Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

hiên vì đa số trường hợp protein tái tổ hợp được tạo ra dưới dạng thể vùi trong E. coli; không có hệ thống glycosyl hóa; có sự hiện diện của nhiều protease. Nhược điểm này có thể được khắc phục bằng cách dùng chủng chủ E. coli đột biến không có protease. (a) (b) -20- Luận án Tiến sĩ Tổng quan Bảng 1.1. So sánh các hệ thống tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp Đặc tính E. coli Nấm men Tế bào côn trùng Tế bào động vật Sự tăng trưởng tế bào Nhanh (30’) Nhanh (90’) Chậm (24 giờ) Chậm (24 giờ) Môi trường tăng trưởng Đơn giản Đơn giản Phức tạp Phức tạp Chi phí môi trường Thấp Thấp Cao Cao Mức độ biểu hiện Cao Thấp-Cao Thấp- Cao Trung bình Biểu hiện ở ngoại bào Chu chất Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy Tái gấp cuộn protein Cần Cần Không cần Không cần Glycosyl hóa liên kết N Không Mannose cao Đơn giản, không có sialic acid Phức tạp Glycosyl hóa liên kết O Không Có Có Có Phosphoryl hóa Không Có Có Có Acetyl hóa Không Có Có Có Acyl hóa Không Có Có Có Gama-carboxyl hóa Không Không Không Có 1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp Nhiều chủng E. coli khác nhau đã được nghiên cứu thiết lập để biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác nhau. Khi lập phương án sản xuất protein tái tổ hợp trong E. coli cần lựa chọn hệ thống vector biểu hiện và chủng chủ thích hợp cho protein mục tiêu. Sau đây là một số chủng E. coli tiêu biểu sử dụng dụng cho mục đích biểu hiện [51]. - E. coli BL21 Chủng chủ E. coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là dạng đột biến khuyết protease OmpT và Lon và là chủng chủ tốt nhất dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX. Tuy nhiên, do có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng này không được dùng cho mục đích dòng hóa. Chủng E. coli DH5α là chủng mang alen recA1 giúp cho quá trình biến nạp và lưu trữ plasmid pGEX nên được dùng cho mục đích tạo dòng thay cho E. coli BL21 [18],[42]. -21- Luận án Tiến sĩ Tổng quan - E. coli BL21 (DE3) pLysS Chủng E. coli BL21(DE3)[F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), gal, dcm(DE3)] thường được dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu hiện pET. Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ khi không có chất cảm ứng. DNA bộ gen của chủng chủ này chứa gen T7 1 mã hóa T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ bacteriophage DE3 dạng tiềm tan (Hình 1.7). Gen T7 1 chịu sự điều khiển của promotor lac. Gen lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressor của lac operon (lacO) tham gia kiểm soát âm sự phiên mã của T7 1. Hình 1.7. Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống vector pET trong tế bào E. coli (DE3)pLysS. Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO [46], [51]. Ngoài ra, chủng chủ này có thể được thiết kế chứa thêm plasmid pLysS gọi là E.coli BL21(DE3)pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp được một lượng nhỏ T7 lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase. Vector pET có chứa T7 promotor nên các gen nằm ở hạ lưu promotor sẽ được phiên mã nhờ hoạt tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ. Như vậy chủng chủ này có đặc điểm -22- Luận án Tiến sĩ Tổng quan hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện pET khi không được cảm ứng. Cũng như một số chủng chủ BL21 khác, chủng chủ E. coli BL21 (DE3)pLysS (hoặc -pLysE) cũng bị đột biến khuyết sản phẩm protease OmpT và Lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein tổng hợp. - E. coli M15 (pREP4) E. coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thống vector biểu hiện pQE. Chủng chủ này có mang plasmid pREP4 mang gen lac I mã hóa cho repressor LacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gen nằm sau promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng. Chủng chủ E. coli M15 (pREP4) có kiểu gen [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+]. Một chủng chủ khác có đặc điểm tương tự như M15(pREP4) là SG13009 (pREP4). Ngoài ra, có thể dùng một số chủng chủ khác để biểu hiện bằng hệ thống pQE như E. coli XL1 Blue, E. coli JM109, E. coli TG1. Tuy nhiên, chỉ các chủng chủ có mang pREP4 cho hiệu quả biểu hiện cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã [62]. - Chủng chủ Tuner Các chủng chủ TunerTM là dạng đột biến làm mất gen lacY mã hóa cho lac permease trong chủng khuyết protease BL21, được sử dụng cho các vector pGEX, pET. Việc đột biến gen lac permease có tác dụng làm cho đồng bộ sự tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong tất cả các tế bào trong quần thể. Khi thay đổi nồng độ của IPTG, sự biểu hiện có thể được kiểm soát từ mức rất thấp đến mức tối đa. Khi biểu hiện ở mức thấp, có thể làm tăng cường tính tan và hoạt tính của các protein mục tiêu phức tạp [51]. - Chủng chủ Rosetta Các chủng chủ RosettaTM là dẫn xuất của các chủng Tuner nên chúng có đầy đủ các đặc tính ưu việt của chủng đột biến lacY và của BL21 [51]. Tuy nhiên -23- Luận án Tiến sĩ Tổng quan chủng Rosetta còn có thêm đặc điểm khác là mang plamid pRARE, mã hóa tRNAs cho các codon động vật, đây là những codon rất hiếm gặp trong E. coli, do vậy có thể làm tăng cường tối đa sự biểu hiện. Plasmid pRARE được chọn lọc trên chloramphenicol và có thể tương hợp với toàn bộ các vector thuộc họ pET. - Chủng chủ Origami Chủng chủ Origami là dẫn xuất từ K-12 đột biến cả hai gen mã hóa thioredoxin reductase (trxB) và glutathione reductase (gor). Do vậy, chúng có khả năng tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng Origami (DE3) làm tăng cường hoạt tính của protein mục tiêu lên gấp 10 lần so với các chủng chủ thông thường mặc dù tổng lượng protein biểu hiện trong cả quá trình là như nhau. Các chủng chủ Origami có thể tương thích với các plasmid kháng ampicillin và thích hợp cho việc sử dụng với các vector pET-43.1, pET-44 và pET-32 [51]. - Chủng chủ Origami B Chủng chủ Origami B kết hợp tính năng gấp cuộn protein của E. coli Origami và sự kiểm soát biểu hiện chính xác của các chủng Tuner. Các chủng này mang bộ gen khuyết các protease của BL21 và tương thích với các plasmid kháng ampicillin [51]. - Chủng chủ Rosetta-gami Chủng chủ Rosetta-gami là dẫn xuất từ chủng Origami và mang plasmid pRARE mã hóa cho các tRNAs hiếm trong chủng K-12 đột biến trxB/gor để tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Các chủng này có thể tương hợp với các vector kháng ampicillin như pET-43.1, pET-44 và pET-32. - Chủng chủ AD494 Chủng chủ AD494 có dẫn xuất từ chủng đột biến trxB K-12, làm tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất. Chủng đột biến trxB -24- Luận án Tiến sĩ Tổng quan được chọn lọc bằng karamycin do vậy nên có thể dùng với các marker bla kháng ampicillin [51]. 1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli 1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung là có chứa tac promotor (Ptac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu theo cơ chế kiểm soát âm được cảm ứng bằng IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) hoặc các chất tương đồng về cấu trúc. Họ vector pGEX có gồm tất cả 13 vector tương tự như vector pGEX-2TK (Hình 1.8). Hình 1.8. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pGEX 2TK. Trong họ vector pGEX, có 9 vector có vùng MCS rộng, chứa đến 6 vị trí cắt giới hạn của các enzyme, giúp dễ dàng trong việc dòng hóa. Vector pGEX- 2TK có vị trí MCS rất khác biệt so với các vector khác trong họ vector pGEX, được thiết kế cho phép phát hiện các protein đã biểu hiện bằng cách đánh dấu trực tiếp in vitro. Vùng MCS này nằm về phía hạ lưu của trình tự nhận biết của kinase được ly trích từ cơ tim [8]. -25- Luận án Tiến sĩ Tổng quan GST (Glutathione S-Transferase) là họ enzyme có thể chuyển nhóm S của glutathione vào những cơ chất như nitro và các hợp chất của halogen, làm cho chúng bị khử độc tính [50]. Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp dung hợp với GST. Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione. Đặc tính này giúp việc thu nhận dễ dàng protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với GST. GST còn có vai trò trong sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng phương pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có màu như CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc bằng phương pháp miễn dịch dựa trên kháng thể đặc hiệu của GST. Hệ thống gen dung hợp GST đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực như trong miễn dịch học phân tử [9], trong sản xuất vắc xin (đối với các protein có kích thước phân tử nhỏ khi dung hợp với GST thành kích thước lớn hơn làm tăng tính kháng nguyên), trong nghiên cứu tương tác protein-protein, hoặc tương tác protein-DNA [26], [33]. 1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) trong tế bào E. coli. Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7 (Hình 1.9). Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligo-histidine gọi là thẻ His (His-tag), đoạn này có thể chứa 6 hoặc 8 hoặc 10 amino acid. Tùy theo plasmid mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp với vai trò hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho sự phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag. Protein tái tổ hợp chứa 6xHis có thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA), nhờ tương tác -26- Luận án Tiến sĩ Tổng quan giữa 6xHis và Ni2+ (Hình 1.10) sau đó ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm cạnh tranh là imidazone [46],[51]. Hình 1.9. Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+). Hình 1.10. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel. -27- Luận án Tiến sĩ Tổng quan 1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu được chèn vào vector pMAL ở vùng hạ lưu từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP (Maltose Binding Protein). Hệ thống này sử dụng promotor mạnh Ptac để biểu hiện một lượng lớn protein dung hợp, sau đó được thu nhận bằng sắc ký ái lực dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amylose (Hình 1.11) [48]. Hệ thống pMAL có khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao (100 mg / L) trong E. coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [50]. Hình 1.11. Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein có gắn thẻ MBP. 1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp (intein) trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp (phân tử intein từ Sac. cerevisiae VM1) (Hình 1.12) [47]. Phân tử intein này được biến đổi để có thể thực -28- Luận án Tiến sĩ Tổng quan hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 4oC với các tác nhân thiol như DTT (1,4-Dithiothreitol), β-Mercaptoethanol hoặc cysteine. Trong hệ thống này gen mã hóa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là đoạn gen mã hóa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước 5 kDa từ Bacillus circulan. Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với CBP sẽ được giữ lại. Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 4oC bởi DTT hoặc β-Mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột. Hình 1.12. Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin. 1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật 1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp Lên men E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp có thể được thực hiện theo các phương pháp: mẻ (batch), mẻ-bổ sung (fed-batch), liên tục (continuous). -29- Luận án Tiến sĩ Tổng quan Trong phương pháp lên men mẻ, chủng vi sinh được cấy vào môi trường dinh dưỡng với một tỷ lệ thích hợp, quá trình lên men bắt đầu diễn ra mà không có sự bổ sung bất kỳ nguồn dinh dưỡng nào. Trong phương pháp lên men mẻ-bổ sung, chất dinh dưỡng được bổ sung tăng dần lên ở những thời điểm khác nhau mà không rút dịch nuôi cấy ra ngoài cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Đối với lên men theo kiểu liên tục, nguồn dinh dưỡng được bổ sung liên tục trong quá trình lên men và dịch lên men cũng được chiết ra liên tục, cân bằng với tốc độ bổ sung nguồn dinh dưỡng một khi thể tích dịch lên men đạt đến mức tới hạn (Hình 1.13). Do các qui trình lên men sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp thường là dạng hiếu khí có kiểm soát, nên cần thiết phải cung cấp oxygen trong quá trình nuôi cấy, ngoài ra trong một vài trường hợp cần bổ sung thêm chất phá bọt và đôi khi có cả acid hoặc base để hiệu chỉnh pH [61]. Hình 1.13. Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất trong quá trình nuôi cấy theo thời gian của các phương pháp lên men. (a) Phương pháp mẻ, (b) Phương pháp mẻ-bổ sung, (c) Phương pháp liên tục. 1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ Trong phương pháp lên men mẻ (batch culture) thì toàn bộ những biến đổi trong nồi lên men như thành phần môi trường nuôi cấy, nồng độ tế bào vi sinh vật, hàm lượng của các chất trao đổi… là kết quả của quá trình tăng trưởng tế -30- Luận án Tiến sĩ Tổng quan bào, của sự trao đổi chất trong nội bào [61]. Quá trình lên men mẻ diễn ra qua 4 giai đoạn (Hình 1.14). Giai đoạn đầu tiên là ngay sau khi cấy giống vào hệ thống gọi là lag pha (a). Trong giai đoạn này quá trình tăng trưởng hầu như không xảy ra, vi sinh vật thích ứng với môi trường và điều kiện nuôi cấy mới. Khi nuôi cấy vi sinh vật với qui mô sản xuất cần phải giảm thiểu giai đoạn này. Trong giai đoạn tiếp theo (log pha) (b), vi sinh vật bắt đầu tăng trưởng nhanh dần và đạt tốc độ cao nhất sau đó chậm dần. Ở giai đoạn ổn định (stationary phase) (c), mật độ tế bào hầu như không thay đổi do sự giới hạn của một số cơ chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và sau đó quá trình nuôi cấy đi vào pha suy vong (death phase) (d) khi mà môi trường nuôi cấy trở nên bất lợi như nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, một số chất gây ức chế được sinh ra bởi chính vi sinh vật trong các pha trước đó. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 10 20 30 40 Thời gian nuôi cấy (giờ) Ln (n ồn g đo ä te á b ào ) Hình 1.14. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ. Sự biến đổi mật độ tế bào trong log pha có thể được biểu diễn theo phương trình dx/dt = μ.x (1), trong đó x là mật độ tế bào vi sinh vật; t là thời gian lên men (giờ) và μ là tốc độ tăng trưởng đặc trưng, giờ-1. Từ phương trình trên, ta (a) (b) (c) (d) -31- Luận án Tiến sĩ Tổng quan có: dx/x = μdt Ỉ ∫ ∫= t to t to dtxdx μ/ Ỉ (lnxt- lnxo) = μ(t-to) (2). Trong đó xo là lượng sinh khối ban đầu (to) xt: lượng sinh khối sau thời gian nuôi cấy t (giờ). Môi trường nuôi trong pha log rất giàu dinh dưỡng, các điều kiện nuôi cấy tối ưu, do vậy vi sinh vật có thể tăng trưởng với tốc độ tối đa, μmax. Sự phụ thuộc của mật độ vi sinh vật (x) vào cơ chất dinh dưỡng có thể biểu diễn qua phương trình: x = Yb/s(si - sr) (3). Trong đó Yb/s là hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành sinh khối (g/g), si, sr lần lượt là nồng độ cơ chất ban đầu và còn lại sau thời gian nuôi cấy t (giờ). Phương trình trên có thể dùng để dự đoán được nồng độ tế bào thông qua lượng cơ chất sử dụng và hiệu suất tổng hợp sinh khối (Yb/s). Sự phụ thuộc của tốc độ tăng trưởng vào nồng độ cơ chất giới hạn trong môi trường nuôi cấy có thể mô tả theo phương trình Monod như sau: μ=μmax .sr/(Ks+ sr) (4). Trong đó Ks là hằng số sử dụng cơ chất. Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi sinh vật có Ks khác nhau. Trong pha ổn định tốc độ tăng trưởng μ Ỉ 0, khi đó các hoạt động trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật tiếp tục diễn ra với tốc độ cao, đặc biệt là các chất trao đổi thứ cấp (không xảy ra trong pha tăng trưởng). Theo Pirt (1975) [61] thì động học của sự hình thành sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy được phân biệt ra thành hai dạng: các sản phẩm phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng sơ cấp) và các sản phẩm không phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng thứ cấp). Sự hình thành các sản phẩm biến dưỡng sơ cấp có thể được mô tả theo phương trình: dp/dt = qp.x (5). Trong đó p là nồng độ sản phẩm, qp là tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng (mg sản phẩm/g sinh khối/giờ). Mặt khác, sự hình thành sản phẩm liên quan đến sinh khối tế bào theo phương trình: dp/dx = Yp/x (6). Trong đó Yp/x là hiệu suất sản phẩm theo sinh khối tế bào (g sản phẩm/ g sinh khối). Từ hai phương trình trên ta có: (dp/dt)/(dp/dx) = qp.x/Yp/x Ỉ dx/dt = qp.x/Yp/x (7), mà dx/dt = μ.x. -32- Luận án Tiến sĩ Tổng quan Do vậy μ.x = qp.x/Yp/x Ỉ qp = μ.Yp/x (8) Như vậy, tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng đặc trưng của chủng trong quá trình nuôi cấy [61]. 1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục Pha tăng trưởng trong nuôi cấy dạng mẻ có thể được tiếp tục duy trì bằng cách bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng vào nồi lên men. Thông thường môi trường bổ sung này có chứa cơ chất giới hạn. Trong quá trình lên men, nếu không có sự ảnh hưởng của các chất ức chế thì sự tăng trưởng của chủng được duy trì đến khi cơ chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt. Cơ chất dinh dưỡng được bổ sung liên tục cho đến khi nồi lên men đạt thể tích giới hạn. Khi đó, bắt đầu thực hiện việc chiết dịch lên men ra khỏi nồi theo tốc độ cân bằng với lưu lượng nạp cơ chất dinh dưỡng và thể tích dịch lên men trong nồi được duy trì ở mức giới hạn. Phương pháp lên men này gọi là lên men liên tục (continuous culture). Sự biến động thể tích dịch lên men do việc nạp môi trường dinh dưỡng vào được xác định bởi độ pha loãng D: D = F/V (9). Trong đó F là lưu tốc nạp liệu (dm3/hr), V là thể tích (dm3). Tổng sự biến đổi nồng độ tế bào trong một khoảng thời gian nhất định của quá trình nuôi cấy có thể được biểu diễn: dx/dt = tăng trưởng – chiết suất hay dx/dt = μ.x - D.x (10) Trong điều kiện ổn định, hệ thống cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên men không thay đổi, lúc đó dx/dt = 0, từ đó μ = D. Như vậy, đối với phương pháp lên men liên tục, chúng ta có thể dùng độ pha loãng D (hay tốc độ bổ sung dinh dưỡng F) để kiểm soát tốc độ tăng trưởng đặc trưng μ của chủng nuôi cấy. 1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung Năm 1973, Yoshida và cộng sự [61] đã giới thiệu một dạng lên men khác gọi là fed-batch, lên men mẻ-bổ sung: nuôi cấy theo dạng mẻ có bổ sung dinh -33- Luận án Tiến sĩ Tổng quan dưỡng liên tục nhưng không chiết xuất dịch nuôi cấy. Chất dinh dưỡng được nạp vào hệ thống trong kiểu lên men này theo một số phương án sau: (i) Dịch bổ sung hoàn toàn giống như môi trường dinh dưỡng ban đầu; (ii) Dịch bổ sung có chứa cơ chất giới hạn với nồng độ giống như nồng độ của cơ chất này trong môi trường ban đầu; (iii) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ đậm đặc; (iv) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ rất đậm đặc, làm tăng không đáng kể thể tích dịch lên men. Hệ thống lên men mẻ-bổ sung theo (i) và (ii) làm thay đổi thể tích dịch lên men trong quá trình nuôi cấy, gọi là hệ thống lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích. Theo phương án (iii), (iv), không làm thay đổi đáng kể thể tích dịch lên men nên được gọi là hệ thống lên men mẻ-bổ sung không thay đổi thể tích. - Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích Xét quá trình lên men theo phương pháp mẻ trong đó sự tăng trưởng bị giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất dinh dưỡng, nồng độ sinh khối được biểu thị bằng phương trình: xt = xo + Y(si-sr) (11). Trong đó xt là nồng độ sinh khối sau thời gian nuôi cấy t giờ, xo là nồng độ tế bào tại thời điểm nạp giống vào, si, sr là nồng độ cơ chất giới hạn trong môi trường ban đầu và còn lại trong quá trình nuôi cấy. Giả sử xo là rất nhỏ, khi sr = 0 thì: xt = xmax = Y.si (12). Nếu tại thời điểm sr = 0, môi trường dinh dưỡng được nạp vào với tốc độ pha loãng D < μmax thì khi đó hầu như toàn bộ chất dinh dưỡng đưa vào đều bị sử dụng hết và như vậy: F.si= μ.(X/Y) (13). Trong đó F là tốc độ nạp liệu, X là tổng sinh khối trong dịch nuôi cấy, X = x.V với V là thể tích dịch nuôi cấy tại thời điểm t. Từ phương trình trên, có thể thấy lượng cơ chất dinh dưỡng đưa vào hệ thống được vi sinh vật sử dụng hết ngay lập tức và do vậy ds/dt = 0. Mặc dù tổng lượng sinh khối X tăng lên theo thời gian nhưng nồng độ tế bào x không thay đổi, dx/dt = 0 nên μ = D. Khi thể tích dịch lên men tăng lên, D giảm xuống: D = F/(Vo+Ft) (14), Vo là -34- Luận án Tiến sĩ Tổng quan thể tích dịch lên men ban đầu. Năm 1979, Pirt [61] đã mô tả sự biến động của nồng độ cơ chất của kiểu lên men này trong quá trình nuôi cấy theo phương trình: dp/dt=qp.x - Dp (15). Phương án bổ sung dinh dưỡng vào trong hệ thống kiểu này cần phải được tối ưu hóa theo mối quan hệ của qp và μ (D). - Lên men mẻ-bổ sung cố định thể tích Xét quá trình lên men khi môi trường dinh dưỡng ban đầu cạn kiệt, cơ chất giới hạn với nồng độ đậm đặc được nạp vào hệ thống nhưng không làm thay đổi thể tích dịch lên men: dx/dt = GY, nhưng dx/dt = μ.x. Do đó: μ = GY/x (16). Trong đó G là tốc độ bổ sung cơ chất dinh dưỡng (g/dm3/hr), Y là hiệu suất. Nếu GY/x < μmax thì cơ chất giới hạn sẽ được sử dụng ngay khi vừa được bổ sung vào nồi lên men và ds/dt=0, tuy nhiên dx/dt ≠ 0 bởi vì nồng độ và lượng tế bào trong nồi lên men sẽ tăng lên theo thời gian. Sự thay đổi nồng độ tế bào trong quá trình nuôi cấy theo kiểu lên men này có thể được mô tả theo phương trình: xt = xo + GYt (17). Sự biến đổi nồng độ sản phẩm trong cũng có thể được biểu diễn bằng phương trình: dp/dt = qp.x = qp(xo+ GYt) (18). 1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp Có n