs Detector Đếm đơn photon dạng mô-đun, gồm 2 loại:  PMT  APD Tự tích hợp Bộ khuếch đại cho PMT  Hệ số khuếch đại G = 10  Phối hợp trở kháng 50  Mô-đun đếm photon  PicoHarp 300  Mô-đun tự thiết kê dựa trên mảng logic lập trình được (FPGA). PicoQuant Tự chế tạo 49 Hình 3.3. Hệ FCS xây dựng trong luận án. 50 Các chi tiết quang học và cơ quang được sử dụng hầu hết đều của hãng Thorlabs (Mỹ), giá thành không quá cao, giúp giảm kinh phí xây dựng hệ. Đồng thời, một số linh kiện trong hệ được tự chế tạo, nhằm giảm giá thành và chủ động trong quá trình xây dựng hệ mà vẫn đảm bảo gá lắp vững chắc và ổn định hệ quang học và đầu thu. Các linh kiện này bao gồm: - Giá dịch chuyển hai chiều xy cho phép dịch chuyển cỡ μm và giá dịch chuyển một chiều z cho phép dịch chuyển cỡ mili-mét được dùng để lắp đặt pinhole trong bộ lọc không gian. - Các giá vi dịch chuyển ba chiều để chỉnh vị trí các đầu thu APD (sensor trong đầu thu APD có kích thước cỡ 2 mili-mét nên để chỉnh APD đúng vị trí cần dùng các giá vi dịch chuyển). - Cọc đỡ, giá dịch chuyển mẫu. 3.1.2. Khảo sát kích thước của thể tích đo FCS là phương pháp dựa trên tín hiệu của từng phân tử hoặc một số ít các phân tử. Để có thăng giáng tín hiệu huỳnh quang tối ưu, ngoài việc đáp ứng yêu cầu về sự ổn định của nguồn laze và độ nhạy cao của các đầu thu, thể tích đo là yếu tố rất quan trọng. Thể tích đo trong phương pháp FCS cần giảm xuống cỡ femto-lít để giảm số phân tử được quan sát. Trong phương trình đường tương quan, cần xác định các thông số cụ thể của thể tích đo (r0, z0) tương ứng với cấu hình hệ đã thiết lập. Xác định r0, z0 trực tiếp dựa trên quan sát vết hội tụ của laze tương đối phức tạp. Theo tài liệu tham khảo [168, 169], phương pháp đơn giản hơn để xác định r0, z0 là dựa vào thời gian khuếch tán D của một loại phân tử chất màu có hệ số khuếch tán D đã biết trước (sử dụng phương trình 1.17). Chất màu cần có hiệu suất lượng tử cao đảm bảo tín hiệu thu được đủ mạnh, có tính chất quang phù hợp với dải phổ của đối tượng cần nghiên cứu. Cấu hình hệ đo đã thiết lập với nguồn laze kích thích ở bước sóng 532 nm, hệ quang học và các đầu thu phù hợp để thu tín hiệu huỳnh quang tại vùng bước sóng trên 565 nm. Với cấu hình này, r0, z0 được xác định dựa vào dung dịch Rođamin B (RB) trong nước ở nồng độ rất loãng (< 10-7 M). Phân tử RB hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 532 nm, cho tín hiệu huỳnh quang mạnh tại bước sóng max khoảng 580 nm (hình 3.4), hiệu suất lượng tử 0,5 trong etanol [170]. 51 Hình 3.4. Phổ hấp thụ (đường đứt nét) và phổ huỳnh quang (đường liền nét) của RB trong nước. Hình 3.5 trình bày đường tương quan huỳnh quang điển hình cho dung dịch RB ở 25oC đo trong 300s trên hệ FCS tự xây dựng trong luận án. Các đường thực nghiệm đều phù hợp với hàm lý thuyết G(τ) cho trường hợp khuếch tán thường của các phân tử (xem phương trình 1.14 phần tổng quan): Hình 3.5. Đường tương quan điển hình của RB. 52 Tiến hành khớp đường tương quan thực nghiệm với hàm tương quan lý thuyết G() theo phương pháp bình phương tối thiểu không tuyến tính thu được các giá trị thời gian khuếch tán D, số phân tử trung bình trong thể tích đo N = G(0) (bảng 3.2) và tỉ lệ hình học của thể tích đo  = r0/z0. Giá trị hệ số khuếch tán của RB ở 25oC theo tài liệu tham khảo là (4,5  0,4) x 10-6 cm2s-1 [168]. Bán kính của thể tích quan sát r0, kích thước thể tích quan sát theo phương trục z0 và thể tích hiệu dụng Veff tính theo các phương trình 1.15 và 1.17 trình bày trong phần tổng quan. Các giá trị điển hình được trình bày trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy giá trị của r0 xấp xỉ giới hạn nhiễu xạ (/2NA = 532 nm/2/1,25  213 nm), thể tích đo của hệ phù hợp với lý thuyết (cỡ femto-lít) và phù hợp với thông số của các hệ FCS tương tự trên thế giới [171]. Bảng 3.2. Các giá trị đo FCS cho RB τD (μs) 36,0  0,7 N = 1/ G(0) 1,61  0,05 Nồng độ hiệu dụng (nM) 3,2  0,1 Bảng 3.3. Các thông số của thể tích đo Thông số Hệ FCS trong luận án Tham khảo [171] ω = r0/z0 0,11 0,11 r0 (nm) 255 300 z0 (μm) 2,32 2,8 Veff (fl) 0,84 1,4 3.1.3. Hệ số khuếch tán của chất màu R6G Hệ số khuếch tán của Rođamin 6G (R6G) được xác định dựa trên D của đường tương quan cho R6G với giá trị , r0 của thể tích đo đã biết. Kết quả cho phép đánh 53 giá độ chính xác của kết quả đo trên hệ đo đã xây dựng. Chất màu R6G phát quang mạnh ở max khoảng 560 nm, hiệu suất lượng tử trong etanol = 0,95 [170]. Tính chất hấp thụ và phát quang của R6G (hình 3.6) tương tự RB, do đó không cần thay đổi thành phần quang học của hệ FCS, và giá trị của r0 được giữ nguyên. Hình 3.6. Phổ hấp thụ (đường đứt nét) và phổ huỳnh quang (đường liền nét) của R6G trong nước. Đường FCS của R6G trình bày trên hình 3.7. Kết quả cho thấy đường tương quan thực nghiệm phù hợp với phương trình lý thuyết. Các giá trị đo cho R6G được trình bày trong bảng 3.4. Hình 3.7. Đường tương quan điển hình của R6G. 54 Bảng 3.4. Các giá trị đo FCS cho R6G Thông số Giá trị τD (μs) 41,0  0,9 N = 1/ G(0) 0,50  0,08 Nồng độ hiệu dụng (nM) 1,0  0,2 Bảng 3.5. Hệ số khuếch tán của R6G trong nước so sánh với tài liệu tham khảo D (25oC) (x 10-6 cm2s-1) Phương pháp đo Tài liệu tham khảo Năm xuất bản 2,8 ± 0,3 FCS [172] 1974 3,0 FCS [173] 1979 2,9 ± 0,7 NMR [174] 2001 4,0 Cực phổ [175] 2001 4,14 ± 0.01 Dòng chảy mao quản [176] 2002 4,3 ± 0,4 NMR và FCS [168] 2008 4,14 ± 0,05 FCS hội tụ kép [177] 2008 3,72 ± 0,03 (200 M)* 3,91 ± 0,06 (100 M) * 4,02 ± 0,12 (50 M) * NMR [178] 2014 4,0 ± 0,1 FCS Luận án 2021 * Giá trị D phụ thuộc nồng độ Từ thời gian khuếch tán D đo được và dựa trên giá trị r0 đã được xác định, tính được hệ số khuếch tán của R6G (theo phương trình 1.17). Hệ số khuếch tán của 55 R6G trong tài liệu tham khảo có nhiều giá trị khác nhau (bảng 3.5). Một số tác giả trước đây công bố các giá trị hệ số khuếch tán D  3 x 10-6 cm2s-1 [172-174], tuy nhiên các giá trị D như vậy đã được xác định là chưa chính xác [168]. Hệ số khuếch tán của R6G đo được trên hệ FCS tự xây dựng phù hợp với các giá trị trình bày trong các tài liệu tham khảo gần đây. Như vậy, với hệ FCS tự xây dựng, giá trị thời gian khuếch tán từ đường tương quan đủ tin cậy để tính toán hệ số khuếch tán và từ đó tìm kích thước của các phần tử phát quang. Giá trị N trong bảng 3.2 và bảng 3.4 cho phép kết luận hệ đo thiết lập đảm bảo tiêu chí của hệ đo FCS, số phân tử trong thể tích đo đủ nhỏ để phép đo đạt đến mức độ đơn phân tử. Các đường tương quan huỳnh quang được chuẩn hóa (G(0) =1) (hình 3.8) cho phép so sánh trực quan sự khác nhau về đặc tính động lực học của các chất màu RB và R6G. Chất màu có hệ số khuếch tán lớn hơn có đường tương quan suy giảm nhanh hơn và τD nhỏ hơn. Hình 3.8. Đường tương quan chuẩn hóa của R6G và RB. Hàm lý thuyết thể hiện bằng đường liền nét.  (s) G() D 56 3.1.4. Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ chất màu Đường FCS đo đạc cho các dung dịch có nồng độ chất màu khác nhau được trình bày trong hình 3.9. Hình 3.9. Đường tương quan của các chất màu RB (hình a và b) và R6G (hình c và d) trong dung dịch nước ở các nồng độ khác nhau. Đường FCS trong hình b và d là các đường đã chuẩn hóa. Mũi tên thể hiện chiều tăng của nồng độ dung dịch. Nồng độ chất màu càng cao, cường độ G(0) càng thấp do giá trị của G(0) tỉ lệ nghịch với số phân tử có mặt trong thể tích đo. Sau khi chuẩn hóa, các đường tương quan tương ứng với các nồng độ đo khác nhau trùng nhau, cho thấy giá trị D không 0 2 4 6 8 10 12 1E-06 0.0001 0.01 G (τ ) τ (s) a 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1E-06 1E-05 0.0001 0.001 0.01 0.1 G (τ ) τ (s) b 0 1 2 3 4 5 6 7 1E-06 1E-05 0.0001 0.001 0.01 0.1 G (τ ) τ (s) c 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1E-06 1E-05 0.0001 0.001 0.01 0.1 G (τ ) τ (s) d 57 phụ thuộc vào nồng độ (hình 3.9 b và d). Như vậy, hệ đo thiết lập có thể sử dụng đo đạc với nồng độ chất màu thay đổi trong một khoảng rộng, thể hiện đặc tính khuếch tán của các phân tử chất màu trong dung dịch không p