Luận án Nghiên cứu b ào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (trevesia palmata (roxb. ex lindl.) vis., họ nhân sâm araliaceae)

79 ± 3,09 92,17 ± 1,88 73,77 CT8 (Aer 30%) 3,75 ± 0,13 12,83 ± 0,14 0,23 ± 0,007 27,96 ± 1,28 149,08 ± 2,38 94,15 ± 1,51 79,68 Kết quả ở bảng 3.24 cho thấy: + Khi phun sấy với Aer ở các tỷ lệ tá dược từ 15 - 30% thì đều tạo thành dạng bột cao khô, tơi, hơi xốp. Khi tăng dần tỷ lệ Aer có xu hướng làm giảm dần cả độ ẩm và tính hút ẩm. Tuy nhiên, độ ẩm ở các mẫu đều ở mức thấp (< 5%), đạt yêu cầu về độ ẩm của cao khô theo DĐVN V. + Khi tăng tỷ lệ Aer có xu hướng làm tăng nhẹ khối lượng riêng biểu kiến, nhưng không nhiều và nói chung đều thấp và bột tương đối xốp. CI giảm rõ rệt khi tăng tỷ lệ Aer, nghĩa là tăng khả năng trơn chảy. Mẫu CT8 có CI thấp nhất cũng chỉ ở mức kém trơn chảy, các mẫu còn lại ở mức rất kém trơn chảy khi đánh giá khả năng trơn chảy theo USP 41. + Về lý thuyết, khi tăng tỷ lệ chất rắn làm giảm hàm lượng hoạt chất ở sản phẩm cuối cùng do hiện tượng pha loãng nồng độ. Kết quả ở bảng 3.24 cũng cho thấy hàm lượng SPN giảm dần khi tăng tỷ lệ tá dược, nhưng hiệu suất thu hồi hoạt chất có xu hướng tăng dần. Nghĩa là tá dược có vai trò bảo vệ hoạt chất nhất định trong quá trình phun sấy mà chủ yếu là tác động bởi nhiệt độ và oxy không khí. Hiệu suất phun sấy tăng dần khi tăng tỷ lệ tá dược, nhưng cũng chỉ đạt mức cao nhất là 79,68% (CT8). 83 Như vậy, tỷ lệ tá dược thêm vào có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình phun sấy tạo cao khô lá ĐĐR. Trong đó, tá dược làm tăng hiệu suất phun sấy, cải thiện tính chất cơ lý của sản phẩm. Nhưng khi tăng tỷ lệ tá dược quá nhiều lại làm giảm hàm lượng hoạt chất. Do vậy, trong nghiên cứu này lựa chọn tỷ lệ TD/CR là 30% để vừa đảm bảo tính chất cơ lý sản phẩm nhất định, hiệu suất phun sấy cao, nhưng hàm lượng hoạt chất không quá thấp so với các mẫu còn lại. - Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch: Tiến hành phun sấy trong cùng điều kiện như mẫu CT8, nhưng khác nhau về nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch. Thiết kế công thức khảo sát được trình bày ở bảng 3.25. Bảng 3.25. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch Mẫu Cao 3:1 Tỷ lệ CR/ cao Tá dược Tỷ lệ TD/CR Tỷ lệ CR/DP Nhiệt độ phun sấy Tốc độ cấp dịch CT9 100 g 25,24% Aer 30% 10% 120°C 20 ml/ phút CT10 130°C 30 ml/ phút CT8 140°C 30 ml/ phút CT11 150°C 40 ml/ phút Kết quả khảo s át ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch được thể hiện ở bảng 3.26. 84 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao Đu đủ rừng (TB ± SD), n=3 Mẫu Độ ẩm (%) Tính hút ẩm (%) KLRbk (g/ml) CI Hàm lượng SPN (mg/g) HS thu hồi SPN (%) HSPS (%) CT9 (120°C, 20 ml/ phút) 4,11 ± 0,05 11,55 ± 0,37 0,25 ± 0,003 26,56 ± 1,18 152,74 ± 3,21 96,46 ± 2,03 85,83 CT10 (130°C, 30 ml/ phút) 4,06 ± 0,10 12,37 ± 0,75 0,25 ± 0,005 28,73 ± 1,62 150,86 ± 2,99 95,27 ± 1,89 84,71 CT8 (140°C, 30 ml/ phút) 3,75 ± 0,13 12,83 ± 0,14 0,23 ± 0,007 27,96 ± 1,28 149,08 ± 2,38 94,15 ± 1,51 79,68 CT11 (150°C, 40 ml/ phút) 3,64 ± 0,06 12,23 ± 0,46 0,22 ± 0,006 30,69 ± 1,04 141,58 ± 3,79 89,41 ± 2,39 75,10 Bảng 3.26 cho thấy: Khi phun sấy ở nhiệt độ 120 - 150°C với 3 mức tốc độ cấp dịch là 20, 30, 40 ml/phút thì đều tạo thành dạng sản phẩm là bột khô, tơi với độ ẩm thấp (< 5%), nhưng có xu hướng làm giảm độ ẩm khi tăng nhiệt độ phun sấy. Tính hút ẩm của sản phẩm ít có sự khác biệt, chỉ riêng mẫu CT9 là hơi thấp còn lại là khá tương đương nhau. Khối lượng riêng biểu kiến của sản phẩm có xu hướng cao hơn khi phun ở nhiệt độ và tốc độ cấp dịch thấp hơn. CI đều trong khoảng 26 - 31, nghĩa là các bột đều ở mức kém trơn chảy khi đánh giá theo USP 41. Hàm lượng SPN, hiệu suất thu hồi SPN và hiệu suất phun sấy có xu hướng giảm khi tăng nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch. Từ kết quả trên cho thấy khi phun sấy với điều kiện như mẫu CT9 và CT10 cho sản phẩm có xu hướng tốt hơn, hiệu suất cao hơn mẫu CT8 và CT11. Trong đó nên chọn điều kiện ở CT10 vì có tốc độ phun sấy cao hơn nên rút ngắn được thời gian. 85 - Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn trong dịch phun: Tiến hành phun sấy với các điều kiện giống CT10 nhưng chỉ khác nhau về tỷ lệ CR/DP. Thiết kế điều kiện khảo sát được trình bày ở bảng 3.27. Bảng 3.27. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun Mẫu Cao 3:1 Tỷ lệ Chất rắn/cao Tá dược Tỷ lệ TD/CR Tỷ lệ CR/DP Nhiệt độ phun sấy Tốc độ cấp dịch CT10 100 g 25,24% Aer 30% 10% 130°C 30 ml/ phút CT12 12% CT13 14% CT14 16% Kết quả khảo s át ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn trong dịch phun được thể hiện ở bảng 3.28. Bảng 3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun đến phun sấy cao Đu đủ rừng (TB ± SD), n=3, p<0,05 Mẫu Độ ẩm (%) Tính hút ẩm (%) KLRbk (g/ml) CI Hàm lượng SPN (mg/g) HS thu hồi SPN (%) HSPS (%) CT10 (Aer 10%) 4,06 ± 0,10 12,37 ± 0,75 0,25 ± 0,005 28,73 ± 1,62 150,86 ± 2,99 95,27 ± 1,89 84,71 CT12 (Aer 12%) 3,73 ± 0,09 12,09 ± 0,46 0,27 ± 0,007 26,07 ± 1,45 151,41 ± 5,72 95,62 ± 3,61 85,77 CT13 (Aer 14%) 3,65 ± 0,13 11,37 ± 0,14 0,30 ± 0,012 24,19 ± 1,25 150,16 ± 3,79 94,83 ± 2,40 86,44 CT14 (Aer 16%) 3,62 ± 0,15 11,20 ± 0,31 0,33 ± 0,008 23,43 ± 1,37 152,29 ± 5,82 96,18 ± 3,68 81,47 Bảng 3.28 cho thấy: Khi tăng tỷ lệ CR/DP có xu hướng làm giảm độ ẩm, tính hút ẩm và CI. Tuy nhiên, độ ẩm và tính hút ẩm của sản phẩm đều ở mức thấp. CI ở công thức CT13 và CT14 giảm xuống dưới 25, nghĩa là bột ở mức trơn chảy được, còn công thức CT10 và CT12 ở mức kém trơn chảy. Khi phun sấy với tỷ lệ chất rắn trong dịch phun ở khoảng 10 - 16% thì hàm lượng 86 SPN, hiệu suất thu hồi SPN và hiệu suất phun sấy ở các mẫu cơ bản là tương đương nhau, tuy chỉ có mẫu CT14 với tỷ lệ CR/DP là 16% thì hiệu suất phun sấy hơi giảm nhẹ. Như vậy, khi tăng tỷ lệ CR/DP hầu như không ảnh hưởng đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi SPN nhưng lại có xu hướng cải thiện về độ ẩm, tính hút ẩm, khả năng trơn chảy. Nhưng khi tăng tỷ lệ CR/DP lên cao quá sẽ làm dịch phun sấy nhớt hơn, có nguy cơ khó phân tán dịch phun đồng nhất và khó hình thành giọt lỏng nên làm giảm hiệu suất phun sấy. Như vậy, tỷ lệ CR/DP thích hợp nhất là từ 14 - 16%. Tuy nhiên, để thống nhất cho các giai đoạn bào chế sau và để tăng hiệu suất phun sấy, tỷ lệ CR/DP được lựa chọn là 14%. - Tóm tắt thông số qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy Từ các kết quả khảo sát ở trên đã lựa chọn được công thức và thông số của qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy (Bảng 3.29). Bảng 3.29. Công thức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phun sấy STT Tên thông số Thông số 1 Dịch phun sấy Cao lá ĐĐR (3:1) phối hợp thêm tá dược 2 Tá dược phun sấy Aer 3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% 4 Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2ºC 5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 6 Tỷ lệ chất rắn trong dịch phun 14% 7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar Qui trình bào chế cao khô lá ĐĐR được trình bày ở phụ lục 4, tóm tắt như sau: 87 Hình 3.12. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn điều chế cao lá Đu đủ rừng 3:1 Dịch chiết ĐĐR 1+2 Chiết siêu âm lần 1 Dịch chiết ĐĐR 1 Dịch chiết ĐĐR 2 Bã ĐĐR 2 Bã ĐĐR 1 Chiết siêu âm lần 2 DM/DL = 15ml/1g 700C, 90 phút Cô thu hồi dung môi DM/DL = 15ml/1g 700C, 90 phút EtOH thu hồi Cao ĐĐR 3:1 Phần dịch lỏng 1 Phần cắn 1 EtOH 96º Phần dịch lỏng 2 Phần cắn 2 Để lắng, gạn Để lắng, gạn Cao ĐĐR 3:1 Cô thu hồi dung môi EtOH 50º Gạn, lọc Gạn, lọc Kiểm nghiệm: - Hàm lượng SPN: 165 - 245 mg/g - Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30% Bột lá ĐĐR Đạt TCCS 88 Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô lá Đu đủ rừng 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG 3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ rừng Sau khi xây dựng được qui trình chiết xuất và bào chế cao khô lá ĐĐR bằng phương pháp phun sấy. Tiến hành chiết xuất 3 lô (mỗi lô 2 mẻ chiết, mỗi mẻ 2 kg dược liệu); sau đó cô đặc, loại tạp điều chỉnh về cao 3:1 rồi phun sấy thành 3 lô riêng, mỗi lô thu được 1200 g cao lỏng 3:1. Cao khô thu được từ 3 lô dùng kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng để xây dựng TCCS và đánh giá độ ổn định. Một số chỉ tiêu chất lượng được tiến hành đánh giá như đã mô tả ở mục 2.2.3.1, kết quả thu được như sau: - Tính chất: Khối bột khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị hơi đắng, mùi đặc trưng của ĐĐR. Dịch phun sấy Cao khô lá ĐĐR Đóng gói Cao ĐĐR 3:1 Phun sấy Nhiệt độ đầu vào 130 ± 20C Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar. - Thêm Aer, nước: tỷ lệ Aer 30% so với chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%; - Khuấy đều đồng nhất Cấp dịch phun (30ml/phút) Kiểm nghiệm theo TCCS 89 Hình 3.14. Kết quả chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) của bột cao khô lá Đu đủ rừng 90 Kết quả chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy: Bột cao khô lá ĐĐR có kích thước chủ yếu trong khoảng 10 - 20 µm, hình dạng gần cầu, bề mặt nhăn nheo, một số ít tiểu phân to bị vỡ tạo thành hình dạng các mảnh hình cầu. - Mất khối lượng do làm khô: Thực hiện theo DĐVN V, phụ lục 9.6, kết quả được thể hiện ở bảng 3.30 Bảng 3.30. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cao khô lá Đu đủ rừng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mất khối lượng do làm khô (%) (TB ± SD) Lô 1 4,06 3,92 4,07 4,02 ± 0,08 Lô 2 3,87 3,92 4,06 3,95 ± 0,10 Lô 3 4,03 3,77 3,71 3,84 ± 0,17 Như vậy tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của 3 lô cao khô lá ĐĐR là khoảng 4%. Từ kết quả trên, tỷ lệ mất khối lượng do làm khô được đề xuất trong TCCS của cao khô lá ĐĐR là: không quá 5%. - Tro toàn phần: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.8, xác định hàm lượng tro toàn phần của cao khô lá ĐĐR, kết quả được thể hiện ở bảng 3.31. Bảng 3.31. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của cao khô lá Đu đủ rừng Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Hàm lượng tro toàn phần (%) (TB ± SD) Lô 1 12,69 12,69 12,65 12,68 ± 0,02 Lô 2 12,78 12,84 12,79 12,80 ± 0,03 Lô 3 11,38 11,77 12,01 11,72 ± 0,32 Như vậy lượng tro toàn phần của 3 lô cao trong khoảng 11,72 đến 12,80% so với khối lượng cao khô. Từ kết quả trên, chỉ tiêu tro toàn phần được đề xuất xây dựng TCCS của cao khô lá ĐĐR: Không quá 15%. - Giới hạn kim loại nặng: Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng cho thấy các chỉ tiêu kim loại nặng: Pb, Cd, As, Hg trong cả 3 lô khô lá ĐĐR đều dưới mức phá t hiện của máy. 91 Kết hợp với tham khảo DĐVN V qui định tiêu chuẩn kim loại nặng cho các đối với các cao dược liệu, chỉ tiêu giới hạn được đề xuất cho các kim loại nặng là As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg. - Giới hạn nhiễm khuẩn: Tiến hành thử theo DĐVN V, phụ lục 13.6 – “Thử giới hạn nhiễm khuẩn”, phương pháp đĩa thạch, kết quả được trình bày ở bảng 3.32 sau: Bảng 3.32: Kết quả thử độ nhiễm khuẩn của cao khô lá đu đủ rừng Lô Độ nhiễm khuẩn Vi khuẩn (số vi khuẩn/g) Nấm mốc (số khuẩn lạc/g) Vi khuẩn gây bệnh 1 187 24 Không có 234 29 Không có 213 21 Không có TB ± SD 211 ± 24 25 ± 4 Không có 2 198 19 Không có 192 23 Không có 223 20 Không có TB ± SD 204 ± 16 21 ± 2 Không có 3 172 17 Không có 210 25 Không có 201 18 Không có TB ± SD 194 ± 20 20 ± 4 Không có Như vậy độ nhiễm khuẩn của 1g mẫu cao khô lá ĐĐR như sau: số vi khuẩn từ 194 đến 211 ở các lô, số nấm mốc từ 20 đến 25 ở các lô khác nhau, không có các vi khuẩn gây bệnh E. coli, P. aeruginosa, Salmonella. - Định tính: bằng phương pháp TLC Tiến hành sắc ký như trong phần mô tả phương pháp phần 2.2.2.1 trang 46, kết quả được thể hiện trong hình 3.15 cho thấy, sắc ký đồ của 3 mẫu cao 92 khô lá ĐĐR thu được ở 3 lô đều có vết của AO. So sánh với hình 3.9 ta thấy sắc ký đồ của các mẫu cao khô lá ĐĐR tương tự như trong phần dược liệu. Tuy nhiên, các vết màu ở cao khô lá ĐĐR ít hơn nhiều so với dược liệu và màu của AO đậm hơn. Như vậy, yêu cầu là chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của A O bằng TLC. Mẫu cao lô 1 Mẫu cao lô 2 Mẫu cao lô 3 A B A B A B Chú thích: A: Hiện màu bằng dung dịch vanilin/acid sullfuric rồi quan sát ở ánh sáng thường. B: Hiện màu bằng dung dịch vanilin/acid sullfuric rồi quan sát ở ánh sáng UV 365 nm. 1: Cao khô lá ĐĐR 2: Acid oleanolic Hình 3.15. Hình ảnh TLC của cao khô lá Đu đủ rừng - Định lượng: + Định lượng SPN trong cao khô ĐĐR bằng UV-Vis: Chuẩn bị dung dịch thử theo phương pháp đã mô tả ở phần 2.2.2.1 trang 46; tiến hành trên mẫu cao khô của 3 lô, mỗi lô làm song song 3 mẫu; tiến hành định lượng SPN trong cao khô ĐĐR bằng UV-Vis theo phương pháp đã thẩm định, kết quả được thể hiện trong bảng 3.33. 93 Bảng 3.33. Hàm lượng saponin toàn phần trong cao khô lá Đu đủ rừng Lô Mẫu KL cân (mg) Hàm ẩm (%) Thể tích (ml) A HSPL C (µg/ml) SPN (mg/g) 1 1 102,6 3,65 50 0,376 50 5,84 148,32 2 105,4 50 0,403 50 6,20 153,29 3 105,9 50 0,412 50 6,32 155,52 TB ± SD 152,38 ± 3,69 2 1 105,7 3,95 50 0,383 50 5,94 146,17 2 113,2 50 0,427 50 6,52 149,99 3 109,5 50 0,383 50 5,94 141,10 TB ± SD 145,75 ± 4,46 3 1 105,7 3,84 50 0,405 50 6,23 153,22 2 113,2 50 0,433 50 6,60 151,65 3 112,6 50 0,416 50 6,38 147,22 TB ± SD 152,44 ± 1,11 Như vậy, cao khô của 3 lô ĐĐR chứa khoảng 145,75 đến 152,44 mg/g SPN tính theo AO trong chế phẩm khô kiệt. Từ kết quả trên, hàm lượng SPN được đề xuất trong TCCS chế phẩm phải không thấp hơn 100 mg/g và không quá 200 mg/g tính theo AO trong chế phẩm khô kiệt. + Định lượng AO trong cao khô ĐĐR bằng HPLC: Chuẩn bị dung dịch thử theo phương pháp đã mô tả ở phần 2.2.2.1 trang 47; tiến hành trên 3 mẫu cao khô của 3 lô, mỗi lô làm song song 3 mẫu; tiến hành định lượng A O trong cao khô ĐĐR bằng HPLC theo phương pháp đã mô tả, kết quả được thể hiện trong bảng 3.34. 94 Bảng 3.34. Hàm lượng acid oleanolic trong cao khô lá Đu đủ rừng Lô Mẫu KL cân (mg) Hàm ẩm (%) Thể tích (ml) Spic HSPL C (µg/ml) Hàm lượng AO (mg/g) 1 1 105,6 3,65 25 427890 1 38,43 9,48 2 101,4 25 424720 1 38,15 9,80 3 102,9 25 414889 1 37,27 9,43 TB ± SD 9,57 ± 0,20 2 1 102,5 3,95 25 414253 1 37,22 9,45 2 104,2 25 402394 1 36,16 9,03 3 99,5 25 398767 1 35,84 9,38 TB ± SD 9,29 ± 0,22 3 1 103,5 3,84 25 439203 1 39.43 9.90 2 102,4 25 421309 1 37.84 9.61 3 99,4 25 402876 1 36.21 9.47 TB ± SD 9,66 ± 0,22 Như vậy, hàm lượng AO trong cao khô lá ĐĐR của 3 lô từ 9,29 đến 9,66 mg/g tính theo khô kiệt khi định lượng bằng phương pháp HPLC. Từ kết quả trên, hàm lượng AO được đề xuất trong TCCS chế phẩm phải không thấp hơn 7,5 mg/g và không q uá 12,5 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt. - Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao khô lá ĐĐR: từ các kết quả kiểm nghiệm trên, chúng tôi đưa ra TCCS cho cao khô lá ĐĐR chi tiết trong phụ lục 3.2, tóm tắt trong bảng 3.35 như sau: 95 Bảng 3.35. Tóm tắt các chỉ t iêu chất lượng trong tiêu chuẩn cơ sở cao lá Đu đủ rừng TIÊU CHÍ YÊU CẦU 1. Tính chất: Khối bột khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị đắng, mùi đặc trưng. 2. Mất khối lượng do làm khô Không quá 5% 3. Tro toàn phần Không quá 15,0% 4. Giới hạn kim loại nặng Phương pháp AAS As ≤ 1,0 mg/kg Cd ≤ 1,0 mg/kg Hg ≤ 0,1 mg/kg Pb ≤ 3,0 mg/kg 5. Độ nhiễm khuẩn Phương pháp đĩa thạch Đạt mức 4, DĐVN V - Phụ lục 13.6 - “Thử giới hạn nhiễm khuẩn” 6. Định tính acid oleanolic Phương pháp TLC Phải có phản ứng định tính của acid oleanolic. 7. Định lượng Phương pháp UV – VIS Phương pháp HPLC Hàm lượng SPN không thấp hơn 100 mg/g và không quá 200 mg/g tính theo AO trong chế phẩm khô kiệt. Hàm lượng AO không thấp hơn 7,5 mg/g và không quá 12,5 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt 3.2.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng Đánh giá độ ổn định của cao khô lá ĐĐR của 3 lô ở điều kiện lão hóa cấp tốc và thử nghiệm dài hạn (mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần) theo phương pháp ghi ở mục 2.2.2.2 trang 47, kết quả nghiên cứu độ ổn định cho thấy: 3.2.2.1. Về tính chất: Sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn và sau 6 tháng lão hoá cấp tốc không nhận thấy có sự biến đổi đáng kể nào về hình thức, màu sắc, mùi vị: cao khô ĐĐR vẫn khô tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị đắng, mùi đặc trưng. 96 Bảng 3.36. Sự thay đổi độ ẩm, độ nhiễm khuẩn, hàm lượng saponin toàn phần và hàm lượng acid oleanolic của 3 lô theo thời gian bảo quản (TB ± SD, n=3, p<0,05) Thời gian bảo quản (tháng) Độ ẩm (%) Độ nhiễm khuẩn Hàm lượng SPN (mg/g) Hàm lượng AO (mg/g) Vi khuẩn (số vi khuẩn/g) Nấm mốc (số khuẩn lạc/g) Vi khuẩn gây bệnh Lô 1 - 0 tháng 4,0 ± 0,1 211 ± 24 25 ± 4 Không có 144,3 ± 2,7 9,1 ± 0,2 Lô 2 - 0 tháng 3,9 ± 0,1 204 ± 16 21 ± 2 Không có 148,0 ± 1,7 9,2 ± 0,2 Lô 3 - 0 tháng 3,8 ± 0,2 194 ± 20 20 ± 4 Không có 152,4 ± 4,6 9,4 ± 0,2 Ở điều kiện lão hóa cấp tốc Lô 1 - 3 tháng 4,1 ± 0,1 - 139,7 ± 3,3 8,9 ± 0,3 Lô 2 - 3 tháng 4,1 ± 0,1 - 149,4 ± 4,1 8,8 ± 0,1 Lô 3 - 3 tháng 4,0 ± 0,1 - 146,7 ± 1,3 9,0 ± 0,1 Lô 1 - 6 tháng 4,2 ± 0,1 212 ± 22 21 ± 3 Không có 138,7 ± 2,8 8,7 ± 0,1 Lô 2 - 6 tháng 4,1 ± 0,1 208 ± 16 22 ± 2 Không có 140,9 ± 0,3 8,6 ± 0,4 Lô 3 - 6 tháng 4,0 ± 0,1 190 ± 21 24 ± 4 Không có 145,2 ± 1,9 8,8 ± 0,1 Ở điều kiện dài hạn Lô 1 - 3 tháng 4,1 ± 0,0 - 143,9 ± 3,6 8,8 ± 0,2 Lô 2 - 3 tháng 3,9 ± 0,1 - 140,6 ± 3,3 8,9 ± 0,2 97 Thời gian bảo quản (tháng) Độ ẩm (%) Độ nhiễm khuẩn Hàm lượng SPN (mg/g) Hàm lượng AO (mg/g) Vi khuẩn (số vi khuẩn/g) Nấm mốc (số khuẩn lạc/g) Vi khuẩn gây bệnh Lô 3 - 3 tháng 3,9 ± 0,1 - 147,4 ± 1,9 8,9 ± 0,2 Lô 1 - 6 tháng 4,1 ± 0,1 - 143,9 ± 5,4 8,8 ± 0,4 Lô 2 - 6 tháng 4,1 ± 0,1 - 144,6 ± 2,7 8,6 ± 0,2 Lô 3 - 6 tháng 4,0 ± 0,1 - 148,4 ± 0,7 8,7 ± 0,3 Lô 1 - 9 tháng 4,2 ± 0,1 - 136,1 ± 1,8 8,7 ± 0,1 Lô 2 - 9 tháng 4,1 ± 0,1 - 139,2 ± 1,7 8,8 ± 0,2 Lô 3 - 9 tháng 4,1 ± 0,2 - 146,6 ± 4,1 8,5 ± 0,1 Lô 1 - 12 tháng 4,2 ± 0,1 208 ± 22 21 ± 3 Không có 136,0 ± 0,5 8,5 ± 0,1 Lô 2 - 12 tháng 4,2 ± 0,1 200 ± 18 25 ± 3 Không có 140,7 ± 3,3 8,4 ± 0,3 Lô 3 - 12 tháng 4,3 ± 0,2 198 ± 19 22 ± 3 Không có 145,6 ± 0,9 8,6 ± 0,2 98 3.2.2.2. Về tỷ lệ mất khối lượng do làm khô: Bảng 3.36 cho thấy: sự thay đổi về tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của cao ĐĐR trong 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn và sau 6 tháng lão hoá cấp tốc thay đổi từ 3,9 đến 4,2 %, đạt theo TCCS của chế phẩm là < 5%. 3.2.2.3. Về độ nhiễm khuẩn: Kết quả tiến hành phân tích thời điểm đầu và thời điểm 6 tháng lão hóa cấp tốc và 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn, thể hiện ở bảng 3.36 cho thấy: số vi khuẩn từ 194 đến 212 ở các lô, số nấm mốc từ 20 đến 25 ở các lô khác nhau, không có các vi khuẩn gây bệnh E. coli, P. aeruginosa, Salmonella; đạt theo TCCS của chế phẩm. 3.2.2.4. Về giới hạn kim loại nặng: Kết quả tiến hành phân tích thời điểm đầu và thời điểm 6 tháng lão hóa cấp tốc và 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn, kết quả phân tích đều cho kết quả định lượng As, Cd, Hg, Pb đều ở dưới mức phát hiện của máy, đạt theo TCCS của chế phẩm. 3.2.2.5. Về giới hạn nhiễm khuẩn: Kết quả tiến hành phân tích thời điểm đầu và thời điểm 6 tháng lão hóa cấp tốc và 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn thể hiện ở bảng 3.36 cho thấy: kết quả phân tích đều cho kết quả đạt mức 4 - DĐVN V- phụ lục 13.6, đạt theo TCCS của chế phẩm. 3.2.2.6. Về định tính: Kết quả tiến hành phân tích thời điểm đầu và thời điểm 6 tháng lão hóa cấp tốc và 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn, kết quả phân tích thể hiện qua hình 3.16 99 1. Thời điểm ban đầu Lô 1-A Lô 1-B Lô 2-A Lô 2-B Lô 3-A Lô 3-B 2. Thời điểm sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tố c Lô 1-A Lô 1-B Lô 2-A Lô 2-B Lô 3-A Lô 3-B 3. Thời điểm sau 12 tháng ở điều kiện dài hạn Lô 1-A Lô 1-B Lô 2-A Lô 2-B Lô 3-A Lô 3-B Chú thích: A: Hiện màu bằng dung dịch vanilin/acid sullfuric rồi quan sát ở ánh sáng thường. B: Hiện màu bằng dung dịch vanilin/acid sullfuric rồi quan sát ở ánh sáng UV 365 nm. 1: Cao khô lá ĐĐR; 2: Nguyên liệu lá; 3: AO Hình 3.16. Hình ảnh TLC trong theo dõi độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng 100 Trên sắc ký đồ của mẫu cao khô lá Đu đủ rừng (1) có các vết trùng với mẫu lá nguyên liệu (2) và có vết của AO (3) trùng với mẫu chuẩn với cùng giá trị Rf. Thể hiện phép thử định t ính của AO, đạt theo TCCS của chế phẩm. 3.2.2.7. Về định lượng: Kết quả ở bảng 3.36 cho thấy: - Hàm lượng SPN trong chế phẩm không giảm nhiều trong 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn và sau 6 tháng lão hoá cấp tốc; thay đổi từ 152,4 đến 136,0 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt; đạt theo TCCS của chế phẩm. - Hàm lượng AO trong chế phẩm không giảm nhiều trong 12 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn và sau 6 tháng lão hoá cấp tốc; thay đổi từ 9,4 đến 8,4 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt; đạt theo TCCS của chế phẩm. Như vậy, tất cả các tiêu chí đánh giá sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc và 12 tháng ở điều kiện dài hạn đều đạt theo tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm. Mẫu của 3 lô tại thời điểm ban đầu, 6 tháng lão hóa cấp tốc và 12 tháng dài hạn đều được kiểm nghiệm tại Trung tâm kiểm nghiệm Hà Nội và kết quả đều đạt TCCS (Phụ lục 3.4). Căn cứ vào kết quả nghiên cứu đã xác định được chế phẩm có độ ổn định ít nhất là 12 tháng. 3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng 3.3.1.1. Các thông số chung đánh giá tình trạng miễn dịch - Khối lượng lách tương đối và khối lượng tuyến ức tương đối: So sánh khối lượng lách tương đối (KLLTĐ) và khối lượng tuyến ức tương đối (KLTƯTĐ) giữa các lô chuột: + Ảnh hưởng của thuốc thử lên KLLTĐ: được thể hiện trong bảng 3.37 như sau: 101 Bảng 3.37. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng lách tương đối Lô n KLLTĐ (TB± SE, (‰)) Lô 1: Chứng sinh học 8 8,87 ± 0,73 Lô 2: Mô hình Cyc 8 14,89 ± 1,08 p < 0,01 so với lô chứng Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 7,61 ± 0,88 p < 0,01 so với lô mô hình Lô 4: Cao khô lá ĐĐR 400 mg/kg 8 8,05 ± 1,47 p < 0,01 so với lô mô hình Lô 5: Cao khô lá ĐĐR 800 mg/kg 8 11,73 ± 2,01 p < 0,01 so với lô mô hình Kết quả trình bày ở bảng 3.37 cho thấy: Cyc làm tăng rõ rệt tỷ lệ KLLTĐ so với lô chứng sinh học, có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Levamis ol có tác dụng làm giảm KLLTĐ một cách có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Cao khô lá ĐĐR ở cả hai liều đều giảm so với lô mô hình, tuy nhiên mức độ giảm rõ rệt hơn xảy ra ở lô uống cao khô lá ĐĐR liều 400 mg/kg (p < 0,01). + Ảnh hưởng của thuốc thử lên KLTƯTĐ: được thể hiện trong bảng 3.38 như sau: Bảng 3.38. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng tuyến ức tương đối Lô n KLTƯTĐ (TB± SE, (‰)) Lô 1: Chứng sinh học 8 4,16 ± 0,22 Lô 2: Mô hình Cyc 8 2,39 ± 0,22 p < 0,01 so với lô chứng Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 1,89 ± 0,31 p < 0,01 so với lô mô hình Lô 4: Cao khô lá ĐĐR 400 mg/kg 8 1,12 ± 0,33 p < 0,01 so với lô mô hình Lô 5: Cao khô lá ĐĐR 800 mg/kg 8 2,13 ± 0,16 p > 0,05 so với lô mô hình 102 Kết quả ở bảng 3.38 cho thấy: Cyc làm giảm rõ rệt tỷ lệ KLTƯTĐ so với lô chứng sinh học có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Levamisol làm giảm KLTƯTĐ s o với lô mô hình (p < 0,01). Cao khô lá ĐĐR ở cả hai liều đều giảm KLTƯTĐ so với lô mô hình, tuy nhiên sự khác biệt có ý nghĩa thống kê chỉ xảy ra ở lô uống cao khô lá ĐĐR liều 400 mg/kg (p < 0,01). - Số lượng bạch cầu: Ảnh hưởng của thuốc thử lên số lượng bạch cầu (BC) của chuột được thể hiện trong bảng 3.39 như sau: Bảng 3.39. Ảnh hưởng của thuốc thử lên số lượng bạch cầu Lô n Số lượng BC (TB ± SE, G/l) Lô 1: Chứng sinh học 8 2,26 ± 0,13 Lô 2: Mô hình Cyc 8 1,21 ± 0,17 p < 0,01 so với lô chứng Lô 3: Chứng dương levamisol 100 mg/kg 8 2,91 ± 0,33 p < 0,01 so với lô mô hình Lô 4: Cao khô lá ĐĐR 400 mg/kg 8 1,79 ± 0,16 p < 0,01 so với lô mô hình Lô 5: Cao khô lá ĐĐR 800 mg/kg 8 0,79 ± 0,10 Kết quả trình bày ở bảng 3.39 cho thấy: Cyc làm giảm rõ rệt số lượng BC so với lô chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01. Levamis ol có tác dụng làm tăng số lượng BC so với lô mô hình và có ý nghĩa thống kê; Cao khô lá ĐĐR liều 400 mg/kg làm tăng số lượng BC ngoại vi so với lô mô hình có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Tuy nhiên, cao khô lá ĐĐR liều 800 mg/kg lại làm giảm số lượng BC so với lô mô hình. - Số lượng công thức BC lympho và BC trung tính: Ảnh hưởng của thuốc thử lên số lượng BC ly