Luận án Nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer - Drug - Fe3O4 - folate) lên tế bào ung thư

tạo bởi cuộn dây cảm ứng (7 vòng, Ďƣờng kính 3 cm và dài 11,5 cm) có công suất lối ra 5 kW. Các mẫu Ďo Ďƣợc phân tán trong môi trƣờng nƣớc và Ďƣợc Ďặt cách nhiệt với môi trƣờng ngoài bằng một vỏ bình thuỷ tinh Ďƣợc hút chân không 10-3 ÷ 10-4 Torr. Nhiệt Ďộ Ďƣợc Ďo bằng nhiệt kế quang (GaAs sensor, Opsens) với Ďộ chính xác 0,3oC trong dải 0 - 250oC. 2.2.9. Xác định hiệu suất và dung lượng mang thuốc Hàm lƣợng Dox trong hệ (Loading content – LC) và hiệu suất mang thuốc (Encapsulation efficiency - EE) Ďƣợc xác Ďịnh bằng cách Ďo phổ UV-Vis tại 480 nm của dung dịch Dox dƣ và sử dụng một Ďƣờng chuẩn tƣơng ứng của dung dịch Dox Ďể tính toán theo công thức: LC (%)=Wd/Wtx100 và EE (%) =Wd/W0,dx100 Trong Ďó Wd là khối lƣợng Dox gắn trên hệ (Wd = W0, d – Wexcess), Wt là tổng khối lƣợng của hệ, W0,d là lƣợng Dox cho vào ban Ďầu. Mỗi thí nghiệm xác Ďịnh hiệu suất mang thuốc Ďƣợc lặp lại 3 lần Ďể lấy giá trị trung bình. 2.2.10. Quá trình giải phóng thuốc in vitro 44 Mô hình giải phóng thuốc in vitro Ďƣợc thực hiện trong dung dịch Ďệm photphat (PBS) tại pH =7,4 và dung dịch Ďệm axetat pH=5 ở 37oC. 5 mg hạt nano Ďƣợc phân tán trong 20 ml dung dịch Ďệm. Tại những thời Ďiểm xác Ďịnh, lấy ra 3 ml dung dịch và thay bằng 3 ml dung dịch Ďệm mới. Mẫu lấy ra Ďƣợc li tâm với tốc Ďộ 5600 vòng/phút trong 10 phút Ďể tách riêng dung dịch curcumin hoặc Doxorubicin bị giải phóng ra. Nồng Ďộ curcumin và Doxorubicin Ďƣợc xác Ďịnh bằng phổ UV-Vis với Ďƣờng chuẩn tƣơng ứng. Tỉ lệ curcumin hoặc Doxorubicin giải phóng ra Ďƣợc tính theo công thức: % Cur giải phóng =(C0,cur- Ct,cur)/C0,cur x100 Trong Ďó C0,cur là nồng Ďộ curcumin ban Ďầu, Ct,cur là nồng Ďộ curcumin tại thời Ďiểm t. %Dox giải phóng =(C0,Dox - Ct,Dox)/C0,Dox x100 Trong Ďó C0,Dox là nồng Ďộ Dox ban Ďầu, Ct,Dox là nồng Ďộ Dox tại thời Ďiểm t. Thí nghiệm Ďƣợc lặp lại 3 lần Ďể lấy giá trị trung bình. 2.2.11. Giải phóng thuốc bằng đốt nóng cảm ứng Đối với thử nghiệm giải phóng Dox bằng Ďốt nóng cảm ứng, 1 ml dung dịch nƣớc của FAD hoặc FADF Ďƣợc kích thích bởi từ trƣờng xoay chiều cƣờng Ďộ70 hoặc 80 Oe, tần số 178 kHz và nhiệt Ďộ ban Ďầu là 30oC trong một khoảng thời gian nhất Ďịnh (từ 750 Ďến 3000 s). Sau khi xử lý bằng Ďốt từ, nồng Ďộ curcumin hoặc Dox giải phóng từ các mẫu Ďƣợc xác Ďịnh bằng quang phổ UV-Vis. 2.3. Thử nghiệm sinh học 2.3.1. Thử nghiệm khả năng nhập bào và độc tính tế bào của FOC và FOCF Tác Ďộng của hệ nano mang thuốc FOC tới khả năng nhập bào của curcumin Ďƣợc khảo sát nhờ khả năng phát huỳnh quang của chất này. 2 x105 tế bào Ďƣợc cấy vào các giếng trên Ďĩa 24 giếng. Sau 24 h nuôi cấy, tế bào Ďƣợc ủ với dung dịch FOC nồng Ďộ 10 µg/ml trong 15 giờ và cố Ďịnh với dung dịch PFA (Sigma) 4%, sau Ďó nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang Ďể Ďánh dấu actin bằng Rhodamine- phalloidin, Ďánh dấu nhân tế bào bằng Hoechst (Invitrogen). Sau Ďó, quan sát Ďĩa nuôi cấy tế bào bằng kính hiển vi LSM 510 (Carl Zeiss). Độc tính tế bào của FOC và FOCF Ďƣợc xác Ďịnh theo phƣơng pháp của Skehan và Likhiwitayawuid [171, 172] trên dòng tế bào ung thƣ HT29. Kết quả 45 Ďƣợc Ďọc trên máy ELISA ở bƣớc sóng 505 nm. Giá trị CS (Cell Survival): là khả năng sống sót của tế bào ở nồng Ďộ nào Ďó của chất thử tính theo % so với Ďối chứng. Dựa trên kết quả Ďo Ďƣợc của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu Ďể tìm giá trị CS (%) theo công thức: ( ) ( ) ( ) ( ) Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, Ďƣợc Ďƣa vào tính toán Excel Ďể tìm ra % trung bình ± Ďộ lệch tiêu chuẩn trong phép thử Ďƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ √( ( ̅) ) ( ) Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ Ďƣợc chọn ra Ďể thử nghiệm tiếp Ďể tìm giá trị IC50 của từng mẫu. Dùng giá trị CS của 10 thang nồng Ďộ, dựa vào chƣơng trình Table curve theo thang giá trị logarit của Ďƣờng cong phát triển tế bào và nồng Ďộ chất thử Ďể tính giá trị IC50 (Inhibitory concentration 50% - nồng Ďộ ức chế 50% tế bào). Công thức: 1/Y = a + blnX Trong Ďó Y: nồng Ďộ chất thử; X: Giá trị CS (%). Thí nghiệm thử Ďộc tính tế bào của các hệ này cũng Ďƣợc thực hiện trên hệ máy X-CELLigence (Roche Inc.). Hệ máy Ďo Ďiện trở qua các Ďiện cực micro gắn vào Ďáy của Ďĩa nuôi cấy. Phép Ďo Ďiện trở cho thông tin Ďịnh lƣợng về số tế bào và khả năng sống của chúng. Ban Ďầu, cho 50l môi trƣờng DMEM vào các giếng trên Ďĩa 96 giếng và theo dõi 15 giây 1 lần trong 1 phút. Sau Ďó, thêm 130 l môi trƣờng DMEM chứa 104 tế bào HT29 vào mỗi giếng và theo dõi 15 phút 1 lần trong 20 giờ. Sau Ďó thêm 20l dung dịch curcumin, Fe3O4/OCMCS hoặc FOC nồng Ďộ khác nhau vào các giếng Ďể Ďạt dải nồng Ďộ từ 0,01 Ďến 100 g/ml. Hoạt Ďộng tế bào Ďƣợc Ďo 30 phút một lần cho Ďến khi kết thúc thí nghiệm (72 giờ). Chỉ số tế bào Ďƣợc phân tích bằng phần mềm RTCA (Roche Inc.) Ďể xác Ďịnh IC50 và các Ďánh giá tiếp theo. 2.3.2. Xác định phân bố của hệ nano mang curcumin tại các cơ quan trên chuột Hệ FOC và FOCF Ďƣợc tiêm vào tĩnh mạch Ďuôi chuột nhắt trắng mang khối u 46 rắn Sarcoma-180 với liều 20 mg/kg Ďể theo dõi phân bố sinh học. Mỗi mẫu tiêm cho 4 chuột, 2 chuột trong số Ďó Ďƣợc áp nam châm tại vị trí của khối u. Sau những khoảng thời gian xác Ďịnh (2,5 h hoặc 5 h), tiến hành mổ chuột, tách lấy khối u, thận và lá lách, Ďể ráo trong không khí và cắt thành lớp Ďể chụp ảnh. 2.3.3. Xác định độc tính tế bào của FAD, FADF, FAQ và FADQ Phƣơng pháp thƣờng Ďƣợc sử dụng Ďể Ďánh giá Ďộc tính tế bào của vật liệu là phƣơng pháp của Skehan & cs. và Likhiwitayawuid & cs. [171, 172]. Độc tính tế bào của Dox tự do và các hệ mang Dox nano Ďƣợc xác Ďịnh bằng mô hình nuôi cấy tế bào XTT (sử dụng thuốc nhuộm XTT: 2,3,-bis(2-methoxy-4- nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium). Các dòng tế bào Ďƣợc nghiên cứu là: Hep-G2 (tế bào ung thƣ gan ngƣời), LU-1 (tế bào ung thƣ phổi), RD (tế bào ung thƣ cơ vân tim), FL (tế bào u lympho nang), HeLa (tế bào ung thƣ cổ tử cung) và Vero (tế bào biểu mô thận khỉ - tế bào lành). Các dòng tế bào này Ďƣợc ủ với FA4D, FAD, FADF, FAQ hoặc FADQ ở các nồng Ďộ khác nhau (nồng Ďộ cao nhất là 25 g/ml) trong Ďĩa nuôi cấy 96 giếng với môi trƣờng thích hợp. Sau 48 h ủ, khả năng tăng sinh tế bào và giá trị IC50 Ďƣợc xác Ďịnh cho từng dòng tế bào tƣơng tự nhƣ 2.3.1. 2.3.4. Thí nghiệm xác định khả năng điều trị in vivo của các hệ đa chức năng mang Dox kết hợp với đốt nóng cảm ứng từ 2.3.4.1. Chuẩn bị chuột thí nghiệm Chuột Ďƣợc nuôi trong Ďiều kiện phòng thí nghiệm, không khí tự nhiên. Nhiệt Ďộ phòng duy trì ở khoảng 26oC, Ďộ ẩm khoảng 55%, ánh sáng tự nhiên. Thức ăn và nƣớc uống Ďảm bảo theo nhu cầu của chuột. Tế bào ung thƣ phổi chuột Lewis, Ďƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng RPMI, bổ sung 1% thuốc kháng sinh. Mỗi chai nuôi cấy diện tích 75 cm2 Ďƣợc cấy 106 tế bào. Tế bào Ďƣợc nuôi cấy tăng sinh và thay môi trƣờng 2 lần mỗi tuần ở Ďiều kiện nhiệt Ďộ 37oC, CO2 5%. Tế bào trƣớc khi tách Ďƣợc rửa hai lần bằng dung dịch PBS 1X, sau Ďó Ďƣợc tách ra bằng dung dịch Trypsin- EDTA 1X. Dung dịch tế bào ung thƣ Ďã chuẩn bị Ďƣợc hút vào bơm tiêm 1 ml với số lƣợng 107 tế bào/ml. Chuột nhắt BALB/c thuần chủng Ďƣợc cố Ďịnh và tiêm 0,1 ml vào dƣới da Ďùi phải (106 tế bào/ 47 chuột). Hình 2.2: Điều kiện nuôi chuột Ďƣợc duy trì ổn Ďịnh và thực nghiệm tiêm thuốc vào khối u trên chân phải chuột Khối u Ďƣợc Ďánh giá theo dõi sự phát triển tại vị trí tiêm 3 lần mỗi tuần, bằng quan sát, sờ và Ďo kích thƣớc khối u bằng thƣớc kẹp. Sau khi khối u phát triển với kích thƣớc khoảng 7-10 mm Ďƣờng kính, chuột Ďƣợc phân ngẫu nhiên vào các nhóm thí nghiệm. 2.3.4.2. Tạo tiêu bản mô học và đánh giá nồng độ Fe trong máu và các mô nội quan Chuột mang khối u nhƣ trên Ďƣợc chia thành 3 nhóm, mỗi nhóm 3 con, trong Ďó có 1 nhóm chứng. Để Ďánh giá sự phân bố thuốc (chứa hạt từ Fe3O4) Ďến các cơ quan, 2 nhóm chuột còn lại Ďƣợc tiêm vào u 50 l FAD hoặc FADF/con, liều duy nhất theo Ďƣờng tĩnh mạch Ďuôi. Sau tiêm 24 h, tiến hành mổ chuột, bơm rửa hệ tuần hoàn bằng nƣớc muối sinh lí Ďể Ďuổi máu ra khỏi các nội quan trƣớc khi tiến hành thu mẫu. Tiến hành lấy mẫu: Gan, lách, máu, thận, khối u. Để tạo tiêu bản mô học, các mẫu Ďƣợc ngâm trong dung dịch formalin 10%, nhuộm với thuốc nhuộm Prussian blue và quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Để xác Ďịnh hàm lƣợng Fe trong các mô, các mẫu sinh phẩm này Ďƣợc xác Ďịnh khối lƣợng, sau Ďó tro hoá bằng H2SO4 và HClO4. Dung dịch thu Ďƣợc tiến hành Ďo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS - Atomic Absorption Spectrometric) Ďể Ďịnh lƣợng Fe có trong mỗi mẫu. 2.3.4.4. Đánh giá tác động của hệ đa chức năng trên chuột Chuột mang u kích thƣớc 7-10 mm Ďƣợc chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm 6 con, gồm có: nhóm chứng (chuột có u không Ďiều trị) và các nhóm Ďƣợc Ďiều trị lần lƣợt bằng FA, FAD, FADF. Trong mỗi chu kì Ďiều trị, thuốc Ďƣợc tiêm trực tiếp vào 48 khối u (Ďùi phải) với liều 50 l/con. 40 phút sau tiêm, chuột Ďƣợc cố Ďịnh trong ống nhựa và Ďƣa vào trong cuộn dây của hệ Ďốt từ RDO-HFI với tần số 178 kHz, cƣờng Ďộ từ trƣờng 80 Oe, thời gian Ďốt 30 phút/con. Hai chu kì liền nhau cách nhau 3 ngày. Ghi nhận sự thay Ďổi kích thƣớc khối u. Qua Ďó Ďánh giá tác dụng Ďiều trị của hạt nano từ mang Doxorubicin trên mô hình chuột mang khối ung thƣ phổi. Hình 2.3: Hệ thiết bị Ďốt từ 2.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu Số liệu Ďƣợc xử lí bằng các phần mềm Excel 2010, OriginPro 8 hoặc SPSS 22.0. Các sai khác Ďƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị P<0,05. 49 CHƢƠNG 3: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG OCMCS MANG CURCUMIN 3.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4 3.1.1. Hạt nano Fe3O4 tổng hợp theo phương pháp đồng kết tủa thông thường Kết quả xác Ďịnh các Ďặc trƣng của hạt Fe3O4 tổng hợp theo phƣơng pháp Ďồng kết tủa Ďƣợc trình bày trên hình 3.1. Theo Ďó, hạt Fe3O4 Ďã Ďƣợc tổng hợp thành công (liên kết Fe-O Ďặc trƣng bởi Ďỉnh hấp thụ tại 575 cm-1 trên phổ hồng ngoại), cấu trúc spinel Ďảo (thể hiện trên giản Ďồ XRD), từ Ďộ bão hoà 70,5 emu/g, có tính chất siêu thuận từ với giá trị Mr và Hc  0 (trên Ďƣờng cong từ hoá) và có kích thƣớc trung bình khoảng 15 nm (thể hiện trong ảnh SEM và TEM). a) 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 575 cm -1 so song (cm -1 ) % t ru y e n q u a b) 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 2theta ( o ) c u o n g d o c) -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 -60 -40 -20 0 20 40 60 M s ( e m u /g ) H (Oe) % t ru y ề n q u a C ư ờ n g đ ộ số sóng (cm -1 ) 50 Hình 3.1: Các Ďặc trƣng của hạt nano Fe3O4 tổng hợp bằng phƣơng pháp Ďồng kết tủa: a) Phổ hồng ngoại, b) Giản Ďồ XRD, c) Đƣờng cong từ hoá, d) Ảnh SEM, e) Ảnh TEM Các tính chất của hạt Fe3O4 do chúng tôi tổng hợp tốt hơn so với nhiều nghiên cứu khác sử dụng cùng phƣơng pháp Ďồng kết tủa. Chẳng hạn, nhóm tác giả F. Yazdani Ďã tổng hợp nhiều mẫu hạt nano Fe3O4 theo phƣơng pháp này, nhƣng các mẫu Ďều có từ Ďộ bão hoà dƣới 60 emu/g [35]. Vật liệu tƣơng tự với từ Ďộ khoảng 60 emu/g cũng Ďƣợc Ďiều chế theo cùng phƣơng pháp [32]. Đặc biệt, mẫu Fe3O4 trong nghiên cứu này cao hơn so với công bố của tác giả Phạm Hoài Linh với vật liệu Fe3O4 (Ms=57emu/g) Ďƣợc tổng hợp với cùng phƣơng pháp ở cùng Ďiều kiện về nhiệt Ďộ, tốc Ďộ khuấy và nồng Ďộ tiền chất [16]. Sự khác biệt về từ Ďộ bão hòa có thể là do trong nghiên cứu này, pH của môi trƣờng phản ứng Ďã Ďƣợc duy trì ổn Ďịnh trong khoảng 10-11. 3.1.2. Hạt nano Fe3O4 tổng hợp theo phương pháp đồng kết tủa có hỗ trợ của vi sóng Để xác Ďịnh Ďƣợc Ďiều kiện tối ƣu Ďể tổng hợp hạt nano Fe3O4 theo phƣơng pháp Ďồng kết tủa sử dụng kĩ thuật vi sóng, các thông số của quá trình chế tạo bao gồm nhiệt Ďộ phản ứng, thời gian phản ứng và tốc Ďộ khuấy trộn Ďƣợc khảo sát (theo bảng 2.1). Các mẫu vật liệu Ďƣợc ghi phổ hồng ngoại, xác Ďịnh tính chất từ và giản Ďồ XRD Ďể tìm Ďƣợc mẫu có từ Ďộ cũng nhƣ Ďộ tinh thể hoá cao nhất. 3.1.2.1. Tính chất từ Đƣờng cong từ hoá của các mẫu Ďƣợc thể hiện trên hình 4.13, các thông số từ Ďƣợc trình bày trên bảng 4.6. Có thể nhận thấy, từ trễ Mr và lực kháng từ Hc của các mẫu chế tạo Ďƣợc Ďều  0 chứng tỏ vật liệu có tính chất siêu thuận từ. Vi sóng không làm thay Ďổi tính chất này của vật liệu. Từ Ďộ bão hoà của mẫu M5 là cao nhất so với các mẫu còn lại, Ďạt 69 emu/g. Giá trị này không khác biệt nhiều so với mẫu Fe3O4 Ďồng kết tủa trong Ďiều kiện thông thƣờng (70,5 emu/g). So sánh các mẫu tổng hợp ở cùng Ďiều kiện nhiệt Ďộ (M1-M3, M4-M6, M7- M9) ta thấy thời gian phản ứng 15 phút (M2, M5, M8) cho sản phẩm có từ Ďộ cao hơn so với thời gian phản ứng 5 phút hoặc 25 phút. Tuy nhiên sai khác này không lớn. Từ Ďộ các mẫu phụ thuộc mạnh hơn vào nhiệt Ďộ phản ứng, khi tăng nhiệt Ďộ từ 51 50 lên 70oC, từ Ďộ bão hoà tăng. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt Ďộ lên 90oC thì từ Ďộ bão hoà của mẫu lại giảm. Có thể giải thích hiện tƣợng này là do nhiệt Ďộ phản ứng tạo ra các hạt có kích thƣớc khác nhau dẫn tới từ Ďộ bão hoà khác nhau. Khi nhiệt Ďộ tăng, kích thƣớc hạt có thể tăng lên, từ Ďộ bão hoà theo Ďó sẽ tăng [173]. Nhƣng khi Ďạt tới gần nhiệt Ďộ sôi của nƣớc (90oC), quá trình bốc hơi dung môi có thể ảnh hƣởng tới quá trình hoàn thiện tinh thể, làm giảm từ Ďộ của mẫu. Bảng 3.1: Điều kiện phản ứng và thông số từ của các mẫu Fe3O4 tổng hợp bằng kĩ thuật vi sóng Mẫu Điều kiện phản ứng Thông số từ Nhiệt Ďộ ( o C) Thời gian (phút) Tốc Ďộ khuấy (vòng/phút) Ms (emu/g) Hc (Oe) Mr (emu/g) M1 50 5 600 53,9   M2 50 15 600 56,2   M3 50 25 600 56,7   M4 70 5 600 63,0   M5 70 15 600 69,0   M6 70 25 600 64,6   M7 90 5 600 59,6   M8 90 15 600 60,6   M9 90 25 600 60,7   M10 70 15 300 62,7   M11 70 15 900 64,5   52 Tốc Ďộ khuấy không ảnh hƣởng Ďáng kể Ďến từ Ďộ của các mẫu (hình 3.2b), mẫu M5 có giá trị từ Ďộ cao hơn M10 và M11 chứng tỏ M5 là mẫu tốt nhất về mặt từ tính. a) -10000 -5000 0 5000 10000 -60 -40 -20 0 20 40 60 M ( e m u /g ) H (Oe) M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 -3 -2 -1 0 1 2 3 M ( e m u /g ) H (Oe) b) -10000 -5000 0 5000 10000 -60 -40 -20 0 20 40 60 M ( e m u /g ) H (Oe) M4 M5 M6 M10 M11 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 M ( e m u /g ) H (Oe) Hình 3.2: Đƣờng cong từ hoá của các mẫu (các hình bên phải là hình phóng to của các Ďƣờng từ hoá tƣơng ứng tại vị trí gần gốc toạ Ďộ) 3.1.2.2. Phổ nhiễu xạ tia X Khảo sát cấu trúc tinh thể các mẫu M2, M5, M8 có thể thấy mẫu M2 các pic xuất hiện trên giản Ďồ XRD không thật sự rõ ràng, chứng tỏ Ďộ tinh thể hoá của mẫu này không cao. Kết quả này phù hợp với giá trị từ Ďộ bão hoà không cao của M2 tổng hợp trong Ďiều kiện nhiệt Ďộ thấp. Giản Ďồ XRD của mẫu M5 xuất hiện Ďầy Ďủ các pic Ďặc trƣng của Fe3O4 và không có pic nào khác (hình 3.3) chứng tỏ mẫu M5 Ďã hình thành cấu trúc spinel Ďơn pha. Ở mẫu M8, ngoài các pic của Fe3O4, trên giản Ďồ XRD của mẫu này còn xuất hiện một số pic khác loại, có thể là do Fe3O4 Ďã bị oxi hoá một phần bởi nhiệt Ďộ cao khi tổng hợp. Kết quả này khẳng Ďịnh M5 là 53 mẫu tốt nhất về cấu trúc pha tinh thể. 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 2Theta ( o ) M8 M5 M2 (220) (311) (400) (422) (511) (400) Hình 3.3: Giản Ďồ XRD của các mẫu Fe3O4 chế tạo bằng vi sóng 3.1.2.3. Phổ hồng ngoại Trên hình 3.4 có thể thấy các mẫu Fe3O4 Ďều xuất hiện pic Ďặc trƣng cho liên kết Fe-O tại vị trí khoảng 570 cm-1. Tuy nhiên ở một số mẫu xuất hiện thêm pic cƣờng Ďộ thấp hơn ở khoảng 630 cm-1 tƣơng ứng với sự có mặt của thành phần Fe2O3 trong mẫu [174]. Phổ Ďồ này cho thấy M5 là mẫu có Ďộ tinh khiết cao nhất với chỉ 1 pic Ďặc trƣng và cƣờng Ďộ pic lớn. Nhƣ vậy, qua khảo sát từ Ďộ, cấu trúc tinh thể và phổ hồng ngoại, chúng tôi lựa chọn mẫu M5 (tổng hợp trong Ďiều kiện vi sóng ở nhiệt Ďộ 70oC, thời gian 15 phút, tốc Ďộ khuấy 600 vòng/phút) Ďể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. 54 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 So song (cm -1 ) a M1 b M2 c M3 d M4 e M5 f M6 g M7 % t ru y e n q u a a d b c e f g Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của các mẫu Fe3O4 vi sóng 3.2.1.4. Kích thước hạt Để so sánh mẫu tổng hợp vi sóng M5 và mẫu Ďồng kết tủa thông thƣờng, mẫu M5 Ďƣợc chụp SEM, TEM và ghi phổ DLS. Hình 3.5 cho thấy hạt nano Fe3O4 thu Ďƣợc có kích thƣớc trong khoảng từ 10-15 nm, có dạng hình tựa cầu, phân bố tƣơng Ďối Ďồng Ďều. Hình 3.5: Ảnh SEM mẫu M5 Hạt nano Fe3O4 có thể dễ dàng phân tán vào nƣớc cho dung dịch có Ďộ bền cao (thế Zeta = 40,1mV – hình 3.6 ). Do Ďó, có thể sử dụng tốt hạt nano Fe3O4 tổng hợp nhờ vi sóng cho các ứng dụng y sinh. số sóng (cm -1 ) % t ru yề n q u a 55 Hình 3.6: Ảnh TEM và phổ DLS của mẫu Fe3O4 M5 phân tán trong nƣớc Những kết quả trên cho thấy sử dụng kĩ thuật vi sóng cho phép rút ngắn Ďáng kể thời gian phản ứng và vẫn Ďảm bảo vật liệu thu Ďƣợc có từ tính và Ďộ tinh thể hoá cao. Mẫu M5 có thể Ďƣợc sử dụng thay thế cho mẫu Fe3O4 tổng hợp trong Ďiều kiện Ďồng kết tủa thông thƣờng. 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng curcumin lên tính chất các hệ mang Curcumin (FOC1-FOC5) Các hệ nano từ mang thuốc phải Ďảm bảo Ďƣợc nhiều yếu tố nhƣ dung lƣợng mang thuốc lớn, từ Ďộ cao, Ďộ bền tốt Để xác Ďịnh Ďƣợc hàm lƣợng curcumin tối ƣu có thể tƣơng tác với hệ nano Fe3O4 bọc bằng OCMCS, chúng tôi thay Ďổi lƣợng curcumin trong quá trình Ďiều chế từ 20 - 100 mg và khảo sát tính chất từ cũng nhƣ Ďộ bền của hệ thông qua Ďo giá trị thế Zeta của hệ. Kết quả Ďƣợc trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Kết quả khảo sát hàm lƣợng curcumin Mẫu FOC1 FOC2 FOC3 FOC4 FOC5 Khối lƣợng curcumin (mg) 20 40 60 80 100 Từ Ďộ bão hoà (Ms, emu/g) 54,9 52,9 49,0 35,3 25,8 Thế Zeta (mV) 40,2±3,2 32,6±4,6 30,4± 2,7 18,2± 3,1 8,1± 2,9 Kết quả Ďo từ Ďộ bão hoà các mẫu FOC1-5 (hình 3.7) cho thấy khi lƣợng curcumin tăng dần từ 20 Ďến 100 mg, từ Ďộ bão hoà của các mẫu giảm dần, Ďặc biệt ở mẫu FOC4 và FOC5. 56 Thế Zeta của các mẫu FOC1-5 (hình 3.8) Ďều có giá trị dƣơng do hạt từ Ďã Ďƣợc bọc bằng lớp polime O-cacboxylmetyl chitosan với nhiều nhóm chức NH2 trên bề mặt. Xu hƣớng biến Ďổi trị số thế Zeta trong các mẫu này tƣơng tự nhƣ sự biến Ďổi về từ Ďộ bão hoà. Các mẫu FOC1-3 có thế lớn hơn 30 mV chứng tỏ các mẫu này có thể duy trì Ďƣợc trạng thái ổn Ďịnh [170]. Trong khi Ďó, mẫu FOC4 và FOC5 có thế Zeta thấp hơn hẳn (dƣới 20 mV). -9000 -6000 -3000 0 3000 6000 9000 -50 -25 0 25 50 -40 -30 -20 -10 0 0 1 2 M ( e m u /g ) H (Oe) M ( e m u /g ) H (Oe) FOC1 FOC2 FOC3 FOC4 FOC5 Hình 3.7: Đƣờng cong từ hoá của các mẫu chế tạo với lƣợng curcumin khác nhau Do Ďó, Ďể Ďảm bảo hệ Ďa chức năng mang Ďƣợc nhiều thuốc nhất và vẫn giữ Ďƣợc các tính chất từ và Ďộ bền tốt, chúng tôi sử dụng khối lƣợng curcumin khi chế tạo là 60 mg. Mẫu FOC3 Ďƣợc kí hiệu lại một cách Ďơn giản là FOC. Khối lƣợng này cũng Ďƣợc dùng Ďể chế tạo hệ mang curcumin gắn folate (FOCF). Hàm lƣợng curcumin thực tế Ďi vào trong các hệ này Ďƣợc Ďịnh lƣợng theo phƣơng pháp phân tích nhiệt (mục 3.3.4). a) b) 57 c) d) e) Hình 3.8: Thế Zeta của các hệ mang curcumin a) FOC1, b) FOC2, c) FOC3, d) FOC4 và e) FOC5 3.3. Hệ nano mang curcumin (FOC) và mang Curcumin gắn folate (FOCF) 3.3.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của Fe3O4, OCMCS, Curcumin và FOC (hình 3.9) Ďƣợc ghi Ďể xác Ďịnh cấu trúc hệ vật liệu. Các nhóm chức Ďặc trƣng của curcumin xuất hiện tại 3507 cm -1 (OH trong nhóm phenol), 1627 cm-1, 1505cm-1 (cƣờng Ďộ cao) và 1430 cm -1 tƣơng ứng với dao Ďộng hóa trị của liên kết C=O, C-C hoặc C-H trong vòng benzen và dao Ďộng biến dạng của liên kết Colefin-H. Các pic Ďặc trƣng trên phổ IR của OCMCS xuất hiện tại: 1060 cm−1 (liên kết C–O ete), 1319 cm−1 (liên kết cầu O), 1415 cm -1 (cƣờng Ďộ cao: biến dạng C=O), 1612 cm−1 (N-H trong nhóm NH2 bị proton hóa của OCMCS), 1627 cm-1 (C=O trong nhóm cacboxylic), 2881 cm−1 (biến dạng C–H), và dải biến dạng OH ở 3000-3650 cm−1. Dao Ďộng của liên kết Fe-O xuất hiện tại 585 cm-1 trên phổ hồng ngoại của Fe3O4. So sánh phổ hồng ngoại của hệ FOC với curcumin và Fe3O4 có thể thấy rằng pic 1620 cm −1 của nhóm C=O Ďã Ďƣợc chuyển dịch từ các vị trí 1627 cm−1 trong phổ của curcumin và 1612 cm-1 trong phổ của OCMCS. Pic 575 cm-1 của Fe-O trong Fe3O4 Ďã chuyển dịch Ďến 570 cm −1 trong hệ nano. Ngoài ra, cũng có sự thay Ďổi từ pic 1505 cm-1 (trong curcumin) sang 1510 cm-1 (trong phổ của FOC) chứng minh tƣơng tác giữa curcumin và Fe3O4 với OCMCS. 58 Sự khác biệt về tính chất giữa folate, FOC và FOCF cũng Ďƣợc thể hiện trên phổ hồng ngoại (hình 3.10). Pic hấp thụ mạnh của liên kết C=O trong nhóm cacboxylate của folate ở 1695 cm-1 chuyển dịch mạnh xuống 1625 cm-1 trên phổ của FOCF chứng minh axit folic Ďã Ďƣợc gắn lên hệ nano. Một số chuyển dịch xảy ra trên phổ FOCF so với FOC nhƣ dao Ďộng vủa liên kết Fe-O (565 và 570 cm-1), biến dạng C-O (1427 và 1420 cm-1) cũng chứng minh sự tồn tại của gốc folate trong hệ FOCF. 4000 3500 2000 1500 1000 500 1 3 1 9 1 4 1 5 1 0 6 0 1 0 2 8 1 4 3 0 1 4 2 0 1 5 1 0 1 5 0 51 6 2 7 1 6 1 2 1 5 6 51 6 2 0 5 7 0 (d) (c) (b) % t ru y e n q u a Wave number (cm -1 ) (a) Fe 3 O 4 (b) OCMCS (c) Cur (d) FOC (a) 5 7 5 Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của (a) Fe3O4, (b) OCMCS, (c) Curcumin, (d) FOC 4000 3500 3000 1500 1000 500 (c) (b) 1 4 2 7 1 3 9 0 1 4 2 0 1 4 8 5 1 4 0 7 3 4 2 0 1 6 0 5 1 5 9 0 1 6 2 5 1 6 9 5 1 5 0 8 1 5 1 0 5 6 5 % t ru y e n q u a so song (cm -1 ) 5 7 0 3600 - 3000 (a) (a) Folate (b) FOC (c) FOCF 0 2 4 6 8 10 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của (a) folate, (b) FOC và (c) FOCF 3.3.2. Phổ huỳnh quang số sóng (c -1 ) số óng (cm -1 ) % t ru y ề n q u a % t ru y ề n q u a 59 Curcumin là hợp chất có khả năng phát huỳnh quang. Sau khi nhận kích thích bởi bức xạ có bƣớc sóng 442 nm, dung dịch FOC phát xạ phổ huỳnh quang với bƣớc sóng cực Ďại ở 515 nm. So với hệ liposome mang curcumin [175] hình dạng phổ huỳnh quang của FOC có cực Ďại rõ nét hơn, cả về cƣờng Ďộ và Ďộ phân biệt. Mặt khác so với phổ huỳnh quang của curcumin trong dung môi etanol/nƣớc (tỉ lệ 1:1) với cực Ďại tại 542 nm, trên phổ của FOC có sự chuyển dịch xanh (chuyển dịch 27 nm về phía bƣớc sóng ngắn) có thể giải thích là do có tƣơng tác của phân tử curcumin với Fe3O4/OCMCS. Về cƣờng Ďộ, dung dịch FOC phát huỳnh quang yếu hơn hẳn so với curcumin tự do. Nguyên nhân là do sự có mặt Fe3O4 trong mẫu làm giảm khả năng phát huỳnh quang của curcumin [132]. 400 600 800 1000 0 4000 8000 12000 16000 20000 FOC Curcumin c u o n g d o buoc song (nm) Hình 3.11: Phổ huỳnh quang của FOC và curcumin 3.3.3. Ảnh hiển vi điện tử quét (FeSEM) Hình thái học bề mặt của hệ FOC và FOCF ghi lại bằng hiển vi Ďiện tử quét (hình 3.12) cho thấy kích thƣớc của các hạt này vào khoảng 30 nm, lớn hơn kích thƣớc của hạt Fe3O4 ban Ďầu (khoảng 20 nm) chứng tỏ rằng curcumin Ďã hấp phụ lên bề mặt của hạt nano Fe3O4. C ư ờ n g đ ộ bước sóng (nm) 60 Hình 3.12: Ảnh Fe-SEM của (a) Fe3O4, (b) Fe3O4/OCMCS, (c) FOC và (d) FOCF 3.3.4. Phân tích nhiệt Hình 3.13 trình bày các Ďƣờng phân tích nhiệt Ďặc trƣng DrTGA, TGA và DTA của 2 mẫu FOC, FOCF. Trên Ďƣờng TGA của FOC và FOCF xuất hiện tƣơng ứng 2 và 3 khoảng mất khối lƣợng khi tăng nhiệt Ďộ. Giai Ďoạn mất nhiệt thứ nhất ở khoảng 100oC có thể Ďƣợc giải thích là do nƣớc ẩm hiện diện trong mẫu. Tất cả các giai Ďoạn mất nhiệt tiếp theo Ďều là thu nhiệt, có thể là do sự phân hủy của các thành phần hữu cơ trong hệ bao gồm OCMCS, curcumin và axit folic. Giai Ďoạn mất khối lƣợng trong dải nhiệt Ďộ từ 360 Ďến 430oC xuất hiện ở giản Ďồ phân tích nhiệt của cả 2 mẫu tƣơng ứng với sự phân hủy của OCMCS và curcumin, và do Ďó, giai Ďoạn mất khối lƣợng thứ hai tại 299oC của mẫu FOCF là do folate bị chuyển hóa. Từ các thông số trên giản Ďồ phân tính nhiệt có thể xác Ďịnh Ďƣợc hàm lƣợng của curcumin và Fe3O4 trong FOC là 45% và 48%, hàm lƣợng axit folic, curcumin và Fe3O4 trong mẫu FOCF lần lƣợt là 26%, 25% và 46%. (a) Fe3O4 (b) Fe3O4/OCMCS (c) FOC (d) FOCF 61 Hình 3.13: Giản Ďồ phân tích nhiệt (a) DrTGA, (b) TGA và (c) DTA của mẫu FOC (trái) và FOCF (phải) Nhƣ vậy, dung lƣợng hấp phụ curcumin tƣơng ứng là 0,95 mg và 0,54 mg/mg Fe3O4 trong 2 mẫu FOC, FOCF. Dung lƣợng hấp phụ curcumin của FOCF giảm Ďi so với FOC. Mặc dù vậy, FOCF vẫn mang Ďƣợc lƣợng curcumin nhiều hơn so với các nghiên cứu khác [134, 176, 177]. Hình 3.14 mô