Luận án Nghiên cứu chuyển gen cry8db có tính kháng vào cây mía - Phan Thị Thu Hiền

Db vào cây mía trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. THIẾT LẬP HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY MÍA 3.3.1. Sự t i sinh in vitro qua chồi đỉnh hồi đỉnh là bộ phận đƣợc bảo vệ tốt nhất trên cây m a hồi đỉnh chứa mô phân sinh đỉnh, có khả năng phân chia liên tục nên có khả năng tái sinh trực tiếp rất tốt Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát khả năng tái sinh trực tiếp của vật liệu thực vật này trên cả ba giống m a đƣợc trồng chủ yếu ở các vùng nguyên liệu Sơn Nam, Sơn ƣơng, Tuyên Quang : RO 10, RO 22, QĐ21 Kết quả tái sinh chồi m a in vitro từ chồi đỉnh đƣợc thể hiện nhƣ hình 3 11 Kết quả nghiên cứu cho thấy, trên môi trƣờng MS cơ bản sau 01 tuần, các chồi đỉnh ở các giống m a đã có hiện tƣợng bật chồi. Khả năng tái sinh của chồi đỉnh rất tốt, sau 04 tuần từ chồi đỉnh ban đầu xuất hiện đa chồi, hiện tƣợng ƣu thế đỉnh đƣợc thay thế cho hiện tƣợng tạo đa chồi từ chồi đỉnh ban đầu (Hình 3.11). Trên môi trƣờng MS cơ bản, chồi đỉnh của ba giống m a đều có phản ứng tái sinh mạnh, trong đó giống ROC22 cho thấy sự tái sinh mạnh nhất đạt 91,53%, số chồi hình thành/1 chồi đỉnh đạt 4,67 chồi (Bảng 3.3). 64 Bảng 3.3: Khả năng t i sinh và số chồi hình thành của các giống mía trên c c m i tr ờng khác nhau từ chồi đỉnh hi u M i trường ROC10 ROC22 QĐ21 Tỷ l tái sinh TB ± SD Số hồi hình thành TB ± SD Tỷ l tái sinh TB ± SD Số hồi hình thành TB ± SD Tỷ l tái sinh TB ± SD Số hồi hình thành TB ± SD Đ MS 52,22 ± 0,02 3,67 ± 0,58 91,53 ± 0,03 4,67 ± 0,58 56,07 ± 0,06 3,00 ± 1,00 ĐS1 MS + BAP1 mg/L 60,93 ± 0,05 5,33 ± 0,58 93,55 ± 0,02 6,67 ± 0,58 71,43 ± 0,05 4,67 ± 0,58 ĐS2 MS + BAP 1 mg/L + proline 560 mg/L 73,75 ± 0,10 9,66 ± 1,15 94,44 ± 0,04 8,67 ± 1,15 79,84 ± 0,05 8,33 ± 1,53 ĐS3 MS + BAP 1 mg/L nƣớc dừa 10% 61,63 ± 0,05 7,67 ± 0,58 94,04 ± 0,03 7,33 ± 0,58 82,76 ± 0,02 6,33 ± 0,58 ĐS4 MS + BAP 1 mg/L nƣớc dừa 10% 560 mg/L Proline 81,44 ± 0,03 10,67 ± 0,58 95,57 ± 0,02 13,33 ± 1,15 88,27 ± 0,02 11,67 ± 1,15 Hiệu quả tái sinh tăng lên r rệt trên môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 1 mg/L B P Trên môi trƣờng này, các giống m a đều cho phản ứng tái sinh tốt, chồi khỏe và có xu hƣớng hình thành đa chồi sớm hơn, sau 04 tuần đa chồi đã xuất hiện từ chồi đỉnh. Giống m a RO 10, QĐ21 cho tỷ lệ tái sinh đạt lần lƣợt là 60,93% và 71,43%. Giống mía ROC22 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trên môi trƣờng này, đạt 93,55%, số chồi hình thành/1 đỉnh sinh trƣởng đạt xấp xỉ 6,67 chồi. Hình 3.11: Quá trình tái sinh chồi trực tiếp in vitro từ chồi đỉnh cây mía ( : hồi đỉnh cây mía, : chồi đỉnh tái sinh sau 01 tuần, C: Sự phá vỡ ưu thế đỉnh và tạo đa chồi từ chồi đỉnh sau 02 tuần, : Đa chồi phát triển sau 08 tuần) A 65 Theo kết quả thử nghiệm khi sử dụng môi trƣờng ĐS2 có bổ sung proline 560 mg/L, cả ba giống m a đều có phản ứng tăng khả năng tái sinh và số chồi hình thành sau nuôi cấy. Với giống m a QĐ21 và RO 10 cho thấy tỷ lệ tái sinh tăng tƣơng ứng đạt lần lƣợt 73,75% và 79,84%, tỷ lệ này cao hơn so với môi trƣờng ĐS1 Môi trƣờng có bổ sung nƣớc dừa cũng cho phản ứng tái sinh cao hơn so với môi trƣờng đối chứng, nhƣng tác động của proline lên hiệu quả tái sinh và số chồi hình thành cao hơn Khi kết hợp môi trƣờng tái sinh có bổ sung proline 560 mg/L và 10% nƣớc dừa, cho hiệu quả tái sinh tạo đa chồi cao nhất trên nguyên liệu là chồi đỉnh ở cả ba giống m a Trên môi trƣờng này, tỷ lệ tái sinh của giống mía ROC22 là 95,57%, số chồi cao nhất đạt 13,3 chồi. Giống m a RO 10 và QĐ21 cũng cho tỷ lệ tái sinh cao, đạt lần lƣợt là 81,44 % và 88,27 % (Bảng 3.3). Nhƣ vậy, chồi đỉnh là nguyên liệu tái sinh trực tiếp rất tốt, môi trƣờng tối ƣu để thực hiện tái sinh và cho tỷ lệ tạo chồi cao mà MS cơ bản có bổ sung 1 mg/L BAP, 560 mg/L proline và 10% nƣớc dừa. Trong ba giống mía nghiên cứu, đỉnh sinh trƣởng của giống m a RO 22 đạt tỷ lệ tái sinh cao nhất 95,57 %. 3.3.2. Sự tái sinh in vitro qua chồi n ch Chồi nách cũng là vật liệu thực vật đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu nuôi cấy tạo vật liệu khởi đầu in vitro ở cây m a Một cây m a trƣởng thành chỉ có 01 đỉnh sinh trƣởng nhƣng có rất nhiều chồi nách tồn tại dƣới dạng chồi ngủ, vì vậy đây là nguồn nguyên liệu số lƣợng lớn, d sử dụng. Tuy vậy, nhƣợc điểm của chồi nách là đã tiếp xúc với môi trƣờng bên ngoài trong quá trình phát triển nên hiện tƣợng nhi m nấm khuẩn trong quá trình thao tác thí nghiệm d gặp hơn Để khắc phục hiện tƣợng này, chúng tôi đã tiến hành khử trùng kép Quá trình tái sinh tạo đa chồi khi sử dụng chồi nách làm vật liệu nuôi cấy ban đầu đƣợc thể hiện nhƣ hình 3 12 Trên môi trƣờng MS cơ bản, ba giống RO 10, RO 22, QĐ21 đều cho phản ứng tái sinh mạnh, tỷ lệ tái sinh lần lƣợt đạt 40,21%, 68,91% và 50,04% (Bảng 3 4 66 Hình 3.12: Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ chồi nách cây mía (A: chồi nách khử trùng, B: Sự tái sinh chồi sau 02 tuần, C: Sự tái sinh chồi sau 04 tuần, D: sự phá vỡ ưu thế đỉnh tạo đa chồi từ chồi nách sau 05 tuần, E: Hiện tượng tạo đa chồi sau 08 tuần, F: đa chồi phát triển sau 10 tuần nuôi cấy) Khi bổ sung vào môi trƣờng 1 mg/L BAP, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ tái sinh của các giống m a đều tăng Trong đó giống ROC22 vẫn là giống có ƣu thế nổi trội, tỷ lệ tái sinh đạt 75,77%, số chồi hình thành đạt 6,67 chồi (Bảng 3.4). Bảng 3.4: Khả năng t i sinh và số chồi hình thành của các giống mía tr n c c m i tr ờng khác nhau từ chồi nách Kí hi u M i trường ROC10 ROC22 QĐ21 Tỷ l tái sinh TB ± SD Số hồi hình thành TB ± SD Tỷ l tái sinh TB ± SD Số hồi hình thành TB ± SD Tỷ l tái sinh TB ± SD Số hồi hình thành TB ± SD Đ MS cơ bản 40,21 ± 0,02 3,67 ± 1,15 68,91 ± 0,07 5,67 ± 1,15 50,04 ± 0,03 2,67 ± 0,58 CN1 MS + BAP 1 mg/L 60,93 ± 0,05 5,33 ± 0,58 75,77 ± 0,04 6,67 ± 0,58 68,17 ± 0,05 4,67 ± 0,58 67 CN2 MS + BAP 1 mg/L + proline 560 mg/L 69,53 ± 0,02 8,67 ± 0,68 80,91 ± 0,06 10,67 ± 0,06 78,49 ± 0,07 7,76 ± 1,15 CN3 MS + BAP 1 mg/L nƣớc dừa 10% 65,30 ± 0,01 7,33 ± 0,58 79,27 ± 0,04 12,33 ± 0,58 73,17 ± 0,02 9,67 ± 0,58 CN4 MS + BAP 1 mg/L nƣớc dừa 10% + 560 mg/L proline 77,71 ± 0,05 9,67 ± 0,58 90,24 ± 0,06 13,67 ± 1,52 80,91 ± 0,06 11,67 ± 0,58 Trên môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 1 mg/L BAP (CN1), chúng tôi tiến hành khảo sát riêng rẽ tác động của proline và nƣớc dừa lên khả năng tái sinh của chồi nách, kết quả cho thấy đối với nguyên liệu thực vật là chồi nách của mía thì proline có tác dụng tốt hơn đến khả năng tái sinh và số chồi hình thành m i chồi nách lớn hơn Ở giống mía ROC10, tỷ lệ tái sinh ở môi trƣờng có bổ sung 1 mg/L B P và 560 mg/L proline (CN2) là 69,53% trong khi nếu môi trƣờng bổ sung 1 mg/L B P và nƣớc dừa 10% (CN3) là 65,30%. Giống m a QĐ21 cũng cho phản ứng tƣơng tự, trên môi trƣờng N2 đạt 78,49% cao hơn trên môi trƣờng N3 đạt 73,17% Tƣơng tự nhƣ các th nghiệm đã tiến hành đối với đỉnh sinh trƣởng, chúng tôi kết hợp hai thành phần proline 560 mg/L và nƣớc dừa 10% vào môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 1 mg/L BAP cho hiệu quả tái sinh cao nhất ở cả ba giống mía ROC10, RO 22, QĐ21 đạt lần lƣợt 77,71%, 90,24% và 80,91%. Nhƣ vậy, trong quá trình nuôi cấy chồi nách, môi trƣờng tái sinh trực tiếp tốt nhất là MS có bổ sung 1 mg/L B P, 560 mg/L proline và 10% nƣớc dừa. Giống mía cho phản ứng tái sinh tốt nhất là RO 22 đạt 90,24%, số chồi hình thành/mẫu đạt 13,67 chồi. 3.3.3. Sự t i sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn l non Ảnh hưởng của t hợp NAA và kinetin đến khả năng tái sinh trực tiếp của cuộn lá non. 68 Việc tái sinh trực tiếp giúp rút ngắn thời gian, cho phép tạo ra một lƣợng chồi nhất đ nh trong thời gian ngắn Sau khi đặt các cuộn lá non của cây ex vitro trên các môi trƣờng khác nhau, sau 4 tuần thống kê. Tuy kết quả này chỉ là bƣớc đầu, nhƣng điều đáng ghi nhận là trong thời gian ngắn (04 tuần), các chồi đã đƣợc tái sinh từ cuộn lá non của cây m a trƣởng thành Quá trình tái sinh trực tiếp của cây m a từ cuộn lá non trong điều kiện in vitro đƣợc thể hiện nhƣ hình 3 13 Trên môi trƣờng đối chứng MS tất cả mẫu cấy b hóa nâu và chết sau thời gian 07 ngày (Bảng 3.5). Trong các thí nghiệm nhắc lại, các mẫu cấy đã đƣợc tăng cƣờng cấy chuyển sang môi trƣờng đối chứng mới nhƣng cũng không tạo đƣợc chồi tái sinh. Hiệu quả tái sinh tăng r rệt khi đặt các lát cắt ngang cuộn lá non của ba giống m a trên môi trƣờng TS1 có bổ sung 5 mg/L NAA và 0,5 mg/L kinetin của ill và đtg (2006 Trên môi trƣờng này, cả ba giống m a đều cho phản ứng tái sinh chồi trực tiếp. Cụ thể, giống ROC22 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất, đạt xấp xỉ 26,09 %, trong khi đó giống ROC10 và QĐ21 chỉ đạt lần lƣợt là 12,10% và 16,98 %. Hiệu quả tái sinh còn thể hiện ở số chồi đƣợc tái sinh/0,5 g cuộn lá. Trong ba giống nghiên cứu, ROC22 tạo 4,33 chồi/0,5 g cuộn lá, các giống RO 10, QĐ21 tạo chồi thấp hơn xấp xỉ 4 lần so với giống ROC22, chỉ đạt 1,33 chồi/ 0,5 g cuộn lá. Nhƣ vậy, trên môi trƣờng có bổ sung NAA và kinetin, ba giống mía khảo sát đều cho phản ứng tái sinh chồi trực tiếp từ cuộn lá, trong đó giống ROC22 cho hiệu quả tái sinh cao nhất đạt 26,09% Ản ưởng của tổ hợp proline và nước dừa lên khả năn t i sin c i trực tiếp Proline và nƣớc dừa là các yếu tố quan trọng tác động đến hiệu suất tái sinh của một số thực vật trong đó có cây m a Trong môi trƣờng nuôi cấy, nếu đƣợc bổ sung các yếu tố này, cây in vitro sẽ phát triển tốt hơn (Gill et al., 2006). 69 Bảng 3.5: Khả năng tái sinh từ cuộn lá non và số chồi hình thành trung bình của các giống mía tr n c c m i tr ờng khác nhau Kí hi u M i trường ROC10 ROC 22 QĐ21 Tỷ l tái sinh Số hồi/0, 5 g uộn lá Tỷ l tái sinh Số hồi /0,5 g uộn lá Tỷ l tái sinh Số hồi/0, 5g uộn lá Đ MS cơ bản 0 0 0 0 0 0 TS1 MS + 5 mg/L NAA + 0,5 mg/L kinetin 12,1 ± 0,01 1,33 ± 0,58 26,09 ± 0,03 4,33 ± 0,58 16,98 ± 0,03 1,33 ± 0,58 TS2 MS + 5 mg/L NAA+ 0,5 mg/L kinetin + 560 mg/L proline 24,29 ± 0,01 3,33 ± 0,58 49,50 ± 0,02 6,33 ± 0,58 34,12 ± 0,04 4,33 ± 0,58 TS3 MS + 5 mg/L NAA+ 0,5 mg/L kinetin + nƣớc dừa 10% 26,63 ± 0,02 2,67 ± 0,58 43,90 ± 0,09 5,33 ± 0,58 41,76 ± 0,02 3,67 ± 0,58 TS4 MS+ 5 mg/L NAA+ 0,5 mg/L kinetin + nƣớc dừa 10% 560 mg/L proline 65,63 ± 0,03 4,67 ± 0,58 79,31 ± 0,05 9,33 ± 1,15 65,91 ± 0,02 8,67 ± 0,58 Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.5 cho thấy, proline có tác dụng tốt trong việc tăng cƣờng khả năng tái sinh trực tiếp của cây mía. Với môi trƣờng MS có bổ sung 5 mg/L NAA, 0,5 mg/L kinetin và 560 mg/L prolin cho thấy tỷ lệ tái sinh của các giống m a đã tăng lên r rệt. Giống mía ROC10 cho tỷ lệ tái sinh tăng xấp xỉ gấp đôi so với môi trƣờng MS chỉ bổ sung 5 mg/L NAA, 0,5 mg/L kinetin khi bổ sung 560 mg/L proline. Số chồi/mảnh cấy cũng tăng, đạt 3,33 chồi/ 0,5 gram cuộn lá. 70 A B Hình 3.13: Quá trình tái sinh chồi in vitro trực tiếp từ cuộn lá non (A: Cuộn lá non sau 02 tuần nuôi cấy; B: cuộn lá non tái sinh chồi sau 04 tuần) Môi trƣờng có bổ sung nƣớc dừa 10% cũng cho thấy tỷ lệ tái sinh và số chồi tăng nhƣng điều đặc biệt là giống RO 10 và QĐ21 cho phản ứng tái sinh và tạo chồi trên các cuộn lá non có hiệu quả cao hơn so với bổ sung proline, đạt tỷ lệ tái sinh lần lƣợt là 26,63% và 41,76%, trong khi đó RO 22 vẫn cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong ba giống nhƣng tỷ lệ này vẫn thấp hơn so với môi trƣờng bổ sung proline, đạt 43,90%. Khi kết hợp trong môi trƣờng hai thành phần proline 560 mg/L và nƣớc dừa 10 % (môi trƣờng TS4) cho thấy tỷ lệ tái sinh cao nhất thể hiện ở 3 giống m a Đối với giống mía ROC10, khi sử dụng môi trƣờng này cho thấy tỷ lệ tái sinh đạt 65,63% (gấp 4 lần so với môi trƣờng TS1), số chồi/mảnh cấy đạt 04 chồi. Giống QĐ2 cho kết quả tái sinh tƣơng đƣơng với RO 10, đạt 65,91%, số chồi/mảnh cấy đạt xấp xỉ 8,67 chồi. Giống ROC22 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất, đạt 79,31%, số chồi/mảnh cấy đạt 9,33 chồi (Bảng 3 6 Nhƣ vậy, môi trƣờng tốt nhất để tái sinh trực tiếp từ cuộn lá non của các giống mía chúng tôi tiến hành nghiên cứu là MS cơ bản có bổ sung 5 mg/L NAA, 0,5 mg/L kinetin, 560 mg/L proline và nƣớc dừa 10%. Giống mía ROC22 có tỷ lệ tái sinh cao nhất trên môi trƣờng này đạt 79,31%, số chồi/0,5 g cuộn lá đạt 9,33 chồi. Ảnh hưởng của vị trí lát cắt cuộn lá non đến hiệu quả tái sinh trực tiếp Trên thực tế, cuộn lá non càng gần đỉnh sinh trƣởng càng cho hiệu quả cao hơn so với mảnh cắt của phần cuộn lá non ở xa đỉnh sinh trƣởng. Ba giống m a RO 22, QĐ21 và RO 10 đều cho kết quả tƣơng tự khi đặt các cuộn lá đƣợc lấy từ phần cuộn lá non 71 cách đỉnh sinh trƣởng 9 cm. Kết quả cho thấy, khi sử dụng mảnh cắt thực vật cách đỉnh sinh trƣởng 1-5 cm, hiệu quả tái sinh cao Ngƣợc lại, khi sử dụng các mảnh cắt thực vật từ phần cuộn lá non cách đỉnh sinh trƣởng 10 cm trở lên thì sản phẩm nuôi cấy trên môi trƣờng tái sinh trực tiếp từ cuộn lá non chủ yếu là r và lƣợng chồi hình thành rất ít, hiện tƣợng này đều thể hiện ở cả ba giống nghiên cứu (Hình 3.14 A, B) nh 3.14: iện t ợng rễ mọc u thế so với sự tái sinh chồi khi nuôi cấy mảnh cắt cuộn l non ở mía ( : uộn lá ở vị trí cách chồi đỉnh 9 cm: ắt đầu xuất hiện rễ trên mảnh cấy, : uộn lá ở vị trí cách chồi đỉnh 11 cm: rễ mọc ưu thế so với chồi) Một trong những nguyên nhân chính của hiện tƣợng này là do thành phần môi trƣờng nuôi cấy chất điều hòa sinh trƣởng auxin chiếm ƣu thế (NAA có nồng độ cao 5 mg/L), nếu sử dụng mẫu cấy già (lƣợng auxin nội sinh cao để thực hiện quá trình tái sinh trực tiếp d dẫn đến hiện tƣợng mẫu tạo r nhiều hơn tạo chồi trên cùng một mảnh cấy. Nhƣ vậy, sự tái sinh của ba giống m a đã đạt đƣợc trên cả ba nguyên liệu thực vật khác nhau Môi trƣờng tái sinh của cuộn lá non là MS có bổ sung 5 mg/L NAA và 0,5 mg/L kinetin Môi trƣờng tái sinh của đỉnh sinh trƣởng và chồi nách là MS có bổ sung 1 mg/L B P Trong nghiên cứu này, khi bổ sung 560 mg/L proline và 10% nƣớc dừa làm tăng hiệu quả tái sinh của các mẫu cấy Đối với cuộn lá non, trên môi trƣờng này tỷ lệ tái sinh đạt cao nhất ở tất cả các giống, đặc biệt giống RO 22 có tỷ lệ tái sinh cao nhất đạt 79,31%, số chồi/0,5 g cuộn lá đạt 9,33 chồi hồi đỉnh cũng có kết quả tƣơng tự, trên môi trƣờng này cả ba giống đều cho phản ứng tái sinh cao nhất và RO 22 đạt tỷ lệ tái sinh cao 72 95,57% hồi nách cũng đạt tỷ lệ tái sinh cao trên môi trƣờng này, RO 22 đạt 90,24%, số chồi hình thành/mẫu cấy đạt 13,67 chồi 3.3.4. Sự t i sinh chồi in vitro th ng qua ph i soma cây mía Ảnh hưởng của 2,4- đến sự hình thành m sẹo tạo từ cuộn lá cây mía Trên môi trƣờng đối chứng MS không có bổ sung 2,4- , tất cả các giống m a không tạo mô sẹo Ba giống m a này đều tạo mô sẹo trên môi trƣờng có 2,4- trong khoảng thời gian từ 7 - 21 ngày Thời gian hình thành mô sẹo thay đổi phụ thuộc vào nồng độ auxin bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy (Đ Xuân Đồng et al., 2012) Kết quả nghiên cứu cho thấy, trên môi trƣờng có bổ sung các nồng độ 2 mg/L, 3 mg/L và 4 mg/L 2,4- các mẫu mô cấy thể hiện sự hình thành mô sẹo sớm (trong khoảng thời gian 7 ngày nuôi cấy Ngƣỡng nồng độ 1 mg/L và 5 mg/L cho thấy sự hình thành mô sẹo chậm hơn, lần lƣợt là 14, 15 ngày M i loại môi trƣờng cho tỷ lệ tạo mô sẹo ở m i giống m a khác nhau iống RO 22, RO 10 tỷ lệ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/L 2,4– lần lƣợt đạt 98,20% và 71,82% iống QĐ21 lại có tỷ lệ tạo mô sẹo cao 90,36% trên môi trƣờng có bổ sung 4 mg/L 2,4- Sở dĩ có sự khác nhau này có thể do lƣợng auxin nội sinh của các giống khác nhau (Bảng 3 6). Bảng 3.6: Tỷ lệ tạo mô sẹo của 3 giống mía trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D Giống Nồng độ 2,4-D ROC22 TB(%) ± SD ROC10 TB(%) ± SD QĐ21 TB(%) ± SD 0 0 0 0 1mg/L 41,50 ± 1,05 38,10 ± 1,31 31,26 ± 0,40 2 mg/L 82, 32 ± 0,33 59,35 ± 0,28 62,33 ± 0,45 3 mg/L 98,20 ± 0,51 71,82 ± 0,97 84,62 ± 0,11 4 mg/L 71,13 ± 0,30 52,67 ± 0,25 90,36 ± 0,12 5 mg/L 56,96 ± 1,32 41,57 ± 0,57 72,70 ± 0,57 Nhìn chung, cả ba giống m a đều có khả năng tạo mô sẹo tốt trên môi trƣờng MS có bổ sung 2,4- Trong đó, giống RO 22 có khả năng tạo mô sẹo cao nhất trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/L 2,4 – , tỷ lệ mô sẹo đạt gần nhƣ tuyệt đối 98,20% Ảnh hưởng của 2,4- lên sự hình thành ph i soma từ m sẹo Ở hầu hết các thực vật nói chung, phôi soma đƣợc phát triển từ mô sẹo bằng 73 cách nuôi cấy trên môi trƣờng MS bổ sung auxin Tuy nhiên việc tạo phôi soma từ mô sẹo thƣờng sử dụng nồng độ auxin thấp hơn giai đoạn tạo mô sẹo 2,4- là chất đƣợc sử dụng phổ biến nhất để tạo phôi soma thực vật (Đ Xuân Đồng et al., 2012). Trong nghiên cứu này, các cụm mô sẹo sau 21 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng tạo phôi soma với dải nồng độ 2,4- từ 0,3 –1,5 mg/L Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy cả ba giống m a đều có khả năng tạo ba loại mô sẹo có đặc điểm hình thái và khả năng tái sinh khác nhau Loại 1: Mô sẹo không tạo phôi soma nhầy, ẩm ƣớt và có màu nâu đặc trƣng Loại 2: mô sẹo rắn, chắc, có màu nâu nhạt không có phôi và mô sẹo xốp, có màu vàng sáng, có các dạng phôi soma chứa các dạng cấu trúc hình cầu màu trắng hoặc màu kem (Hình 3 15 Quá trình ch n của phôi soma có thể tích trữ tinh bột để cung cấp năng lƣợng cho giai đoạn nảy chồi, ngoài ra quá trình này có thể hoạt hoá các gen điều khiển quá trình tái sinh hoạt động tốt hơn. Hình 3.15: Các dạng mô sẹo h c nhau thu đ ợc sau hi nu i cấy ( : sẹo loại 1: kh ng tạo ph i soma nhầy, ẩm ướt và c màu nâu đặc trưng, : sẹo loại 2: rắn, chắc, c màu nâu nhạt kh ng c ph i, : sẹo loại 3: m sẹo xốp, c màu vàng sáng, c các dạng ph i soma chứa các dạng cấu tr c hình cầu màu trắng hoặc màu kem - m sẹo ph i hoá) Đi sâu chi tiết, kết quả cho thấy 3 giống m a RO 22, RO 10, QĐ21 đều có khả năng tạo phôi soma trong môi trƣờng có bổ sung 2,4- Trên môi trƣờng MS, tỷ lệ tạo phôi soma đƣợc tạo ra t nhất, giống QĐ21 đạt tỷ lệ tạo phôi soma cao hơn cả trong ba giống cũng chỉ đạt 9,46%, trong khi đó, RO 22, RO 10 lần lƣợt đạt 6,39% và 5,22%. Trên môi trƣờng bổ sung 0,9 mg/L 2,4- , cả ba giống đều cho phản ứng tạo phôi soma 74 t ch cực, các giống RO 22, RO 10, QĐ21 đều có tỷ lệ tạo phôi soma cao nhất, lần lƣợt đạt 71,39%, 47,13% và 50,85% ác môi trƣờng còn lại đều cho phản ứng tạo phôi soma ở ba giống m a, nhƣng tỷ lệ tạo phôi thấp hơn so với môi trƣờng trên (bảng 3 7). Bảng 3.7: Ảnh h ởng của nồng độ 2,4–D tới sự hình thành phôi soma từ mô sẹo của c c giống mía sau 2 tuần nuôi cấy Giống Nồng độ 2,4 –D ROC22 TB (%) ± SD ROC10 TB (%) ± SD QĐ21 TB (%) ± SD 0 mg/L 6,39 ± 0,62 5,22 ± 1,00 9,46 ± 0,55 0,3 mg/L 16,38 ± 0,30 11,64 ± 0,46 13,42 ± 0,78 0,6 mg/L 30,57 ± 0,80 21,76 ± 0,61 28,05 ± 0,45 0,9 mg/L 71,39 ± 0,89 47,13 ± 0,71 50,85 ± 0,03 1,2 mg/L 61,01 ± 0,67 34,33 ± 0,29 39,09 ± 0,55 1,5 mg/L 40,15 ± 0,71 25,21 ± 0,56 22,50 ± 0,50 Nhƣ vậy, môi trƣờng MS có bổ sung 0,9 mg/L 2,4- là tốt nhất để mô sẹo của các giống m a hình thành phôi soma Trên môi trƣờng này, giống m a RO 22 cho tỷ lệ hình thành phôi soma cao nhất xấp xỉ 71,39% Sự hình thành chồi từ ph i soma * Ảnh hưởng tổ hợp BAP v kinetien đến khả năng tái sinh hồi á ụm ph i Phôi soma đƣợc hình thành trên môi trƣờng tạo phôi trong 2 tuần, đến lúc phát triển thành dạng phôi ch n, phôi t ch trữ đầy đủ chất dinh dƣỡng và cơ quan cần thiết ác cụm phôi ch n đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS có bổ sung tổ hợp B P và kinetine nồng độ khác nhau để nảy mầm tạo đa chồi B P và kinetin là hai chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin có tác dụng k ch th ch r rệt đến sự hình thành chồi bất đ nh đồng thời ức chế mạnh sự tạo r của chồi nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 2007 iai đoạn hình thành chồi từ phôi soma rất quan trọng vì nó quyết đ nh hiệu suất tái sinh của cây Nếu số lƣợng phôi tạo ra nhiều nhƣng tỷ lệ nảy mầm kém thì không có ý nghĩa đối với các th nghiệm tiếp theo về chuyển gen Tỷ lệ phôi nảy mầm càng cao thì xác suất chọn đƣợc cây chuyển gen càng lớn (Đ Xuân Đồng et al., 2012) Kết quả thu đƣợc thể hiện ở Bảng 3 9, Hình 3.16 cho thấy, các cụm phôi soma của 3 giống m a đều có khả năng nảy mầm nhất đ nh trên các môi trƣờng khác nhau. Xét từng loại môi trƣờng, môi trƣờng đối chứng MS cho tỷ lệ tái sinh kém 75 nhất, các giống RO 22, RO 10, QĐ21 đều có tỷ lệ tái sinh thấp nhất lần lƣợt là 10,57%, 5,77% và 8,97%. Điều thú v là cả ba giống m a RO 22, RO 10, QĐ21 cho tỷ lệ tái sinh cao nhất đạt 97,43%, 49,30% và 59,32% trên môi trƣờng MS + 1 mg/L BAP + 0,5 mg/L kinetin (Bảng 3 8) Tỷ lệ tái sinh này cao hơn so với kết quả của Dibax và đtg (2011) trên môi trƣờng có bổ sung 0,25 mg/L B P, tỷ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất 80% Hình 3.16: Tái sinh tạo đ hồi từ cụm phôi soma (A: giống ROC10, B: Giống Đ21, : Giống ROC22) Bảng 3.8: Ảnh h ởng của tổ hợp ích thích sinh tr ởng BAP và inetin đến tỷ lệ tái sinh tạo đa chồi từ ph i soma của c c giống mía Giống Chất điều tiết sinh trưởng ROC22 TB(% )± SD ROC10 TB(%) ± SD QĐ21 TB(%) ± SD 0 (Đ ) 10,57 ± 0,34 5,77 ± 0,99 8,97 ± 0,72 0,5 mg/L BAP + 0,5 mg/L kinetin 50,79 ± 1,43 22,72 ± 0,32 24,54 ± 0,07 1 mg/L BAP + 0,5 mg/L kinetin 97,43 ± 1,03 49,30 ± 0,15 59,32 ± 0,31 1,5 mg/L BAP +0,5 mg/L kinetin 70,29 ± 0,97 38,97 ± 0,75 51,09 ± 0,41 2 mg/L BAP +0,5 mg/L kinetin 57,72 ± 0,60 30,54 ± 0,21 39,56 ± 0,72 2,5 mg/L BAP +0,5 mg/L kinetin 38,51 ± 0,24 10,91 ± 0,60 28,49 ± 0,69 Nhƣ vậy, giống RO 22 tỏ ra ƣu việt nhất trong tái sinh đa chồi, tỷ lệ tái sinh cao nhất đạt 97,43% Môi trƣờng tốt nhất để đạt tỷ lệ tái sinh cao là MS có bổ sung 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L kinetin. * Ảnh hưởng của t hợp P và kinetien lên số chồi hình thành Tổ hợp chất k ch th ch sinh trƣởng B P và kinetin không chỉ ảnh hƣởng đến 76 tỷ lệ tái sinh chồi, mà còn quyết đ nh số chồi đƣợc hình thành của cụm phôi soma Bằng phƣơng pháp xác đ nh khối lƣợng của phôi trƣớc khi thực hiện th nghiệm, đã thống kê đƣợc số lƣợng chồi/0,5 g cụm phôi soma sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 3 9). Bảng 3.9: Ảnh h ởng của tổ hợp chất ích thích sinh tr ởng BAP và kinetin lên số l ợng chồi hình thành (số chồi/0,5 g cụm phôi soma chín của c c giống mía Giống Hoocmon sinh trưởng ROC22 TB(%) ± SD ROC10 TB(%) ± SD QĐ21 TB(%) ± SD 0 (Đ ) 3,67 ± 0,58 2,33 ± 0,58 2,67 ± 1,15 0,5 mg/L BAP + 0,5 mg/L kinetin 13,67 ± 1,15 10,33 ± 0,58 9,33 ± 0,58 1 mg/L BAP + 0,5 mg/L kinetin 34,67 ± 0,58 30,33 ± 0,58 25,67 ± 2,08 1,5 mg/L BAP + 0,5 mg/L kinetin 11,00 ± 1,00 8,33 ± 1,15 7,67 ± 0,58 2 mg/L BAP +0,5 mg/L kinetin 5,67 ± 1,15 4,67 ± 0,58 4,33 ± 0,58 2,5 mg/L BAP +0,5 mg/L kinetin 3,67 ± 0,58 3,33 ± 1,15 2,67 ± 0,58 Xét chi tiết, các giống đều có chồi hình thành trên các loại môi trƣờng khác nhau. Số lƣợng chồi tạo thành khác nhau tùy từng loại môi trƣờng Trên môi trƣờng MS, các giống m a cho số chồi tạo thành/cụm phôi t nhất, giống cho số chồi cao nhất là RO 22 chỉ đạt 3,67 chồi/0,5 g cụm phôi soma Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/L BAP và 0,5 mg/L kinetin cho số chồi/cụm phôi soma cao hơn cả ở ba giống RO 22, RO 10, QĐ21 lần lƣợt là 34,76; 30,33; 25,67 chồi/0,5 g cụm phôi. Nhƣ vậy, trong 3 giống đƣợc đƣa vào khảo sát, giống RO 22 có khả năng tái sinh tốt và số chồi tái sinh từ phôi soma cao nhất Môi trƣờng th ch hợp để tái sinh tốt phải là môi trƣờng vừa cho tỷ lệ tái sinh cao, vừa cho số chồi tạo thành/0,5 g cụm phôi lớn Tổ hợp hai điều kiện này, chúng tôi chọn giống RO 22 để thực hiện th nghiệm chuyển gen tiếp theo và môi trƣờng tái sinh đa chồi phù hợp nhất là MS có bổ sung 1 mg/L B P và 0,5 mg/L kinetin. * hả năng tạo rễ, ra cây ác chồi m a chuyển sang môi trƣờng MS bổ sung các nồng độ N khác nhau, nuôi cấy trong 4 tuần để theo d i khả năng ra r Kết quả cho thấy, r phát triển trên sáu công thức môi trƣờng, tỷ lệ ra r đạt 100% trên cả môi trƣờng đối chứng MS (Bảng 3 10) 77 Bảng 3.10: Ảnh h ởng của NAA đến hả năng ra rễ Đi m so sánh Tỷ l r rễ (%) Số rễ / hồi Giống Nồng độ NAA (mg ROC22 TB(%) ± SD ROC10 TB(% )± SD QĐ21 TB (%) ± SD ROC22 TB ± SD ROC10 TB ± SD QĐ21 TB ± SD 0 (Đ ) 29,24 ± 0,33 11,47 ± 1,42 10,68 ± 0,24 2,51 ± 0,03 2,37 ± 0,28 1,51 ± 0,30 1 mg/L 40,17 ± 0,51 19,17 ± 0,43 15,32 ± 0,40 4,55 ± 0,32 5,26 ± 1,06 4,22 ± 0,14 2 mg/L 100,00 ± 0,00 69,45 ± 0,50 43,16 ± 0,98 9,36 ± 0,13 6,90 ± 0,85 7,19 ± 0,31 3 mg/L 68,85 ± 0,19 49,90 ± 1,49 28,59 ± 0,25 7,59 ± 0,04 5,73 ± 0,27 5,49 ± 0,18 4 mg/L 48,24 ± 0,56 41,61 ± 0,77 11,98 ± 0,86 5,70 ± 0,44 3,61 ± 0,31 4,67 ± 0,27 5 mg/L 19,58 ± 0,13 10,53 ± 0,16 9,33 ± 0