MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .vi
DANH MỤC HÌNH.viii
DANH MỤC BẢNG .xi
ĐẶT VẤN ĐỀ.1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .5
1.1. Insulin và vai tròđối với cơ thể .5
1.2. Bệnh tiểu đường .8
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin . 10
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật.10
1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật táitổ hợp DNA .12
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli.18
1.4.1. Đặc điểm của E. colitrong sản xuất protein tái tổ hợp .18
1.4.2. Các chủng E. colithường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp .20
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli.24
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST .24
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis .25
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL.27
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP .27
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật .28
1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp.28
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ .29
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục .32
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung .32
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coliđể sản xuất protein tái tổ hợp .34
1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có hoạt tính .39
1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin .39
1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp .40
1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính .43
1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp .44
1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất insulin từ mini-proinsulin.45
1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin.47
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP .49
2.1. Dụng cụ và thiết bị .49
2.1.1. Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử .49
2.1.2. Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh .49
2.1.3. Thiết bị dùng cho tinh chế protein .49
2.1.4. Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết.50
2.2. Hóa chất và môi trường .50
2.2.1. Hóa chất .50
2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh.55
2.3. Nguyên vậtliệu .55
2.3.1. Chủng vi sinh vật.55
2.3.2. Plasmid .56
2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạodòng và giải trình tự .56
2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di .57
2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA .57
2.4. Phương pháp .58
2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpimã hóa 6xHis-MPI trong E. colibằng phương pháp PCR tái tổ hợp .58
2.4.2. Tạo dòng gen mpitrong plasmid pBlue (pBIns).61
2.4.3. Tái tạo dòng gen mpivào vector biểu hiện pET-43.1a.62
2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhậnsự biểu hiện của 6xHis-MPI .63
2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coliBL21(DE3)/pET43Ins .66
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng
E. coliBL21(DE3)/pET43Ins .66
2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môitrường LB nuôi cấy E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins.68
2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins
được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB. 68
2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coliBL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng
phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm .69
2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coliBL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy
mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L .70
2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào. 71
2.4.12. Thu nhận và làm tan thểvùi chứa 6xHis-MPI .72
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA.72
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI .72
2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI .73
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại.75
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính .75
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA . 76
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC .77
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ .77
2.4.21. Phương pháp định lượng protein .77
2.4.22. Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp.79
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN.80
3.1. Tạo dòng tế bào E. colicó khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung
hợp với 6xHis (6xHis-MPI).80
3.1.1. Tổng hợp gen mpimã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli.80
3.1.2. Tạo dòng gen mpivào plasmid pBlue .81
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coliBL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung hợp 6xHis-MPI .83
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI .87
3.2. Lên men E. coliBL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp
ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot .89
3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của
chủng E. coliBL21(DE3)/pET43Ins.89
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins.91
3.2.3. Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coliBL21(DE3)/
pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm .95
3.2.4. Nuôi cấy E. coliBL21(DE3)/pET43Ins theo phươngthức mẻ- bổ sung ở qui
mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI.101
3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên. 104
3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI .104
3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi.105
3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI .107
3.4. Thu nhận insulin từ MPI .111
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI .111
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin.116
3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột .118
3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot .119
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ.122
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .124
TÀI LIỆU THAM KHẢO .125
PHỤ LỤC.132
44 trang |
Chia sẻ: maiphuongdc | Lượt xem: 8101 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
hiên vì đa số trường hợp protein tái tổ
hợp được tạo ra dưới dạng thể vùi trong E. coli; không có hệ thống glycosyl hóa;
có sự hiện diện của nhiều protease. Nhược điểm này có thể được khắc phục
bằng cách dùng chủng chủ E. coli đột biến không có protease.
(a) (b)
-20-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Bảng 1.1. So sánh các hệ thống tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp
Đặc tính E. coli Nấm men Tế bào
côn trùng
Tế bào
động vật
Sự tăng trưởng tế bào Nhanh (30’) Nhanh (90’) Chậm (24 giờ) Chậm (24 giờ)
Môi trường tăng trưởng Đơn giản Đơn giản Phức tạp Phức tạp
Chi phí môi trường Thấp Thấp Cao Cao
Mức độ biểu hiện Cao Thấp-Cao Thấp- Cao Trung bình
Biểu hiện ở ngoại bào Chu chất Môi trường
nuôi cấy
Môi trường
nuôi cấy
Môi trường
nuôi cấy
Tái gấp cuộn protein Cần Cần Không cần Không cần
Glycosyl hóa liên kết N Không Mannose
cao
Đơn giản, không
có sialic acid
Phức tạp
Glycosyl hóa liên kết O Không Có Có Có
Phosphoryl hóa Không Có Có Có
Acetyl hóa Không Có Có Có
Acyl hóa Không Có Có Có
Gama-carboxyl hóa Không Không Không Có
1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp
Nhiều chủng E. coli khác nhau đã được nghiên cứu thiết lập để biểu hiện
protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác nhau. Khi lập phương án sản
xuất protein tái tổ hợp trong E. coli cần lựa chọn hệ thống vector biểu hiện và
chủng chủ thích hợp cho protein mục tiêu. Sau đây là một số chủng E. coli tiêu
biểu sử dụng dụng cho mục đích biểu hiện [51].
- E. coli BL21
Chủng chủ E. coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là dạng đột biến
khuyết protease OmpT và Lon và là chủng chủ tốt nhất dùng để biểu hiện
protein tái tổ hợp dung hợp với GST bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX. Tuy
nhiên, do có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng này không được dùng cho
mục đích dòng hóa. Chủng E. coli DH5α là chủng mang alen recA1 giúp cho quá
trình biến nạp và lưu trữ plasmid pGEX nên được dùng cho mục đích tạo dòng
thay cho E. coli BL21 [18],[42].
-21-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
- E. coli BL21 (DE3) pLysS
Chủng E. coli BL21(DE3)[F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), gal, dcm(DE3)]
thường được dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu
hiện pET. Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế
tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ khi không có chất cảm ứng. DNA bộ gen của
chủng chủ này chứa gen T7 1 mã hóa T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ
bacteriophage DE3 dạng tiềm tan (Hình 1.7). Gen T7 1 chịu sự điều khiển của
promotor lac. Gen lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressor của lac
operon (lacO) tham gia kiểm soát âm sự phiên mã của T7 1.
Hình 1.7. Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống vector pET trong tế bào E. coli
(DE3)pLysS.
Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO [46],
[51]. Ngoài ra, chủng chủ này có thể được thiết kế chứa thêm plasmid pLysS gọi
là E.coli BL21(DE3)pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp được một lượng nhỏ T7
lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase. Vector pET có chứa T7
promotor nên các gen nằm ở hạ lưu promotor sẽ được phiên mã nhờ hoạt tính
của T7 RNA polymerase của tế bào chủ. Như vậy chủng chủ này có đặc điểm
-22-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện pET khi không
được cảm ứng. Cũng như một số chủng chủ BL21 khác, chủng chủ E. coli BL21
(DE3)pLysS (hoặc -pLysE) cũng bị đột biến khuyết sản phẩm protease OmpT và
Lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein tổng hợp.
- E. coli M15 (pREP4)
E. coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thống
vector biểu hiện pQE. Chủng chủ này có mang plasmid pREP4 mang gen lac I
mã hóa cho repressor LacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gen nằm sau
promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng. Chủng chủ E.
coli M15 (pREP4) có kiểu gen [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-,
RecA+, Uvr+, Lon+]. Một chủng chủ khác có đặc điểm tương tự như
M15(pREP4) là SG13009 (pREP4). Ngoài ra, có thể dùng một số chủng chủ
khác để biểu hiện bằng hệ thống pQE như E. coli XL1 Blue, E. coli JM109, E.
coli TG1. Tuy nhiên, chỉ các chủng chủ có mang pREP4 cho hiệu quả biểu hiện
cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã [62].
- Chủng chủ Tuner
Các chủng chủ TunerTM là dạng đột biến làm mất gen lacY mã hóa cho lac
permease trong chủng khuyết protease BL21, được sử dụng cho các vector
pGEX, pET. Việc đột biến gen lac permease có tác dụng làm cho đồng bộ sự
tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong tất cả các tế bào trong quần thể. Khi thay đổi
nồng độ của IPTG, sự biểu hiện có thể được kiểm soát từ mức rất thấp đến mức
tối đa. Khi biểu hiện ở mức thấp, có thể làm tăng cường tính tan và hoạt tính của
các protein mục tiêu phức tạp [51].
- Chủng chủ Rosetta
Các chủng chủ RosettaTM là dẫn xuất của các chủng Tuner nên chúng có
đầy đủ các đặc tính ưu việt của chủng đột biến lacY và của BL21 [51]. Tuy nhiên
-23-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
chủng Rosetta còn có thêm đặc điểm khác là mang plamid pRARE, mã hóa
tRNAs cho các codon động vật, đây là những codon rất hiếm gặp trong E. coli,
do vậy có thể làm tăng cường tối đa sự biểu hiện. Plasmid pRARE được chọn lọc
trên chloramphenicol và có thể tương hợp với toàn bộ các vector thuộc họ pET.
- Chủng chủ Origami
Chủng chủ Origami là dẫn xuất từ K-12 đột biến cả hai gen mã hóa
thioredoxin reductase (trxB) và glutathione reductase (gor). Do vậy, chúng có
khả năng tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng Origami (DE3) làm tăng cường hoạt
tính của protein mục tiêu lên gấp 10 lần so với các chủng chủ thông thường mặc
dù tổng lượng protein biểu hiện trong cả quá trình là như nhau. Các chủng chủ
Origami có thể tương thích với các plasmid kháng ampicillin và thích hợp cho
việc sử dụng với các vector pET-43.1, pET-44 và pET-32 [51].
- Chủng chủ Origami B
Chủng chủ Origami B kết hợp tính năng gấp cuộn protein của E. coli
Origami và sự kiểm soát biểu hiện chính xác của các chủng Tuner. Các chủng
này mang bộ gen khuyết các protease của BL21 và tương thích với các plasmid
kháng ampicillin [51].
- Chủng chủ Rosetta-gami
Chủng chủ Rosetta-gami là dẫn xuất từ chủng Origami và mang plasmid
pRARE mã hóa cho các tRNAs hiếm trong chủng K-12 đột biến trxB/gor để tăng
cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Các chủng này có
thể tương hợp với các vector kháng ampicillin như pET-43.1, pET-44 và pET-32.
- Chủng chủ AD494
Chủng chủ AD494 có dẫn xuất từ chủng đột biến trxB K-12, làm tăng
cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Chủng đột biến trxB
-24-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
được chọn lọc bằng karamycin do vậy nên có thể dùng với các marker bla kháng
ampicillin [51].
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST
Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung là có chứa tac promotor
(Ptac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu theo cơ chế kiểm
soát âm được cảm ứng bằng IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) hoặc các chất
tương đồng về cấu trúc. Họ vector pGEX có gồm tất cả 13 vector tương tự như
vector pGEX-2TK (Hình 1.8).
Hình 1.8. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pGEX 2TK.
Trong họ vector pGEX, có 9 vector có vùng MCS rộng, chứa đến 6 vị trí
cắt giới hạn của các enzyme, giúp dễ dàng trong việc dòng hóa. Vector pGEX-
2TK có vị trí MCS rất khác biệt so với các vector khác trong họ vector pGEX,
được thiết kế cho phép phát hiện các protein đã biểu hiện bằng cách đánh dấu
trực tiếp in vitro. Vùng MCS này nằm về phía hạ lưu của trình tự nhận biết của
kinase được ly trích từ cơ tim [8].
-25-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
GST (Glutathione S-Transferase) là họ enzyme có thể chuyển nhóm S
của glutathione vào những cơ chất như nitro và các hợp chất của halogen, làm
cho chúng bị khử độc tính [50]. Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp
dung hợp với GST. Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione.
Đặc tính này giúp việc thu nhận dễ dàng protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với
GST. GST còn có vai trò trong sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng
phương pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có
màu như CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc bằng phương pháp miễn dịch
dựa trên kháng thể đặc hiệu của GST. Hệ thống gen dung hợp GST đã được ứng
dụng thành công trong nhiều lĩnh vực như trong miễn dịch học phân tử [9], trong
sản xuất vắc xin (đối với các protein có kích thước phân tử nhỏ khi dung hợp với
GST thành kích thước lớn hơn làm tăng tính kháng nguyên), trong nghiên cứu
tương tác protein-protein, hoặc tương tác protein-DNA [26], [33].
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis
Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein
tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) trong tế bào E.
coli. Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt
tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7 (Hình
1.9). Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligo-histidine gọi là thẻ His
(His-tag), đoạn này có thể chứa 6 hoặc 8 hoặc 10 amino acid. Tùy theo plasmid
mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp
với vai trò hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho sự phát hiện
protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag.
Protein tái tổ hợp chứa 6xHis có thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng
cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA), nhờ tương tác
-26-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
giữa 6xHis và Ni2+ (Hình 1.10) sau đó ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm cạnh
tranh là imidazone [46],[51].
Hình 1.9. Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+).
Hình 1.10. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel.
-27-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL
Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu được chèn vào vector
pMAL ở vùng hạ lưu từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP
(Maltose Binding Protein). Hệ thống này sử dụng promotor mạnh Ptac để biểu
hiện một lượng lớn protein dung hợp, sau đó được thu nhận bằng sắc ký ái lực
dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amylose (Hình 1.11) [48]. Hệ thống pMAL
có khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao
(100 mg / L) trong E. coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [50].
Hình 1.11. Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein có gắn thẻ MBP.
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP
Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Purification
with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp
(intein) trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp (phân tử intein từ Sac.
cerevisiae VM1) (Hình 1.12) [47]. Phân tử intein này được biến đổi để có thể thực
-28-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 4oC với các tác nhân
thiol như DTT (1,4-Dithiothreitol), β-Mercaptoethanol hoặc cysteine. Trong hệ
thống này gen mã hóa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là
đoạn gen mã hóa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước
5 kDa từ Bacillus circulan. Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với
CBP sẽ được giữ lại. Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 4oC bởi DTT
hoặc β-Mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột.
Hình 1.12. Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin.
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật
1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp
Lên men E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp có thể được thực hiện theo
các phương pháp: mẻ (batch), mẻ-bổ sung (fed-batch), liên tục (continuous).
-29-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Trong phương pháp lên men mẻ, chủng vi sinh được cấy vào môi trường dinh
dưỡng với một tỷ lệ thích hợp, quá trình lên men bắt đầu diễn ra mà không có sự
bổ sung bất kỳ nguồn dinh dưỡng nào. Trong phương pháp lên men mẻ-bổ sung,
chất dinh dưỡng được bổ sung tăng dần lên ở những thời điểm khác nhau mà
không rút dịch nuôi cấy ra ngoài cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Đối với
lên men theo kiểu liên tục, nguồn dinh dưỡng được bổ sung liên tục trong quá
trình lên men và dịch lên men cũng được chiết ra liên tục, cân bằng với tốc độ
bổ sung nguồn dinh dưỡng một khi thể tích dịch lên men đạt đến mức tới hạn
(Hình 1.13). Do các qui trình lên men sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp
thường là dạng hiếu khí có kiểm soát, nên cần thiết phải cung cấp oxygen trong
quá trình nuôi cấy, ngoài ra trong một vài trường hợp cần bổ sung thêm chất phá
bọt và đôi khi có cả acid hoặc base để hiệu chỉnh pH [61].
Hình 1.13. Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất
trong quá trình nuôi cấy theo thời gian của các phương pháp lên men.
(a) Phương pháp mẻ, (b) Phương pháp mẻ-bổ sung, (c) Phương pháp
liên tục.
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ
Trong phương pháp lên men mẻ (batch culture) thì toàn bộ những biến đổi
trong nồi lên men như thành phần môi trường nuôi cấy, nồng độ tế bào vi sinh
vật, hàm lượng của các chất trao đổi… là kết quả của quá trình tăng trưởng tế
-30-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
bào, của sự trao đổi chất trong nội bào [61]. Quá trình lên men mẻ diễn ra qua 4
giai đoạn (Hình 1.14).
Giai đoạn đầu tiên là ngay sau khi cấy giống vào hệ thống gọi là lag pha
(a). Trong giai đoạn này quá trình tăng trưởng hầu như không xảy ra, vi sinh vật
thích ứng với môi trường và điều kiện nuôi cấy mới. Khi nuôi cấy vi sinh vật với
qui mô sản xuất cần phải giảm thiểu giai đoạn này. Trong giai đoạn tiếp theo
(log pha) (b), vi sinh vật bắt đầu tăng trưởng nhanh dần và đạt tốc độ cao nhất
sau đó chậm dần. Ở giai đoạn ổn định (stationary phase) (c), mật độ tế bào hầu
như không thay đổi do sự giới hạn của một số cơ chất dinh dưỡng trong môi
trường nuôi cấy và sau đó quá trình nuôi cấy đi vào pha suy vong (death phase)
(d) khi mà môi trường nuôi cấy trở nên bất lợi như nguồn dinh dưỡng cạn kiệt,
một số chất gây ức chế được sinh ra bởi chính vi sinh vật trong các pha trước đó.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 10 20 30 40
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Ln
(n
ồn
g
đo
ä te
á b
ào
)
Hình 1.14. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ.
Sự biến đổi mật độ tế bào trong log pha có thể được biểu diễn theo
phương trình dx/dt = μ.x (1), trong đó x là mật độ tế bào vi sinh vật; t là thời gian
lên men (giờ) và μ là tốc độ tăng trưởng đặc trưng, giờ-1. Từ phương trình trên, ta
(a) (b) (c) (d)
-31-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
có: dx/x = μdt Ỉ ∫ ∫=
t
to
t
to
dtxdx μ/ Ỉ (lnxt- lnxo) = μ(t-to) (2). Trong đó xo là
lượng sinh khối ban đầu (to) xt: lượng sinh khối sau thời gian nuôi cấy t (giờ).
Môi trường nuôi trong pha log rất giàu dinh dưỡng, các điều kiện nuôi cấy
tối ưu, do vậy vi sinh vật có thể tăng trưởng với tốc độ tối đa, μmax. Sự phụ thuộc
của mật độ vi sinh vật (x) vào cơ chất dinh dưỡng có thể biểu diễn qua phương
trình: x = Yb/s(si - sr) (3). Trong đó Yb/s là hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành sinh
khối (g/g), si, sr lần lượt là nồng độ cơ chất ban đầu và còn lại sau thời gian nuôi
cấy t (giờ). Phương trình trên có thể dùng để dự đoán được nồng độ tế bào thông
qua lượng cơ chất sử dụng và hiệu suất tổng hợp sinh khối (Yb/s). Sự phụ thuộc
của tốc độ tăng trưởng vào nồng độ cơ chất giới hạn trong môi trường nuôi cấy
có thể mô tả theo phương trình Monod như sau: μ=μmax .sr/(Ks+ sr) (4). Trong đó
Ks là hằng số sử dụng cơ chất. Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi
sinh vật có Ks khác nhau. Trong pha ổn định tốc độ tăng trưởng μ Ỉ 0, khi đó
các hoạt động trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật tiếp tục diễn ra với tốc độ
cao, đặc biệt là các chất trao đổi thứ cấp (không xảy ra trong pha tăng trưởng).
Theo Pirt (1975) [61] thì động học của sự hình thành sản phẩm trao đổi chất của
vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy được phân biệt ra thành hai dạng: các sản
phẩm phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng sơ cấp) và các sản phẩm
không phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng thứ cấp). Sự hình thành các
sản phẩm biến dưỡng sơ cấp có thể được mô tả theo phương trình: dp/dt = qp.x
(5). Trong đó p là nồng độ sản phẩm, qp là tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng (mg
sản phẩm/g sinh khối/giờ). Mặt khác, sự hình thành sản phẩm liên quan đến sinh
khối tế bào theo phương trình: dp/dx = Yp/x (6). Trong đó Yp/x là hiệu suất sản
phẩm theo sinh khối tế bào (g sản phẩm/ g sinh khối). Từ hai phương trình trên ta
có: (dp/dt)/(dp/dx) = qp.x/Yp/x Ỉ dx/dt = qp.x/Yp/x (7), mà dx/dt = μ.x.
-32-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
Do vậy μ.x = qp.x/Yp/x Ỉ qp = μ.Yp/x (8)
Như vậy, tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng
đặc trưng của chủng trong quá trình nuôi cấy [61].
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục
Pha tăng trưởng trong nuôi cấy dạng mẻ có thể được tiếp tục duy trì bằng
cách bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng vào nồi lên men. Thông thường môi
trường bổ sung này có chứa cơ chất giới hạn. Trong quá trình lên men, nếu
không có sự ảnh hưởng của các chất ức chế thì sự tăng trưởng của chủng được
duy trì đến khi cơ chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt. Cơ chất dinh dưỡng
được bổ sung liên tục cho đến khi nồi lên men đạt thể tích giới hạn. Khi đó, bắt
đầu thực hiện việc chiết dịch lên men ra khỏi nồi theo tốc độ cân bằng với lưu
lượng nạp cơ chất dinh dưỡng và thể tích dịch lên men trong nồi được duy trì ở
mức giới hạn. Phương pháp lên men này gọi là lên men liên tục (continuous
culture). Sự biến động thể tích dịch lên men do việc nạp môi trường dinh dưỡng
vào được xác định bởi độ pha loãng D: D = F/V (9). Trong đó F là lưu tốc nạp
liệu (dm3/hr), V là thể tích (dm3). Tổng sự biến đổi nồng độ tế bào trong một
khoảng thời gian nhất định của quá trình nuôi cấy có thể được biểu diễn:
dx/dt = tăng trưởng – chiết suất hay dx/dt = μ.x - D.x (10)
Trong điều kiện ổn định, hệ thống cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên
men không thay đổi, lúc đó dx/dt = 0, từ đó μ = D. Như vậy, đối với phương pháp
lên men liên tục, chúng ta có thể dùng độ pha loãng D (hay tốc độ bổ sung dinh
dưỡng F) để kiểm soát tốc độ tăng trưởng đặc trưng μ của chủng nuôi cấy.
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung
Năm 1973, Yoshida và cộng sự [61] đã giới thiệu một dạng lên men khác
gọi là fed-batch, lên men mẻ-bổ sung: nuôi cấy theo dạng mẻ có bổ sung dinh
-33-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
dưỡng liên tục nhưng không chiết xuất dịch nuôi cấy. Chất dinh dưỡng được nạp
vào hệ thống trong kiểu lên men này theo một số phương án sau: (i) Dịch bổ
sung hoàn toàn giống như môi trường dinh dưỡng ban đầu; (ii) Dịch bổ sung có
chứa cơ chất giới hạn với nồng độ giống như nồng độ của cơ chất này trong môi
trường ban đầu; (iii) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ đậm đặc;
(iv) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ rất đậm đặc, làm tăng
không đáng kể thể tích dịch lên men. Hệ thống lên men mẻ-bổ sung theo (i) và
(ii) làm thay đổi thể tích dịch lên men trong quá trình nuôi cấy, gọi là hệ thống
lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích. Theo phương án (iii), (iv), không làm thay
đổi đáng kể thể tích dịch lên men nên được gọi là hệ thống lên men mẻ-bổ sung
không thay đổi thể tích.
- Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích
Xét quá trình lên men theo phương pháp mẻ trong đó sự tăng trưởng bị
giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất dinh dưỡng, nồng độ sinh khối được biểu
thị bằng phương trình: xt = xo + Y(si-sr) (11). Trong đó xt là nồng độ sinh khối sau
thời gian nuôi cấy t giờ, xo là nồng độ tế bào tại thời điểm nạp giống vào, si, sr là
nồng độ cơ chất giới hạn trong môi trường ban đầu và còn lại trong quá trình
nuôi cấy. Giả sử xo là rất nhỏ, khi sr = 0 thì: xt = xmax = Y.si (12). Nếu tại thời
điểm sr = 0, môi trường dinh dưỡng được nạp vào với tốc độ pha loãng D < μmax
thì khi đó hầu như toàn bộ chất dinh dưỡng đưa vào đều bị sử dụng hết và như
vậy: F.si= μ.(X/Y) (13). Trong đó F là tốc độ nạp liệu, X là tổng sinh khối trong
dịch nuôi cấy, X = x.V với V là thể tích dịch nuôi cấy tại thời điểm t. Từ phương
trình trên, có thể thấy lượng cơ chất dinh dưỡng đưa vào hệ thống được vi sinh
vật sử dụng hết ngay lập tức và do vậy ds/dt = 0. Mặc dù tổng lượng sinh khối X
tăng lên theo thời gian nhưng nồng độ tế bào x không thay đổi, dx/dt = 0 nên μ =
D. Khi thể tích dịch lên men tăng lên, D giảm xuống: D = F/(Vo+Ft) (14), Vo là
-34-
Luận án Tiến sĩ Tổng quan
thể tích dịch lên men ban đầu. Năm 1979, Pirt [61] đã mô tả sự biến động của
nồng độ cơ chất của kiểu lên men này trong quá trình nuôi cấy theo phương
trình: dp/dt=qp.x - Dp (15).
Phương án bổ sung dinh dưỡng vào trong hệ thống kiểu này cần phải được
tối ưu hóa theo mối quan hệ của qp và μ (D).
- Lên men mẻ-bổ sung cố định thể tích
Xét quá trình lên men khi môi trường dinh dưỡng ban đầu cạn kiệt, cơ
chất giới hạn với nồng độ đậm đặc được nạp vào hệ thống nhưng không làm
thay đổi thể tích dịch lên men: dx/dt = GY, nhưng dx/dt = μ.x.
Do đó: μ = GY/x (16). Trong đó G là tốc độ bổ sung cơ chất dinh dưỡng
(g/dm3/hr), Y là hiệu suất. Nếu GY/x < μmax thì cơ chất giới hạn sẽ được sử dụng
ngay khi vừa được bổ sung vào nồi lên men và ds/dt=0, tuy nhiên dx/dt ≠ 0 bởi vì
nồng độ và lượng tế bào trong nồi lên men sẽ tăng lên theo thời gian. Sự thay
đổi nồng độ tế bào trong quá trình nuôi cấy theo kiểu lên men này có thể được
mô tả theo phương trình: xt = xo + GYt (17).
Sự biến đổi nồng độ sản phẩm trong cũng có thể được biểu diễn bằng
phương trình: dp/dt = qp.x = qp(xo+ GYt) (18).
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để
sản xuất protein tái tổ hợp
Có n