Luận án Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn

ãng với dung dịch carbonate-bicarbonate buffer (Sigma, Mỹ) với nồng độ 2,5x107 vi khuẩn/ml. Ủ đĩa qua đêm ở 4oC và rửa khay 3 lần với dung dịch PBS-Tween 20 37 (0,5% Tween). Tiếp tục block đĩa với 200 µl dung dịch 1% BSA và ủ qua đêm tại 4oC. Rửa đĩa 3 lần với PBS-Tween 20. Cho 100 µl huyết thanh chuột đã được pha loãng 100 lần trong dung dịch 1% BSA vào đĩa, ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa đĩa 5 lần với PBS-Tween 20. Tiếp tục cho 100 µl anti-mouse IgG HRP (Sigma) vào mỗi giếng và ủ 1 giờ tại nhiệt độ phòng. Rửa đĩa 5 lần với PBS- Tween 20. Nhỏ 100 µl cơ chất OPD vào mỗi đĩa và ủ trong tối 15 phút. Thêm 50 µl dung dịch ngừng phản ứng (3M H2SO4) vào mỗi giếng. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 492 nm theo đề nghị của nhà sản xuất cơ chất OPD. Mẫu dương tính khi giá trị OD lớn hơn giá trị giới hạn (Cut off). Giá trị giới hạn bằng trung bình OD của nhóm đối chứng cộng với (3x Sai số chuẩn của nhóm đối chứng) (Classen et al., 1987). 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate - kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 3.3.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano được xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid (pH từ 6.5 - 8.5) với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (C= 500 µg/ml), lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát. pH thích hợp để gắn là pH mà ở đó hỗn hợp dung dịch trên vẫn giữ được màu hồng tươi. Màu hồng tươi được phát hiện ở bước sóng 520 nm (Paek et al., 2000). 3.3.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type 2 thích hợp để phản ứng với dung dịch gold colloid Nồng độ kháng thể kháng S. suis 2 tối ưu để gắn với hạt vàng nano vàng trong dung dịch đươc xác định bằng cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S. suis type 2 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600 µg/ml) lắc nhẹ trong 30 phút, sau đó thêm 250 µl dung dịch NaCl 10%. Ủ 10 phút và quan sát ống có nồng độ thấp nhất không bị đổi từ màu hồng sang màu xanh (đo ở bước sóng 520 nm). Nồng độ protein của ống đó chính là nồng độ protein tối thiểu cần để gắn với gold colloid. 38 3.3.3.3. Phương pháp chế tạo kháng thể cộng hợp Kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng cách ủ kháng thể kháng S. suis 2, với gold colloid (DCN, 40 nm, Mỹ) với tỷ lệ (1:10, vol/vol) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau đó thêm 10% albumin huyết thanh bò (BSA) để cố định các phân tử đã gắn kết. Ly tâm 12.000 vòng trong 30 phút ở 4oC, bỏ dịch nổi. Phần cặn được rửa bằng hỗn hợp 10mM Tris-HCl (pH 8.2) chứa 1% BSA, 5% sucrose. Sau khi ly tâm bỏ dịch nổi, kháng thể cộng hợp được pha loãng trong 100 µl hỗn hợp rửa (Chaudhuri and Raychaudhuri, 2001). Cuối cùng kháng thể cộng hợp được cho lên giấy thủy tinh sợi (glass fiber), phơi khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. 3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 3.3.4.1. Phương pháp xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng nitrocellulose Nồng độ kháng thể chuột kháng S. suis type 2 (kháng thể bắt) thích hợp được xác định bằng cách phun lên màng nitrocellulose (NC) ở đường kiểm tra với các nồng độ khác nhau (1,5; 1,75; 2,0 mg/ml), đồng thời phun Anti-Mouse IgG antibody produced in goat (Sigma-Aldrich-Mỹ, 1 µg/cm) lên màng NC ở đường đối chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003. Sấy khô màng NC ở 50oC trong 1 giờ, sau đó ngâm màng NC trong dung dịch 50 mM đệm acid boric (pH 8.5) chứa 0,5% casein trong 30 phút. Màng NC được rửa bằng dung dịch 50mM Tris-HCl (pH 7.4) chứa 0,5% sucrose và 0,05% sodium cholate. Phơi khô màng NC ở nhiệt độ phòng qua đêm (Huang et al., 2004). Lắp ráp các thành phần để tạo KIT phát hiện nhanh vi khuẩn: màng NC (đã được gắn kháng thể chuột kháng kháng nguyên S. suis type 2 và Anti-Mouse IgG antibody produced in goat), đệm hấp phụ, đệm kháng thể cộng hợp và đệm mẫu được gắn vào các vị trí tương thích và cắt thành từng thanh có chiều rộng 3 mm. Kiểm tra hoạt động của KIT bằng cách nhỏ 100 µl dung dịch nuôi vi khuẩn S. suis 2 lên đệm mẫu của KIT, sau đó cho thêm 100 µl nước cất vô trùng. Quan sát sự xuất hiện của các bĕng trên màng NC trong 5-10 phút. Tất cả thí nghiệm được được lặp lại 3 lần. 39 3.3.4.2. Phương pháp xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh a. Thí nghiệm xác định lượng vi khuần tối thiểu cho kết quả dương tính với KIT chẩn đoán nhanh Tiến hành cho 100 µl dung dịch chứa vi khuẩn S. suis type 2 với lượng khác nhau vào đệm mẫu của KIT. Lượng vi khuẩn tối thiểu KIT chẩn đoán có thể phát hiện được xác định ở mức vi khuẩn tối thiểu mà KIT vẫn xuất hiện 2 bĕng có thể quan sát được (Ju et al., 2010). b. Thí nghiệm xác định phản ứng chéo của KIT chẩn đoán nhanh Theo yêu cầu thực tế, KIT chẩn đoán nhanh chỉ phát hiện được vi khuẩn S. suis type 2 và không có phản ứng chéo với các loại vi khuẩn khác. Phản ứng chéo của KIT được xác định bằng cách cho vào đệm mẫu của KIT chẩn đoán 100 µl dung dịch chứa 5x107 các loại vi khuẩn khác như E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế) và một số chủng vi khuẩn S. suis không phải là type 2 (Bùi Thị Hiền và cs., 2016). Quan sát sự xuất hiện của các bĕng màu trên KIT trong 5-10 phút. c. Thí nghiệm xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT được xác định bằng các so sánh với kết quả của phương pháp PCR trong việc xác định mẫu dương tính và âm tính. Bảng 3.8. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Kit phát hiện nhanh PCR Dương tính Âm tính Dương tính a c Âm tính b d Ghi chú: a: Kết quả dương tính khi được xác định bằng KIT và PCR; b: Kết quả dương tính khi được xác định bằng PCR nhưng âm tính khi xác định bằng KIT; c: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR nhưng dương tính khi xác định bằng KIT; d: Kết quả âm tính khi được xác định bằng PCR và bằng KIT. 40 3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu Số liệu thu thập được trong thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên; thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp và chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột được tính toán bằng phần mềm Excel 2003. Sai khác có ý nghĩa (với α=0,05) được xác định bằng T-test; Độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT được xác định bằng phần mềm MedCalc 15.4 dựa theo kết quả chuẩn được xác định bằng phương pháp PCR. 41 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2 4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ Streptococcus suis type 2 là loại vi khuẩn nguy hiểm gây bệnh chung cho người và động vật (Gottschalk et al., 2007). S. suis type 2 có thể tồn tại kéo dài hơn 1 nĕm tại amiđan của lợn mang mầm bệnh kể cả khi được điều trị bằng penicilline. Da lợn có thể có các màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp bị sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có mủ, viêm phế quản, viêm phổi. Thông thường người bị nhiễm vi khuẩn do tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh, lợn chết hoặc ĕn tiết canh lợn, thịt lợn bệnh, lợn chết chưa được nấu chín kỹ (Lê Vĕn Tạo, 2005). Trong nghiên cứu của Doto et al. (2016) trên đàn lợn có các triệu chứng như viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, vi khớp, vi phổi tại Sao Paulo, Brazin đã cho thấy, trong 133 chuẩn vi khuẩn S. suis phân lập được, có tới 110 là chủng vi khuẩn S. suis type 2. Vi khuẩn S. suis thường xuyên được phân lập trên lợn khỏe là một trong những cảnh báo về khả nĕng lây nhiễm bệnh từ lợn cho người chĕn nuôi, người tham gia công tác giết mổ, cũng như người tiêu dùng. Thế nhưng, ở tỉnh Thừa Thiên Huế cho tới nay mới chỉ có báo cáo về sự lưu hành của vi khuẩn S. suis trên lợn khỏe. Theo Bùi Thị Hiền và cs. (2016), tỷ lệ nhiễm S. suis trên lợn khỏe là 17,31%. Thừa Thiên Huế là một địa bàn rộng lớn thuộc miền Trung Việt Nam, với khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho sự phát triển và gây bệnh của các loại vi sinh vật. Với mục đích xác định sự lưu hành của vi khuẩn S. suis type 2 trên lợn khỏe tại các điểm giết mổ. 100 mẫu dịch mũi lợn được thu thập từ các lò mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế được cho trực tiếp vào môi trường BHI và nuôi trong tủ ấm 37oC có bổ sung CO2 5%, nuôi trong 16 giờ. Tiến hành tách ADN để làm khuôn cho PCR với cặp mồi đặc hiệu. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở hình 4.1 và bảng 4.1. 42 Làn 1: Marker 1kb (Bioline), làn 2 đến 10: các mẫu dương tính, làn 11: chứng âm Hình 4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2 Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 ở lợn tại một số lò mổ trên địa bàn Thừa Thiên Huế Địa điểm lấy mẫu Số mẫu nghiên cứu Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính (%) Lò mổ Bạch Yến 30 4 13,33 Lò mổ Bãi Dâu 40 3 7,50 Lò mổ Xuân Phú 30 2 6,67 Tổng 100 9 9,00 Với kết quả PCR, nhận thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân lập tại lò mổ Bạch Yến là 13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú là 6,67%. Như vậy, tính tổng tỷ lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên 43 Huế là 9,00 %, và có sự khác biệt giữa tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 tại các lò mổ, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S. suis type 2 trong nghiên cứu này cao hơn so với nghiên cứu của Ngo Thi Hoa et al. (2011) và thấp hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu của Huỳnh Ngân Hà và cs. (2016). Nghiên cứu của Ngo Thi Hoa et al. (2011) đã chỉ ra rằng, ở miền Nam Việt Nam, lợn giết mổ mang vi khuẩn S. suis lên đến 41%, trong đó 8% là S. suis type 2. Kết quả này chỉ ra rằng S. suis type 2 là chủng phổ biến nhất ở miền Nam Việt Nam. Theo nghiên cứu của Huỳnh Ngân Hà và cs. (2016), có đến 56,00% vi khuẩn S. suis type 2 sống ký sinh trên hạch amidan của lợn khỏe ở cơ sở giết mổ tại thành phố Hồ Chí Minh nĕm 2012. Cũng theo Ngo Thi Hoa et al. (2011), vi khuẩn S. suis type 2 không thấy xuất hiện trên lợn giết mổ tại Hàn Quốc (Han et al., 2001). Tại Trung Quốc, tỷ lệ lợn giết mổ mang vi khuẩn S. suis là 40,4%, trong đó S. suis 2 chỉ có 3% (Zhang et al., 2009). Kết quả nghiên cứu, phân lập vi khuẩn S. suis type 2 từ dịch mũi lợn khỏe này cũng tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Như Thanh và cs. (2001). Theo Nguyễn Như Thanh và cs. (2001), vi khuẩn S. suis thường được phân lập ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe. Vi khuẩn S. suis type 2 có trong dịch mũi của lợn khỏe cảnh báo nguy cơ lây lan vi khuẩn cho các con lợn khác. Theo Almeida et al. (2006), những lợn khỏe mang trùng này khi nhốt chung với đàn lợn mới chưa bị bệnh sẽ có thể lây bệnh cho các con lợn khác lúc nhập đàn hay lây bệnh cho lợn con mới cai sữa. Theo Đỗ Ngọc Thúy và cs. (2009), vi khuẩn xâm nhập cơ thể người nếu có sự tiếp xúc với lợn, thịt lợn nhiễm bệnh chưa nấu chín kỹ. Vi khuẩn liên cầu lợn đi vào người qua các vết thương hở trên da hoặc niêm mạc mũi, miệng. Như vậy, tỷ lệ nhiễm 9% vi khuẩn S. suis type 2 phân lập từ dịch mũi lợn khỏe mạnh ở các địa điểm giết mổ tại Thừa Thiên Huế đã cho thấy nguy cơ nguy cơ mắc bệnh cao gặp ở những người có tiếp xúc trực tiếp hoặc tiếp xúc gần với lợn hoặc các sản phẩm tươi sống từ lợn nhiễm khuẩn như thợ giết mổ lợn, công nhân lò mổ, người bán hàng thịt, người chế biến thịt tươi, người ĕn tiết canh lợn... Theo Cục Y tế dự phòng, nĕm 2017, cả nước có 171 ca nhiễm vi khuẩn liên cầu lợn, trong đó có 14 trường hợp tử vong. Nguyên nhân mắc bệnh phần lớn là do ĕn tiết canh lợn, phần còn lại là do ĕn nem chua, tiếp xúc, giết mổ lợn (Cục Y tế dự phòng, 2018). 44 4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2 4.1.2.1. Phân lập vi khuẩn S. suis type 2 Để chế tạo KIT chẩn đoán nhanh, việc phân lập và chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, có đủ đặc tính sinh hóa và đặc tính sinh học đặc trưng của vi khuẩn S. suis type 2 rất quan trọng. Từ 9 mẫu dương tính với S. suis type 2, chọn 1 mẫu và tiến hành ria cấy để phân lập vi khuẩn trên môi trường thạch máu cừu và nuôi 16 giờ tại 37oC, 5% CO2. Trên đĩa thạch máu, tiến hành chọn một khuẩn lạc đơn có hình dạng đặc trưng của vi khuẩn liên cầu lợn. Chủng vi khuẩn phân lập này được đặt tên là TTHSS2 và sẽ được kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa như: nhuộm gram, thử nghiệm bile esculin và phản ứng catalase, và một số chỉ tiêu sinh hóa khác như lên men đường glucose, lactose, indol, di động. Hình 4.2. Kết quả phân lâp vi khuẩn Streptococcus suis trên môi trường thạch máu cừu 5% Theo Nguyễn Như Thanh và cs. (2001), vi khuẩn S. suis mọc trên môi trường thạch máu hình thành khuẩn lạc tròn, gọn, hơi vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy. Nghiên cứu của chúng tôi tương tự với kết quả 45 phân lập vi khuẩn liên cầu lợn trên môi trường thạch máu cừu của Nguyễn Như Thanh và cs. (2001). Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc có hình tròn nhỏ, gọn, màu xám trắng (hình 4.2). Chọn lấy một khuẩn lạc và hòa với nước muối sinh lý vô trùng, dàn mỏng trên phiến kính và tiến hành nhuộm gram để quan sát hình thái vi khuẩn liên cầu lợn. Kết quả nhuộm gram cho thấy vi khuẩn có hình hơi giống trực khuẩn, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, trong tiêu bản có thể thấy vi khuẩn có những độ dài khác nhau bắt màu gram (+) (hình 4.3). Hình 4.3. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ khuẩn lạc Theo lý giải của Mahon et al. (2000), vi khuẩn làm tiêu bản trực tiếp từ động vật có hình cầu, hình trứng, đường kính có khi đến 1 μm, chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau, có thể từ hai vi khuẩn tạo thành song cầu khuẩn cho đến chuỗi có 6 - 10 vi khuẩn hay dài hơn. Nhưng ở môi trường phân lập ban đầu, có thể nhầm với trực khuẩn ngắn. 46 Cũng theo Mahon et al. (2000) thì sau 24 - 48 giờ nuôi cấy trong môi trường lỏng, vi khuẩn có thể thay đổi tính bắt màu và chuỗi cũng dài hơn lên. Đặc biệt ở môi trường nuôi cấy có 5% huyết thanh hình thái chuỗi được nhìn thấy rõ nhất. Để khẳng định điều này, tiến hành nuôi vi khuẩn S. suis phân lập được trong môi trường BHI trong 24 giờ tại 37oC. Sau khi nuôi, hút 1µl canh khuẩn và dàn mỏng trên phiến kính và tiến hành nhuộm gram để xác định hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn. Hình 4.4. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ canh khuẩn Kết quả cho thấy trong canh khuẩn, vi khuẩn có hình trứng, kết thành chuỗi dài bắt màu tím hồng thay vì màu xanh tím đặc trưng của vi khuẩn gram dương (hình 4.4). Tiếp tục thực hiện các phản ứng sinh hóa khác trên đối tượng là vi khuẩn liên cầu lợn như phản ứng catalase, phản ứng lên men đường glucose, lactose, phản ứng trong môi trường thạch bile esculin agar, phản ứng sinh indol và tính di động của vi khuẩn. 47 Kết quả kiểm tra tính chất sinh hóa của vi khuẩn cho thấy trên môi trường Bile esculin agar cho kết quả dương tính (hình 4.5). Màu đen xuất hiện trong môi trường là do vi khuẩn liên cầu lợn đã tiết enzyme phân giải esculin thành esculectin, chất này phản ứng với muối Sắt (II) citrate trong môi trường để tạo thành phức hợp phenol sắt, khiến môi trường quanh đường cấy có màu đen (Tarradas et al., 1994). Hình 4.5. Kết quả kiểm tra Streptococcus spp trên môi trường Bile Esculin agar Để thực hiện thử nghiệm catalase, chọn lấy 1 khuẩn lạc, cho lên lam kính sạch, tiếp tục cho 10 µl dung dịch H2O2 3% vào vi khuẩn, qua sát phản ứng trong 10 giây. Kết quả cho thấy không có hiện tượng sủi bọt, phản ứng âm tính do vi khuẩn S. suis không có enzyme catalese nên không thể giải phóng O2 từ dung dịch H2O2. Trên môi trường KIA, vi khuẩn lên men đường glucose và lactose khiến môi trường từ màu đỏ chuyển qua màu vàng sau 16 giờ nuôi cấy (hình 4.6). 48 Ống 1 và 2: mẫu dương tính được cấy vi khuẩn S. suis, ống 3: đối chứng Hình 4.6. Kết quả lên men đường glucose và lactose của vi khuẩn S. suis Hình 4.7. Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn 49 Tính di động của vi khuẩn được kiểm tra trên môi trường thạch bán lỏng và nuôi cấy ở 37oC trong 3 ngày. Kết quả kiểm tra cho thấy vi khuẩn S. suis không có khả nĕng di động, trên môi trường thạch bán lỏng thấy rõ đường cấy, môi trường trong (hình 4.7). Để kiểm tra khả nĕng sản sinh indol của vi khuẩn S. suis, tiến hành nuôi vi khuẩn qua trong môi trường LB ở nhiệt độ 37oC trong 16 giờ. Sau đó nhỏ 3 giọt thuốc thử kovac vào canh khuẩn và quan sát phản ứng, nếu xuất hiện vòng màu đỏ là phản ứng dương tính, vi khuẩn có khả nĕng sinh Indol. Kết quả thí nghiệm cho thấy trên môi trường nuôi vi khuẩn S. suis xuất hiện vòng màu vàng chanh, chứng tỏ vi khuẩn không có enzyme tryptophanase nên không có khả nĕng thủy phân acid amin tryptophan sinh indol (hình 4.8). Hình 4.8. Kiểm tra khả nĕng sinh indol của vi khuẩn S. suis Như vậy trong nghiên cứu này, kết quả thực hiện phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn TTHSS2 phân lập được như sau: 50 Bảng 4.2. Kết quả sinh hóa chủng vi khuẩn THHSS2 TT Chỉ tiêu Kết quả 1 Gram + 2 Bile esculin + 3 Catalase - 4 Lên men đường glucose + 5 Lên men đường lactose + 6 Indol - 7 Di động - Sau khi xác định hình thái vi khuẩn và xác định một số chỉ tiêu sinh hóa, khuẩn lạc Streptococus suis thuần được tách nuôi riêng trong môi trường BHI ở 37oC trong 16 giờ để tĕng số lượng. Sau khi nuôi, tiến hành thu sinh khối và bất hoạt ở 100oC. ADN của vi khuẩn được tách để làm khuôn cho phương pháp PCR xác định S. suis type 2 với cặp mồi đặc hiệu CPS2 (Silva et al., 2006). Kết quả PCR cho thấy, chủng liên cầu TTHSS2 phân lập được thuộc type 2 (hình 4.9). Làn 1: marker AND 1kb (Bioline), làn 2: chứng âm, làn 3 đến 8: mẫu vi khuẩn kiểm tra Hình 4.9. Kết quả PCR kiểm tra chủng vi khuẩn TTHSS2 4.1.2.2. Xác định đặc tính sinh học phân tử của chủng vi khuẩn TTHSS2 Để lựa cho chủng vi khuẩn làm kháng nguyên, sản xuất kháng thể, chủng vi khuẩn đó phải ổn định về mặt di truyền. Theo Goulielmos et al. (2004), gene mã 51 hóa kháng nguyên 6-phosphogluconate-dehydrogenase (6PGD) được xác định là một loại gene bảo thủ, mã hóa protein giúp vi khuẩn S. suis bám vào vật chủ. Do vậy, nghiên cứu gene này rất có ích cho việc phân tích dữ liệu phân tử. Gene mã hóa kháng nguyên 6GPD đã được Tan et al. (2008) phân tích trong nghiên cứu tìm vắc xin protein tái tổ hợp giúp phòng bệnh do vi khuẩn S. suis type 2 gây ra cho lợn. Tiến hành nhân đoạn gen kháng nguyên 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 được đặt tên là TTHSS2 chủng bằng phương pháp PCR. Ở vi khuẩn S. suis type 2, gene kháng nguyên 6PGD có kích thước khoảng 1428 bp và nó mã hóa một protein bề mặt của vi khuẩn. Protein này có khối lượng khoảng 53 kda, protein này có chức nĕng bám dính vào tế bào vật chủ và nó có khả nĕng sinh miễn dịch (Tan et al., 2008). Gene mã hóa kháng nguyên 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 thuần được nhân bằng phương pháp PCR. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide. Đoạn gene mã hóa kháng nguyên 6PGD được nhân lên trong phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt như đã mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Làn 1: marker 1kb (biobasic), làn 2 và 3: mẫu Hình 4.10. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD của chủng TTHSS2 Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR của S. suis type 2 có kích thước khoảng 1428 bp (hình 4.10), tương ứng với chiều dài lý thuyết đoạn ADN của gen 6PGD với cặp mồi 6PGD.F và 6PGD.R, sản phẩm PCR là một bĕng đơn nhất có chất lượng tốt, chứng tỏ toàn bộ quy trình phản ứng PCR là chính xác từ 52 việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, các bước thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn đặc hiệu. 4.1.2.3. Kết quả giải trình tự gene của vi khuẩn chủng TTHSS2 Sản phẩm PCR (gene mã hóa kháng nguyên 6PGD) được gắn vào vector tạo dòng pGem®-T easy để tạo vector tái tổ hợp pGem®-T easy-6PGD sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli Top 10. Tiến hành cấy trải sản phẩm biến nạp trên môi trường đĩa thạch LB có bổ sung ampicillin (50 µg/ml), 30 µl X-gal (20 mg/ml) và 30 µl IPTG 100 mM, nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm. Kết quả cấy cho thấy xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng trên môi trường đĩa thạch LB (hình 4.11). Những khuẩn lạc có màu trắng là những khuẩn lạc có mang vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen kháng nguyên 6PGD. Hình 4.11. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli Top 10 Để chắc chắn rằng, những khuẩn lạc trắng mang vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen 6PGD và đồng thực hiện chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN đúng kích thước như dự tính. Tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu cho gen mã hóa kháng nguyên 6PGD và cặp mồi M13. Mồi M13 được thiết kế để khuếch đại một đoạn ADN khoảng 200 bp trên vector pGem®-T easy. Nếu sản phẩm ADN ngoại lai được chèn vào thì kích 53 thước của sản phẩm PCR với cặp mồi M13 sẽ là 200 bp cộng với kích thước của ADN ngoại lai đó. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả cho thấy các dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dương tính với phản ứng PCR và kích thước nhân lên theo đúng tính toán lý thuyết đoạn gen dài khoảng 1428 bp với cặp mồi đặc hiệu 6GPD và 1628 với cặp mồi M13 (hình 4.12). M: Thang ADN chuẩn 500 -10000kb (biobasic), 1 - 2 các khuẩn lạc trắng được PCR với primers 6PGD, 3-4 các khuẩn lạc trắng được PCR với primers M13 Hình 4.12. Kết quả PCR nhân gen 6PGD trực tiếp từ khuẩn lạc trắng và kết quả các khuẩn lạc trắng PCR cùng cặp mồi M13 Dòng khuẩn lạc dương tính được nuôi trong 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (50 µg/ml) ở 370C qua đêm. Sau đó tiến hành tách chiết plamid, và gửi đi giải trình tự. Phân tích trình tự nucleoctit của gene 6GPD thuộc chủng S. suis type 2 phân lập tại Thừa Thiên Huế (phụ lục 4) nhận thấy có sự sai khác tại 14 vị trí nucleoctit so với gene 6GPD của chủng S. suis type 2 SC 19 do Tan et al. (2008b) phân lập được tại Trung Quốc đã được công bố trên ngân hàng gene (bảng 4.3). Vị trí sai khác lần lượt là 486, 574, 632, 1034, 1074, 1093, 1112, 1115, 1119, 1123, 1132 và 1124. Sự sai khác này có thể là do đặc tính sinh học, thích nghi của từng chủng S. suis type 2 tại mỗi quốc gia khác nhau. 1628 bp 1428 bp 54 Bảng 4.3. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng TTHSS2 phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng SC 19 trên ngân hàng gene Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác Vị trí Sai khác 486 A - — 1074 C - T 1119 C - G 574 C - T 1093 C - G 1123 T - C 632 T - — 1095 G - T 1132 A - G 1034 C - G 1112 — - G 1134 C - T 1039 A - G 1115 C - — Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen 6PGD của chủng TTHSS2 phân lập được có độ dài 1428 bp và tương đồng 99% với gen 6PGD của chủng S. suis type 2 SC 19 đã được công bố (gb|CP000407.1|). Gene 6PGD mã 475 amino acid và có độ tương đồng cao với trình tự của chủng S. suis type 2 SC 19 (Tan et al., 2008b). Từ kết quả phân tích so sánh trình tự nucleotide, tiến hành so sánh trình tự amino acid đã được mã hóa tương ứng từ gen 6PGD giữa chủng TTHSS2 và chủng đã được công bố trên ngân hàng gene (Tan et al., 2008b). TTHSS2 MTKANFGVVGMAVMGRNLALNVESRGYSVAIYNRSADKTEDVVASNPGKNLVPSYDVESF 60 SC 19 MTKANFGVVGMAVMGRNLALNVESRGYSVAIYNRSADKTEDVVASNPGKNLVPSYDVESF 60 TTHSS2 VASIEKPRRIMLMVQAGPGTDATIQALLPHLDEGDILIDGGNTFYEDTIRRSKELANSGI 120 SC 19 VASIEKPRRIMLMVQAGPGTDATIQALLPHLDEGDILIDGGNTFYEDTIRRSKELANSGI 120 TTHSS2 NFIGTGVSGGEKGALEGPSIMPGGQKEAYELVADVLEEISAKAPEDGAPCVTYIGPDGAG 180 SC 19 NFIGTGVSGGEKGALEGPSIMPGGQKEAYELVADVLEEISAKAPEDGAPCVTYIGPDGAG 180 TTHSS2 HYVKMVHNGIEHGDMQLIAESYDLMQHLLGLSVDEMADIFTDWNQGELDSYLIEITADIL 720 SC 19 HYVKMVHNGIEYGDMQLIAESYDLMQHLLGLSVDEMADIFTDWNQGELDSYLIEITADIL 240 TTHSS2 KRKDDQGQDGPIVNYIMDAAGNKGTGKWTSQSSLDLGVPLSLITESVFARYISTYKDERV 300 SC 19 KRKDDQGQDGPIVNYIMDAAGNKGTGKWTSQSSLDLGVPLSLITESVFARYISTYKDERV 300 TTHSS2 AASKVLPKPAPFAYEGDKAELVEKIRQALYFSKIMSYAQGFAQLPVTSKENNWNLPFGEI 360 SC 19 AASKVLPKPAPFAYEGDKAELVEKIRQALYFSKIMSYAQGFAQLRVASKENNWNLPFGEI 360 TTHSS2 AKIWGAGCIIPPPFLQKITDAYGRDEDLANLLLDEYFLDVTAKYQQAVRDVVALAVQAGV 420 SC 19 AKIWRAGCIIRARFLQKITDAYGRDEDLANLLLDEYFLDVTAKYQQAVRDVVALAVQAGV 420 TTHSS2 PVPTFSAAITYFDSYRAENLPANLIQAQRDYFGAHTYNRKDKEGIFHYDWYSESK 475 SC 19 PVPTFSAAITYFDSYRAENLPANLIQAQRDYFGAHTYNRKDKEGIFHYDWYSESK 475 Alanine: A; Aspartic acid hoặc Asparagine: B; Cysteine: C; Aspartic acid: D; Glutamic acid: E; Phenylalanine: F; Glycine: G; Histidine: H; Isoleucine: I; Lysine: K; Leucine: L; Methionine: M; Asparagine: N; Proline: P; Glutamine: Q; Arginine: R; Serine: S; Threonine: T; Valine: V; Tryptophan: