Luận án Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium - Nguyễn Thị Minh Hằng

Hình 3.9. Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP (A): PCR nhân đoạn gen gp5ecto và gen m. (B): PCR nhân gen gp5ecto-m. (C): Colony - PCR nhân đoạn gen 35S-SP-gp5ecto-m với cặp mồi 35S-SQF và 35S-Term từ khuẩn lạc: (+) Đối chứng dương (pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP); (-) Đối chứng âm (H2O); 1-10 tương ứng với 10 dòng khuẩn lạc lấy ngẫu nhiên. (D): Sản phẩm cắt vector pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP bằng NcoI và BamHI; M: maker 1 kb. Vector tái tổ hợp pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. Coli DH5α khả biến. Tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP được chọn dòng thông qua Colony-PCR sử dụng cặp mồi (35S-SQF và M-BamHI-R); sản phẩm Colony-PCR thu được là một băng DNA có kích thước khoảng 1 kb (Hình 3.9C), kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết, băng DNA khoảng 1 kb bao gồm đoạn gen gp5ecto-m (717 bp) ghép nối với đoạn promoter 35S-SP (234 bp). Tách chiết và cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI thu được 2 phân đoạn DNA, một phân đoạn DNA có kích thước khoảng 5,5 kb (5051 bp) tương ứng với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP mở vòng và một phân đoạn DNA có kích thước 723 bp tương ứng với đoạn gen gp5ecto-m (717 bp) + 6 bp trình tự cắt của enzyme, đúng theo tính toán lý thuyết (Hình 3.9D). Như vậy, có thể khẳng định rằng đã ghép nối thành công đoạn gen gp5ecto-m vào vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP tạo thành vector tái tổ hợp pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. Hình 3.10. Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto-m mã hoá protein GP5ectoM dung hợp ELP trong vector pRTRA Vector tái tổ hợp pRTRA-35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP được giải trình tự với mồi 35S-SQF/35Sterm cho thấy đã tách dòng và gắn kết thành công đoạn gen gp5ecto-m mã hóa protein GP5ectoM của virus PRRS với promoter 35S, Cmyc và His-tag, ELP (Hình 3.10). 3.1.3.2. Tạo vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m -Histag-Cmyc-100xELP Kết quả cắt vector pRTRA-35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP và vector pCB301 bằng enzyme HindIII, thu được phân đoạn DNA mang cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP có kích thước khoảng 3,2 kb và khung vector pCB301 mở vòng có kích thước khoảng 5,5 kb. Sau đó, khung vector pCB301 được ghép nối với cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP tạo vector chuyển gen pCB301-35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP và biến nạp vào tế bào E.coli DH5α. Tách chiết plasmid tái tổ hợp và kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn HindIII; kết quả (Hình 3.11A) thu được 2 phân đoạn DNA theo đúng tính toán lý thuyết của khung vector pCB301 (5508 bp) và cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP (3191 bp). Để chọn lọc dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen có cassette đảo chiều, các plasmid tái tổ hợp cho kết quả dương tính (cho đúng kích thước theo tính toán lý thuyết khi cắt với enzyme HindIII) được xử lý với enzyme NcoI. Kết quả xử lý các plasmid tái tổ hợp với enzyme NcoI (Hình 3.11B) cho thấy thu được 2 phân đoạn DNA theo đúng kích thước tính toán lý thuyết tương ứng là 4876 bp và 3823 bp (cassette đảo chiều) và 7113 bp và 1586 bp (cassette xuôi chiều). Hình 3.11. Kết quả phân tích kiểm tra vector chuyển gen mang gen gp5ecto-m mã hóa kháng nguyên GP5ecto-M dung hợp ELP (A): Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII, M: Marker 1 kb; 1-2: pCB301 tái tổ hợp bằng HindIII. (B): Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301 tái tổ hợp bằng NcoI, M: Marker 1 kb; 1i.﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽ii.﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽i.﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽.﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽: Vector pCB301 tái tổ hợp mang cassette gen gp5ecto-m xuôi chiều so với cassette gen nptIII; 2-4: Vector pCB301 tái tổ hợp mang cassette gen gp5ecto-m đảo chiều so với cassette gen nptIII. C: Sơ đồ vector pCB301 mang cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều với cassete Nos pro-nptIII-Nos ter. D: Đoạn T-DNA mang cassete gen chuyển đảo chiều. Dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen pCB301 có cassette 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều so với cassette gen kháng kháng sinh (NOS pro-nptIII-NOS ter) được dùng để biến nạp vào chủng A. tumefacines C58C1 phục vụ cho thí nghiệm biểu hiện tạm thời. Kết quả thu được cho thấy đã thiết kế thành công vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. Sơ đồ vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP đảo chiều được thể hiện ở hình 3.11C, D. 3.1.3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen pCB301 35S- gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP Hình 3.12. Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A. tumefaciens mang vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. M: Marker 1 kb; 1 - 3 tương ứng với sản phẩm PCR nhân đoạn gen gp5ecto-m từ 3 dòng khuẩn lạc kiểm tra; (+) Đối chứng dương (pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP); (-) đối chứng âm (H2O). Vector chuyển gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP được biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Sau đó, dịch tế bào vi khuẩn được nuôi trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc nên chỉ những dòng tế bào mang vector chuyển gen mới có thể hình thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Để khẳng định chắc chắn các dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen, chọn ngẫu nhiên 3 dòng khuẩn lạc để kiểm tra bằng kỹ thuật Colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu (GP5ecto-NcoI-F và M-BamHI-R) nhân đoạn gen gp5ecto-m. Kết quả PCR thu được cho thấy cả 3 dòng khuẩn lạc kiểm tra có một băng vạch DNA duy nhất với kích thước là 733 bp đúng kích thước tính toán lý thuyết nhân gen gp5ecto-m (Hình 3.12). Như vậy, đã tạo thành công chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector chuyển gen gen pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. Từ các kết quả nghiên cứu đạt được, có thể khẳng định đã thiết kế thành công 3 cấu trúc vector chuyển gen, bao gồm: pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP và tạo thành công các chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58C1 mang vector chuyển gen tương ứng. Các chủng vi khuẩn này sẽ được sử dụng để biến nạp vào lá thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhằm biểu hiện tạm thời các gen m, gp5opt và gp5ecto-m trong mô lá thuốc lá; tách chiết các protein, tinh sạch và thử đáp ứng miễn dịch trong động vật, hướng tới làm vaccine kháng virus PRRS. 3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M -ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N. benthamiana Nghiên cứu biểu hiện tạm thời các gen mã hoá protein nói chung và kháng nguyên tái tổ hợp (M, GP5, GP5ectoM của PRRSV dung hợp ELP) nói riêng ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium còn khá mới mẻ ở Việt Nam. Quy trình biểu hiện gen tạm thời trong tế bào thực vật được thực hiện không phức tạp nhưng hiệu quả biểu hiện gen lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: Nồng độ chất dẫn dụ acetone syringone (AS), mật độ vi khuẩn Agrobacterium (giá trị OD600) sử dụng cho xâm nhiễm, tuổi của lá, tuổi của cây tiến hành xâm nhiễm, thời gian biểu hiện tạm thời, sự câm gen ở thực vật v.v. Vì vậy, việc tiến hành xác định các điều kiện tối ưu cho biểu hiện tạm thời gen mã hoá cho từng loại kháng nguyên tái tổ hợp là rất cần thiết để biểu hiện một cách hiệu quả các gen mã hoá kháng nguyên quan tâm. Để đánh giá mức độ hoạt động của vector mang gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein 2b CMV, HcPro PVY ức chế câm gen hoạt động dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S; thí nghiệm không sử dụng vector hỗ trợ và sử dụng vector hỗ trợ đã được thực hiện đồng thời. Sử dụng các chủng A. tumefaciens mang các vector trên. Thu lá cây thuốc lá sau 3, 4, 5 và 6 ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số. Sự biểu hiện của các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được đánh giá bằng phương pháp lai miễn dịch Western blot (Hình 3.13). Kết quả thu được (Hình 3.13) cho thấy vạch băng màu nâu có trọng lượng phân tử khoảng 66 kDa ở các giếng 3, 4, 5, 6 đúng với trọng lượng phân tử của các kháng nguyên tái tổ hợp tương ứng M-ELP (66 kDa) do cassette gen 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP mã hóa, theo tính toán lý thuyết; GP5ectoM-ELP (71 kDa) do cassette gen 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP mã hóa, theo tính toán lý thuyết. Riêng băng tương ứng với kháng nguyên GP5-ELP do cassette gen 35S-gp5-Histag-Cmyc-100xELP mã hóa, đã thu được 2 băng có kích thước lần lượt là khoảng 65 kDa và 95 kDa. Băng tương đương với kích thước khoảng 95 kDa của GP5-ELP là cao hơn so với trọng lượng phân tử tính toán lý thuyết của kháng nguyên GP5 dung hợp với ELP. Điều này có thể là do GP5 đã bị glycosyl hóa sau dịch mã trong tế bào thực vật. 3.2.1. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ Như vậy, các gen m, gp5opt, gp5ecto-m mã hóa cho kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP đã được biểu hiện thành công trong lá cây thuốc lá dưới sự điều khiển của promoter 35S. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện thông qua độ đậm của các băng protein khi so sánh bằng phần mềm Image J cho thấy sự biểu hiện của các kháng nguyên là thấp nhất khi không sử dụng vector hỗ trợ để đồng biến nạp. Trong khi đó, mức độ biểu hiện của kháng nguyên ở tất cả các thí nghiệm có sử dụng vector hỗ trợ là cao hơn hẳn, đặc biệt ở các mẫu lá thu hoạch ngày thứ 5 sau xâm nhiễm Agrobacterium và đạt cao nhất ở ngày thứ 6. Điều này chứng tỏ vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein 2bCMV và Hc-Pro PVY hoạt động tốt và đã giúp tăng cường sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ecto-M trong lá thuốc lá. Trong đó, protein Hc-Pro PVY cho thấy khả năng hỗ trợ tăng cường biểu hiện kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ecto-M tốt hơn so với protein 2b CMV thể hiện ở băng protein đậm hơn (Hình 3.13). Vì vậy, Hc-Pro PVY được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.13. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT-35S-2bCMV và pIBT-35S-HC-Pro PVY đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế quả lai Western sử dụng kháng thể kháng Cmyc (A): M-ELP; (B): GP5-ELP; (C): GP5ectoM-ELP; M: Marker; 3, 4, 5, 6: Protein thu được từ lá sau 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày chuyển gen. 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ AS Acetosyringone (AS) là các hợp chất phenol do tế bào thực vật khi bị thương tiết ra, có vai trò quan trọng trong việc dẫn dụ và cảm ứng hoạt động của nhóm gen gây độc (Virulence region) mã hoá cho các protein/enzyme giúp cho việc chuyển đoạn T-DNA trên Ti-plasmid của vi khuẩn A. tumefaciens sang tế bào thực vật và gắn vào genome. Vì vậy, trong các thí nghiệm chuyển gen hay biểu hiện gen tạm thời ở thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens, AS thường được thêm vào với vai trò là chất cảm ứng hoạt động của nhóm gen gây độc giúp cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhiễm vào cây và thực hiện quá trình chuyển gen. Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc; nồng độ AS sử dụng là 0, 450 µM và 600 µM M: marker. (A): Biểu hiện của kháng nguyên M-ELP; (B): Biểu hiện của kháng nguyên GP5-ELP; (C): Biểu hiện của kháng nguyên GP5ectoM-ELP. Để đánh giá ảnh hưởng của AS đến hiệu quả xâm nhiễm và chuyển gen thông qua sự biểu hiện tạm thời của gen mã hóa kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP, thí nghiệm đã được thiết kế với 3 công thức gồm không bổ sung AS và bổ sung AS với nồng độ 450 µM và 600 µM, sử dụng chủng khuẩn A. tumefaciens mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP hoặc mang vector pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP hoặc mang vector pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP và chủng khuẩn A. tumefaciens chứa vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY. Thu lá cây thuốc lá sau 6 ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số và kiểm tra mức độ biểu hiện protein đích bằng lai Western blot (Hình 3.14). Kết quả lai Western blot cho thấy nồng độ AS có ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ecto-M-ELP. Các băng màu nâu thu được tương ứng với các protein đích đều có kích thước đúng với tính toán lý thuyết (Hình 3.14 A, B, C). Tuy nhiên, khi so sánh độ đậm của các băng protein bằng phần mềm Image J cho thấy, băng thu được ở giếng số 2 tương ứng với nồng độ AS 450 µM là đậm nhất. Điều này chứng tỏ AS ở nồng độ 450 µM có hiệu quả tốt nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP. Sự tăng lượng kháng nguyên có thể là do lượng khuẩn xâm nhiễm và chuyển gen vào tế bào lá cây tăng lên khi có mặt AS. Tuy nhiên, khi nồng độ AS tăng lên đến 600 µM thì biểu hiện của các kháng nguyên tái tổ hợp lại giảm nhẹ, đây có thể là do lượng vi khuẩn được đưa vào cây quá nhiều đã kích hoạt cơ chế hoại tử, sản sinh protease phân hủy protein ngoại lai tích lũy trong tế bào cây. Vì vậy, nồng độ AS để dẫn dụ và cảm ứng vi khuẩn phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP được xác định là 450 µM. 3.2.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens Mật độ tế bào vi khuẩn được xác định bởi giá trị mật độ quang học OD600 của dịch lỏng vi khuẩn có liên quan tới sinh khối tế bào của chúng hay số lượng tế bào trong một thể tích nhất định. Hình 3.15. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc Mật độ vi khuẩn thử nghiệm OD600 = 0,2; 0,5 và 1. (A): Biểu hiện của kháng nguyên M-ELP; (B): Biểu hiện của kháng nguyên GP5-ELP; (C): Biểu hiện của kháng nguyên GP5ectoM-ELP; M: Marker. Trong nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời, việc xác định mật độ vi khuẩn phù hợp, giai đoạn vi khuẩn sinh trưởng mạnh mẽ có ý nghĩa quan trọng đến hiệu quả của chuyển gen. Để xác định nồng độ vi khuẩn phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP, thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 khác nhau, kết hợp với các điều kiện đã được tối ưu trước đó: sử dụng vector hỗ trợ pIBT-35S-HC-Pro PVY, nồng độ AS = 450 µM. Thu lá cây thuốc lá sau 6 ngày biến nạp, tách chiết protein tổng số và lai Western blot để đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời của các gen mã hóa các kháng nguyên quan tâm. Kết quả lai Western blot giữa các protein tái tổ hợp với kháng thể kháng Cmyc thu được như Hình 3.15 và phân tích bằng phần mềm Image J để so sánh mức độ đậm nhạt của băng protein, cho thấy băng đậm nét nhất ở giếng số 2 tương ứng với dịch khuẩn có giá trị OD600 = 0,5. Dịch khuẩn có giá trị OD600 bằng 0,5 đến 1 là giai đoạn mà sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đang ở pha logarit, vi khuẩn tăng nhanh về số lượng cũng như năng lực sinh tổng hợp mạnh mẽ nhất. Từ kết quả này, có thể cho thấy rằng, với mật độ A. tumefaciens OD600 = 0,5 là hoàn toàn phù hợp cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP hiệu quả nhất. 3.2.4. Ảnh hưởng của tuổi của lá Trong thí nghiệm này tiến hành kiểm tra vai trò của tuổi của lá (vị trí của lá trên cây) ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen tạm thời. Quá trình xâm nhiễm dịch khuẩn ở các vị trí lá khác nhau của cây như đã mô tả ở phần phương pháp và được tiến hành với các điều kiện đã được tối ưu bao gồm sử dụng vector hỗ trợ pIBT/HC-Pro PVY, 450 µM AS và với dịch khuẩn có giá trị OD600 = 0,5. Thu các mẫu lá thuốc lá sau 6 ngày chuyển gen, tách chiết protein tổng số và kiểm tra mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp bằng phương pháp lai Western blot. Kết quả thu được trên Hình 3.16, cho thấy ở cả 3 mẫu lá (lá non, lá trưởng thành và lá già) đều xuất hiện băng protein có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết của các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp. Phân tích bằng Western blot bằng phần mềm Image J để so sánh độ đậm nhạt của băng protein, cho thấy băng protein tách chiết từ mẫu lá trưởng thành là đậm nét nhất, sau đó đến băng protein tách chiết từ mẫu lá non và cuối cùng là băng protein tách chiết từ mẫu lá già. Điều này, chứng tỏ vị trí của các lá trên cây thuốc lá có ảnh hưởng đến quá trình biến nạp và biểu hiện gen đích ở mô lá. Khả năng xâm nhập của vi khuẩn mang gen chuyển vào các lá non và lá trưởng thành là những lá ở phần ngọn và phần giữa của cây dễ dàng hơn so với các lá ở sát phần gốc cây. Hình 3.16. Ảnh hưởng của tuổi của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã hoá cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc (A): Biểu hiện của kháng nguyên M-ELP; (B): Biểu hiện của kháng nguyên GP5-ELP; (C): Biểu hiện của kháng nguyên GP5ectoM-ELP; M: Marker, Mẫu lá ở các vị trí lá non (1), lá trưởng thành (2), lá già (3). Kết quả thu được cho vị trí của các lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện gen tạm thời bằng phương pháp thẩm lọc nhờ A. tumefaciens. Lá non và lá trưởng thành là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp. Do đó, để biểu hiện gen tạm thời một cách hiệu quả trên mô lá, các lá già trên cây thuốc lá có thể cần được loại bỏ trước khi biến nạp. 3.2.5. Ảnh hưởng của tuổi cây Để xác định tuổi cây thích hợp cho biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP, cây được lựa chọn ở các độ tuổi khác nhau (3 – 8 tuần tuổi), với sự hỗ trợ của vector pIBT-35S-HC-Pro PVY, AS = 450 µM, mật độ khuẩn sử dụng OD600 = 0,5 đã được tối ưu, lá được biến nạp là lá non và bánh tẻ. Thu các mẫu lá sau 6 ngày biến nạp gen, tách chiết protein tổng số và kiểm tra mức độ biểu hiện các gen mã hóa các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp lai Western blot sử dụng kháng thể kháng Cmyc; kết quả thu được như ở hình 3.17. Hình 3.17. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng cmyc (A): Biểu hiện của protein M-ELP; (B): Biểu hiện của protein GP5-ELP; (C): Biểu hiện của protein GP5ectoM-ELP; M: Marker; 3 - 8: Mẫu lá thu từ cây 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi. Từ kết quả lai Western blot (Hình 3.17) cho thấy lá ở tất cả các độ tuổi của cây (3 - 8 tuần tuổi) sau khi biến nạp đều cho biểu hiện protein tái tổ hợp. Phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J đã cho thấy mức độ đậm của băng protein tăng dần từ các mẫu lá ở cây 3 tuần đến cây 6 tuần tuổi và giảm dần ở cây 7 tuần tuổi, 8 tuần tuổi. Biểu hiện của protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong mô lá của cây thuốc lá 4, 5, 6 tuần tuổi biểu hiện protein tái tổ hợp cao nhất, thể hiện ở băng protein đậm nét nhất trên màng lai và lá của cây 8 tuần tuổi có mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp thấp nhất. Như vậy, cây thuốc lá ở 4 - 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng cho thí nghiệm biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên nghiên cứu. 3.2.6. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịchu kháng , 400 ng, 800, 1000 ng u kháng , 400 ng, 800, 1000 ng u kháng , 400 ng, 800, 1000 ng u kháng , 400 ng, 800, 1000 ng Mức độ biểu hiện gen mã hoá các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N. benthamiana được ước lượng sử dụng protein H5-pII chuẩn đã được định lượng. Nồng độ các protein tổng số được chiết trong đệm SDS được tính toán bằng phản ứng Bradford với đường chuẩn sử dụng protein chuẩn BSA đã được định lượng; 75 µg protein tổng số được bổ sung vào mỗi giếng. Kết quả phân tích cho thấy mức độ biểu hiện của các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP, tương ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.18 và Bảng 3.1). Hình 3.18. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng lai miễn dịch dựa vào protein chuẩn đã được định lượng H5-pII. WT: Đối chứng âm (protein tổng số tách chiết lá thuốc lá N.benthamiana không chuyển gen); M: Marker. Bảng 3.1. So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các protein tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong lá thuốc lá N. benthamiana Loại protein trong dịch chiết thô Tỷ lệ protein hoà tan/protein tổng số (TSP), % Hàm lượng protein trong lá, mg protein/kg lá tươi M-ELP 0,75 52,4 GP5-ELP 0,48 35,0 GP5ecto-M-ELP 0,95 66,8 3.3. Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP Các kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP sau khi biểu hiện trong lá thuốc lá được tiến hành tách chiết và tinh sạch để sử dụng cho thí nghiệm gây miễn dịch trên động vật. Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp đơn giản để tinh sạch protein tái tổ hợp dựa trên sự gắn đuôi ELP vào protein. Sự chuyển pha nghịch đảo của protein gắn ELP phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ muối. Nồng độ muối và nhiệt độ tăng lên dẫn đến sự hình thành các protein không tan và những phân tử protein này sẽ được tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm. Các protein gắn với ELP không tan sẽ được hòa tan trở lại bằng dung dịch đệm lạnh có nồng độ ion thấp. Meyer và cộng sự (2002) phát triển phương pháp tinh sạch này khi quan sát thấy có thể chuyển pha nghịch đảo do sự hình thành các khối kết tụ giữa các protein kích thước nhỏ gắn đuôi ELP và có thể gắn lên màng lọc. Đây là cơ sở để tinh sạch các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng màng lọc dựa trên sự chuyển pha nghịch đảo (mITC). Tuy nhiên, trong quá trình tinh sạch protein qua màng lọc PES 0,22 µm, protein trong dung dịch muối NaCl 2M ở nhiệt độ thường có thể đi được qua được màng và dẫn đến sẽ còn lẫn nhiều protein tạp chưa bị loại bỏ. Vì vậy, protein tạp cần được loại bỏ bằng cách bổ sung PEG 8000 vào dịch chiết chứa protein mục tiêu. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch các protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP được trình bày ở các mục dưới đây. 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên PEG 8000 được bổ sung vào dịch chiết chứa protein tổng số tách chiết từ các mẫu lá N. benthamiana đã được biến nạp các gen mục tiêu trước khi ly tâm với các nồng độ từ 2 - 10% nhằm loại bỏ protein tạp có trong dịch chiết thực vật và thu hồi protein mục tiêu một cách hiệu qủa nhất. Kết quả thu được, được so sánh với đối chứng là dịch chiết không được bổ sung PEG 8000. Lượng cặn thu được sau khi ly tâm được đánh giá bằng cảm quan; dịch chiết protein tổng số thu được sau khi ly tâm được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE nhuộm Comassi blue, protein mục tiêu có trong dịch chiết được kiểm tra bằng lai Western sử dụng kháng thể kháng Cmyc. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch và thu nhận các protein nghiên cứu tương ứng được thể hiện trên các Hình 3.19, Hình 3.20 và Hình 3.21. Kết quả quan sát cảm quan lượng cặn (Hình 3.19A, 3.20A và 3.21A) cho thấy rằng lượng cặn thu được tăng dần khi tăng nồng độ PEG 8000 từ 2 - 12%. Phân tích kết quả lai Western (Hình 3.19B, 3.20B và 3.21B) cho thấy ở tất cả các nồng độ PEG 8000 đều thu được protein mục tiêu tương ứng. Đối với kháng nguyên M-ELP (Hình 3.19B, khi phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J cho thấy rằng, ở nồng độ 2% PEG 8000 và không bổ sung PEG 8000 xuất hiện một băng đặc hiệu nhưng băng mờ, ở nồng độ này vẫn tinh sạch được kháng nguyên M-ELP nhưng do protein tạp còn nhiều chưa được loại bỏ hết dẫn đến hạn chế việc phát hiện protein mục tiêu. Ở nồng độ 6% PEG 8000 thu được băng đậm nhất, chứng tỏ tại nồng độ này kháng nguyên tinh sạch thu được nhiều nhất. Khi tăng nồng độ PEG 8000 từ 8% đến 10% băng nhạt dần, có thể do kháng nguyên đích bị mất dần. Như vậy, nồng độ PEG 8000 càng cao, kháng nguyên M-ELP có thể bị kết tủa cùng với các protein tạp. Do đó, rất có thể nếu nồng độ PEG 8000 tiếp tục tăng đến một giới hạn nào đó sẽ làm mất protein mục tiêu. Từ kết quả thu được, nồng độ 6% PEG 8000 được lựa chọn và sử dụng bổ sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch kháng nguyên M-ELP bằng phương pháp mITC. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M-ELP: Hình 3.19. Kết quả tối ưu nồng độ peg 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M-ELP Hình 3.19. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M-ELP (A): kết quả quan sát cảm quan lượng cặn thu được sau khi ly tâm 2 ml dịch chiết thực vật có bổ sung PEG 8000 ở các nồng độ (0 - 10%); (B): Kết quả lai Western kiểm