Luận án Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus Monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm - Nguyễn Thị Minh Thanh

LỜI CẢM ƠN.i

LỜI CAM ĐOAN . iii

MỤC LỤC.iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vii

DANH MỤC CÁC BẢNG .ix

DANH MỤC CÁC HÌNH .xi

MỞ ĐẦU .1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5

1.1. Tôm sú Penaeus monodon .5

1.1.1. Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý .5

1.1.2. Khái quát tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và ở Việt Nam.8

1.2. Các kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử thông dụng.14

1.3. Ứng dụng kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình

hệ gen tôm sú .23

1.4. Phương pháp GBS và ứng dụng trong chọn giống .30

1.5. Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) và ứng dụng .37

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.39

2.1. Vật liệu nghiên cứu .39

2.1.1. Mẫu tôm sú.39

2.1.2. Hóa chất .40

2.1.3. Thiết bị .43

2.2. Phương pháp nghiên cứu.44

2.2.1. Thu mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen .44

2.2.2. Thu mẫu tôm sú tự nhiên làm tôm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và

chăm sóc tôm bố mẹ.45

2.2.3. Thiết lập các gia đình tôm sú tạo thế hệ Go và G1 .46

2.2.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định nồng độ DNA tổng số từ mô cơ tôm sú.48v

2.2.5. Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose.49

2.2.6. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen.50

2.2.7. Phân tích kết quả AFLP trên máy xác định trình tự tự động sử dụng điện

di mao quản và phần mềm phân tích đoạn .54

2.2.8. Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tôm sú.55

2.2.9. Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan .58

2.2.10. Xác định trình tự amino acid của contig và đánh giá mức độ tương đồng

với gen mã hóa protein quan tâm .59

2.2.11. Phương pháp KASP .60

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .61

3.1. Đa hình AFLP ở các quần đàn tôm sú Việt Nam.61

3.1.1. Kiểm tra hoạt tính cắt DNA của cặp enzyme EcoRI và MseI .61

3.1.2. Tách DNA tổng số từ tôm sú để thực hiện kỹ thuật AFLP.62

3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng tiền chọn lọc.62

3.1.4. Đa hình AFLP trong các quần đàn và giữa các quần đàn tôm sú .64

3.1.5. Cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Việt Nam .78

3.2. Sản xuất tôm sú thế hệ Go, G1 .79

3.2.1. Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào .79

3.2.2. Thiết lập các gia đình tôm sú thế hệ Go, G1.81

3.3. Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng

tăng trưởng ở tôm sú.85

3.3.1. Giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm

thời. 85

3.3.2. Sàng lọc SNP.88

3.3.3. Chú giải gen chức năng từ dữ liệu giải trình tự tôm sú.88

3.3.4. Xác định chỉ thị SNP và tương quan giữa các contig chứa SNP với gen

MHC.91

3.3.5. Xác định vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa

protein MHC, xác định codon chứa SNP và vị trí tương ứng của chỉ thịvi

SNP trên gen MHC .94

3.4. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương

pháp KASP .97

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ.99

4.1. Chọn địa điểm thu mẫu để nghiên cứu đa hình di truyền .99

4.2. Tách DNA tổng số từ tôm sú tạo vật liệu nghiên cứu .100

4.3. Kết quả phản ứng tiền chọn lọc AFLP.102

4.4. Đa hình AFLP trong các quần đàn tôm sú .104

4.5. Lựa chọn kỹ thuật chỉ thị AFLP để đánh giá đa hình hệ gen tôm sú.107

4.6. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú .108

4.7. Tạo vật liệu tôm sú thế hệ Go, G1.110

4.8. Ứng dụng kỹ thuật GBS để sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên

quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú .112

4.9. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp

KASP và tiềm năng ứng dụng trong chọn giống .121

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .125

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.126

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .127

TÀI LIỆU THAM KHẢO .134

PHỤ LỤC

pdf193 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 428 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus Monodon) Việt Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm - Nguyễn Thị Minh Thanh, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
47, 52, 60, 65, 66, 67, 73, 77, 78, 81, 84, 86, 88, 96, 106, 108, 111, 112, 120, 128, 132, 157, 200, 215, 229, 234, 235, 242, 246, 251, 259, 275 NB7 77 12, 14, 16, 17, 19, 21, 23, 26, 28, 29, 31, 34, 38, 40, 41, 47, 49, 50, 52, 55, 56, 58, 60, 62, 64, 65, 69, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 95, 96, 100, 102, 107, 108, 111, 117, 118, 121, 124, 125, 128, 132, 137, 141, 143, 147, 149, 154, 155, 172, 173, 175, 179, 182, 184, 185, 189, 197, 200, 204, 207, 215, 216, 236, 254, 264, 275 NB8 40 11, 13, 14, 16, 17, 26, 28, 31, 36, 39, 40, 41, 42, 47, 49, 52, 55, 60, 65, 73, 78, 80, 84, 86, 88, 96, 107, 108, 112, 120, 128, 132, 179, 200, 215, 229, 235, 244, 263, 275 74 NB9 45 9, 11, 13, 14, 17, 21, 22, 25, 31, 38, 40, 41, 47, 49, 52, 56, 60, 65, 66, 69, 77, 81, 84, 86, 96, 106, 108, 110, 111, 119, 120, 128, 129, 132, 136, 143, 194, 200, 207, 215, 229, 234, 244, 259, 275 NB10 58 9, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 28, 31, 36, 38, 40, 41, 42, 43, 47, 49, 51, 52, 53, 55, 59, 60, 62, 65, 66, 67, 72, 73, 77, 78, 81, 84, 86, 88, 89, 91, 106, 108, 109, 111, 112, 116, 120, 129, 132, 136, 149, 165, 179, 200, 204, 215, 234, 242, 247, 259, 275 NB11 42 8, 9, 11, 13, 17, 26, 28, 29, 35, 38, 40, 41, 42, 47, 49, 50, 52, 60, 62, 65, 73, 74, 78, 84, 86, 88, 96, 106, 108, 111, 112, 120, 121, 132, 143, 189, 200, 207, 215, 242, 263, 275 NB12 75 14, 16, 17, 20, 21, 22, 26, 28, 30, 31, 36, 38, 40, 41, 43, 47, 49, 51, 52, 54, 56, 68, 59, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 71, 75, 78, 81, 84, 86, 88, 89, 92, 95, 96, 99, 102, 103, 106, 108, 109, 112, 116, 118, 120, 121, 125, 128, 132, 136, 141, 143, 146, 155, 173, 177, 199, 200, 215, 224, 228, 233, 234, 240, 241, 244, 245, 256, 263, 275 NB13 41 1, 10, 11, 13, 17, 22, 25, 28, 31, 35, 40, 41, 42, 47, 49, 52, 57, 60, 62, 65, 69, 70, 73, 74, 78, 84, 86, 88, 107, 108, 112, 120, 128, 132, 179, 200, 215, 234, 242, 247, 275 NB14 43 1, 10, 11, 15, 16, 17, 21, 22, 26, 28, 31, 38, 40, 41, 47, 49, 52, 60, 65, 69, 74, 77, 80, 84, 86, 96, 101, 108, 112, 119, 120, 121, 128, 132, 179, 200, 215, 229, 234, 242, 244, 259, 275 NB15 53 1, 11, 16, 17, 21, 22, 26, 28, 31, 35, 38, 40, 41, 42, 45, 47, 49, 52, 58, 62, 65, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 81, 84, 86, 89, 95, 96, 102, 106, 108, 112, 115, 119, 120, 128, 132, 143, 158, 189, 200, 204, 207, 213, 215, 234, 244, 275 75 NB16 44 1, 10, 11, 14, 16, 17, 21, 22, 31, 35, 38, 40, 41, 42, 47, 49, 52, 60, 65, 66, 72, 73, 74, 77, 78, 80, 84, 86, 88, 96, 107, 108, 112, 120, 132, 136, 149, 179, 185, 200, 215, 234, 242, 275 NB17 40 1, 10, 16, 17, 19, 25, 31, 35, 38, 40, 41, 47, 49, 53, 58, 62, 63, 65, 73, 78, 81, 84, 86, 89, 95, 107, 108, 111, 119, 120, 121, 124, 128, 132, 143, 200, 215, 234, 244, 275 NB18 38 1, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 22, 26, 28, 35, 40, 47, 49, 52, 60, 65, 66, 68, 73, 77, 84, 86, 96, 107, 108, 112, 120, 132, 136, 154, 194, 200, 215, 229, 242, 244, 275 NB19 47 1, 8, 10, 15, 17, 21, 22, 25, 28, 31, 40, 41, 42, 47, 49, 69, 77, 80, 84, 86, 89, 92, 102, 108, 115, 120, 128, 132, 143, 146, 155, 173, 179, 184, 185, 200, 207, 215, 220, 236, 244, 249, 265, 275, 301, 306, 309 NB20 39 1, 10, 16, 17, 26, 28, 40, 41, 49, 52, 59, 65, 73, 77, 84, 86, 95, 102, 108, 111, 117, 127, 130, 132, 141, 143, 149, 156, 171, 191, 215, 221, 237, 246, 259, 263, 275, 289, 303 Kết quả ở Bảng 3.4 cho thấy:  20 mẫu tôm sú NB tạo ra 20 tổ hợp khác nhau về vị trí xuất hiện alen (hay 20 tổ hợp alen).  Tổng số alen của mỗi mẫu dao động trong khoảng 38 - 77: mẫu có số lượng alen nhiều nhất là NB7 (77 alen), ít nhất là NB18 (38 alen).  Trong số 20 mẫu DNA tôm sú NB có 2 mẫu cùng có 58 alen, 2 mẫu cùng có 44 alen, 2 mẫu cùng có 43 alen, 2 mẫu cùng có 40 alen, các mẫu còn lại có số lượng alen khác nhau.  Số vị trí xuất hiện alen của 20 mẫu DNA tôm sú NB là 77 vị trí, (tương 76 ứng với 77 alen), trong đó số số lượng alen duy nhất là 16 (chiếm ≈ 20,78%).  Có 5/18 mẫu có alen duy nhất: NB4, NB6, NB7, NB10, NB12. Trong đó, mẫu có số lượng alen duy nhất nhiều nhất là NTB7 (7 alen: 137, 172, 197, 216, 236, 254, 264). Các alen duy nhất khác là: 198 (NB4); 157 (NB6); 165 (NB10); 224, 228, 233, 241, 245, 256 (NB12).  Có 8 alen trùng nhau giữa các cá thể thuộc cùng quần đàn NB, đó là các alen: 17, 40, 49, 86, 108, 132, 215, 275 (được đánh dấu màu xanh trong Bảng 3.4). 3.1.4.4. Đa hình AFLP giữa các quần đàn tôm sú Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Nam Bộ Bảng 3.5. Kết quả xác định số lượng alen trên các quần đàn tôm sú Quần đàn tôm sú Số lượng alen của mỗi mẫu Số lượng alen trùng nhau trong một quần đàn Vị trí alen trùng nhau Số lượng alen trùng nhau giữa các quần đàn Số lượng alen duy nhất Số lượng alen đặc trưng quần đàn Bắc Trung Bộ 32 - 76 0 0 0 19 37 Nam Trung Bộ 29 - 64 4 30, 39, 51, 104 0 16 29 Nam Bộ 38 - 77 8 17, 40, 49, 86, 108, 132, 215, 275 0 16 24 Kết quả phân tích số lượng alen và vị trí xuất hiện alen ở các mẫu tôm sú nghiên cứu trên đây cho thấy: 77  60 mẫu tôm sú nghiên cứu tạo ra 60 tập hợp vị trí xuất hiện alen khác nhau, tức là không có sự trùng lặp hoàn toàn về vị trí xuất hiện alen giữa các mẫu.  Trong số 309 alen được phát hiện ở 309 vị trí thì chỉ có 5 alen có tần suất xuất hiện cao (có mặt ở hầu hết các mẫu), được gọi là alen phổ biến (được đánh dấu bằng màu sắc trên các Bảng 3.2, Bảng 3.3, Bảng 3.4), cụ thể: - Alen số 41 có ở phần lớn các mẫu trừ mẫu 4 mẫu BTB7, BTB18, NTB11, NB22. - Alen số 47 có ở phần lớn các mẫu trừ mẫu 4 mẫu BTB14, BTB15, NTB2, NTB5. - Alen số 52 có trong phần lớn các mẫu trừ mẫu 6 mẫu BTB5, BTB6, BTB11, BTB14, NTB1, NB17. - Alen số 84 có trong phần lớn các mẫu trừ mẫu 4 mẫu BTB11, NTB3, NTB5, NTB9. - Alen số 200 có trong phần lớn các mẫu trừ mẫu 6 mẫu BTB6, BTB9, BTB10, BTB11, BTB14, NTB2.  Phân tích các vị trí xuất hiện alen duy nhất (alen chỉ xuất hiện một lần, ở một mẫu nhất định mà không xuất hiện ở các mẫu còn lại) cho thấy: Có tất cả 51 alen duy nhất, chiếm khoảng 16,5% trong tổng số các alen được phát hiện, trong đó: quần đàn BTB có 19 alen duy nhất (nhiều nhất), quần đàn NTB và quần đàn NB đều có 16 alen duy nhất.  Ba nhóm tôm sú nghiên cứu thuộc 3 quần đàn tự nhiên BTB, NTB và NB có số lượng alen khác nhau nhưng không chênh lệch nhau nhiều, trong đó hai nhóm tôm sú BTB và NB có số lượng alen xấp xỉ nhau (tương ứng là 76 và 77 alen), nhóm tôm sú NTB ít hơn (64 alen).  So sánh chi tiết vị trí các alen của các mẫu tôm sú giữa 3 quần đàn BTB, NTB và NB cho thấy: có một số alen chỉ xuất hiện ở quần đàn này mà 78 hoàn toàn không xuất hiện ở hai quần đàn còn lại, gọi là alen đặc trưng quần đàn, cụ thể như sau: + Có 37 alen đặc trưng cho quần đàn BTB: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 44, 76, 87, 90, 97, 105, 114, 122, 126, 135, 138, 140, 153, 160, 162, 164, 167, 170, 205, 210, 221, 225, 226, 230, 243, 252, 253, 257, 261, 262, 266; + Có 29 alen đặc trưng cho quần đàn NTB: 104, 142, 161, 168, 174, 180, 183, 186, 188, 190, 192, 195, 196, 203, 206, 209, 212, 214, 217, 219, 220, 222, 223, 227, 231, 239, 250, 260, 265; + Có 24 alen đặc trưng cho quần đàn NB: 14, 99, 109, 137, 154, 157, 165, 172, 179, 194, 197, 198, 213, 216, 224, 228, 233, 236, 241, 244, 245, 254, 256, 264. 3.1.5. Cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Với các dữ liệu AFLP thu được từ các quần đàn tôm sú sau khi phân tích trên máy ABI 3100, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng bằng các công cụ tương thích: phương pháp Neigbor joining và thuật toán Jarrcard được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa các cá thể tôm sú ở 3 quần đàn; Mô hình cây được hiển thị bằng phần mềm MEGA (Hình 3.3). Kết quả xác định cây phát sinh chủng loại giữa các cá thể thuộc ba quần đàn tôm sú này cho thấy mối liên hệ họ hàng giữa các cá thể. Về cơ bản, cây được chia làm 3 nhánh tương ứng với các cá thể từng vùng được xếp vào cùng một nhánh, chẳng hạn như các mẫu NTB 4, 6, 8, 1, 5 ,7, 9, 11 thuộc nhánh quần đàn Nam Trung Bộ; NB 18, 17, 16, 19, 22, 1, 11, 2, 4, 8, 3, 10, 5, 9, 6 thuộc về nhánh Nam Bộ; BTB 5, 6, 9, 11, 2, 3, 14, 10, 17 thuộc nhánh Bắc Trung Bộ. Kết quả này phù hợp với kết quả thu mẫu ban đầu. Tuy nhiên, có một vài cá thể của một trong 3 quần đàn này được xếp về nhánh của quần đàn khác, ví dụ như: BTB7 và BTB16 thuộc cùng nhánh với Nam Trung Bộ, còn các cá thể NTB2 và NTB3 thuộc cùng nhánh với Bắc Trung Bộ. 79 3.2. SẢN XUẤT TÔM SÚ THẾ HỆ Go, G1 3.2.1. Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào Vật liệu gốc là các cá thể tôm bố mẹ thuộc bốn dòng tôm sú có nguồn gốc địa Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại các quần đàn tôm sú tự nhiên thu từ các vùng biển của Việt Nam. (Mô hình cây được hiển thị bằng phần mềm MEGA, Kumar et al., 2001) A- Nhánh Bắc Trung Bộ (BTB), B- Nhánh Nam Trung Bộ (NTB), C- Nhánh Nam Bộ (NB) (Vòng tròn màu đỏ biểu thị các cá thể tôm sú của một trong ba quần đàn này xuất hiện trên nhánh của quần đàn khác) B A C 80 lý khác nhau. Tổng cộng có 460 tôm cái và 376 tôm đực được sử dụng làm vật liệu đầu vào để tiến hành sàng lọc. Bảng 3.6. Kết quả sàng lọc tôm sú bố mẹ đầu vào Dòng tôm Số lượng thu thập Số tôm sạch bệnh % sạch bệnh Khối lượng (g/con) Cái Đực Cái Đực Cái Đực TB ± SD Ấn Độ Dương (A) 76 71 39 34 51,3 47,9 222,2 ± 25,4 Thái Bình Dương (T) 86 58 69 36 80,2 62,1 220,0 ± 23,1 Nội địa (N) 236 186 51 74 21,6 39,8 165,7 ± 19 Gia hóa (G) 62 61 62 61 100 100 160,8 ± 10,4 Tổng 460 376 221 205 48,0 54,5 Ghi chú: TB ± SD: Trung bình ± Sai số chuẩn Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy số tôm được giữ lại sau sàng lọc bệnh nghiêm ngặt tương đối thấp, cụ thể chỉ có 48,0% tôm cái và 54,5% tôm đực được giữ lại. Trong đó, tỷ lệ giữ lại thấp nhất là tôm dòng Nội địa, chỉ đạt 21,6% đối với tôm cái và 39,8% đối với tôm đực. Các dòng tôm tự nhiên nhập ngoại có tỷ lệ sạch bệnh và được giữ lại sau sàng lọc khá hơn như ở tôm cái dòng Ấn Độ Dương là 51,3% và ở tôm cái dòng Thái Bình Dương là 80,2%. Tỷ lệ tôm đầu vào sạch bệnh và được giữ lại cao nhất là tôm Gia hóa: 100% đối với cả tôm đực và tôm cái. Về khối lượng thân trung bình, nhìn chung các dòng tôm có nguồn gốc nhập ngoại có khối lượng lớn hơn so với tôm Việt Nam, cụ thể: Nhóm tôm Nội địa và 81 nhóm tôm Gia hóa có khối lượng trung bình lần lượt là 165,7g và 160,8g, thấp hơn so với nhóm tôm Ấn Độ Dương (222,2g) và nhóm tôm Thái Bình Dương (220,0g). 3.2.2. Thiết lập các gia đình tôm sú thế hệ Go, G1 * Từ 16 phép lai tổ hợp toàn phần 4 dòng tôm sú khác nhau đã tạo ra được các gia đình thế hệ Go. Kết quả có 69 gia đình Go được thả nuôi thành công. Số lượng gia đình Go được ương nuôi thành công đến kích cỡ đánh dấu, thả nuôi chung của từng phép lai được trình bày ở Bảng 3.7. Bảng 3.7. Số lượng gia đình tôm sú thế hệ Go thả nuôi thành công từ 16 phép lai Phép lai Tôm đực Tôm cái Dòng tôm A G N T Tổng cộng A 6 5 5 5 21 G 2 2 2 3 9 N 4 6 6 5 21 T 4 4 4 6 18 Tổng cộng 16 17 17 19 69 Kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy: có sự khác nhau khá rõ về tỷ lệ thả nuôi thành công giữa các gia đình Go khác nhau về nguồn gốc tôm bố và tôm mẹ, đặc biệt là khác nhau về nguồn gốc tôm mẹ. Cụ thể: + Các phép lai giữa tôm mẹ nguồn gốc Nội địa với 4 dòng tôm bố khác nhau đều cho tỷ lệ thả nuôi thành công của các gia đình ở mức cao (tổng cộng là 21 gia đình); + Tôm mẹ nguồn gốc A cũng cho tỷ lệ các gia đình thả nuôi thành công khá cao (21 gia đình); 82 + Tôm mẹ nguồn gốc T cho tỷ lệ các gia đình thả nuôi thành công thấp hơn (18 gia đình); + Trong khi đó, các phép lai có tôm mẹ nguồn gốc G cho tỷ lệ các gia đình thả nuôi thành công thấp nhất (tổng cộng chỉ có 9 gia đình). Kết quả trên đây cho thấy: tôm mẹ thuộc các dòng khác nhau sau khi được cấy tinh nhân tạo và thả nuôi để chuẩn bị cho sinh sản tạo thế hệ Go đã có sự khác nhau rõ rệt về khả năng sống. Xét về ảnh hưởng của nguồn gốc tôm bố đối với tỷ lệ thả nuôi thành công của các gia đình thế hệ Go thì không thấy sự khác biệt lớn: Số lượng các gia đình khác nhau về nguồn gốc tôm bố (A, G, N, T) lần lượt là 16, 17, 17 và 19 gia đình. * Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng của 4 dòng tôm sú ở thế hệ Go và số lượng cá thể tôm đực và tôm cái (tôm bố mẹ) của từng dòng tham gia sinh sản để tạo thế hệ Go được trình bày ở Bảng 3.8. Tổng số có 108 cá thể tôm bố mẹ (bao gồm 55 tôm cái và 53 tôm đực) được chọn từ 4 dòng tôm (vật liệu ban đầu) để tạo thế hệ Go. Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy: - Trong 69 gia đình được nuôi thành công, có sự cân bằng tương đối về tỷ lệ tôm bố mẹ tham gia tạo vật liệu cho thế hệ Go, cụ thể: + Dòng tôm sú A chiếm tỷ lệ 26,9% với tổng số 29/108 cá thể, trong đó có 19 cá thể tôm đực và 10 cá thể tôm cái; + Dòng tôm sú G chiếm tỷ lệ 20,4% với tổng số 22/108 cá thể, trong đó có 6 cá thể tôm đực và 16 cá thể tôm cái; + Dòng tôm sú N chiếm tỷ lệ 28,7% với tổng số 31/108 cá thể, trong đó có 17 cá thể tôm đực và 14 cá thể tôm cái; + Dòng tôm sú T chiếm tỷ lệ 24,1% với tổng số 26/108 cá thể, trong đó có 13 cá thể tôm đực và 13 cá thể tôm cái; Như vậy, tỷ lệ góp vật liệu di truyền của dòng tôm Nội địa (N) là cao nhất (28,7%) và thấp nhất là nhóm tôm Gia hóa (20,4%). 83 Bảng 3.8. Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng ở thế hệ Go Dòng tôm A G N T Giới tính Cái Đực Cái Đực Cái Đực Cái Đực Số lượng (con) 19 10 6 16 17 14 13 13 Tỷ lệ (%)* (34,5) (18,9) (10,9) (30,2) (30,9) (26,4) (23,7) (24,5) Tổng 29 (26,9%) 22 (20,4%) 31 (28,7%) 26 (24,1%) (Ghi chú *: Các con số tỷ lệ % trong ngoặc được tính theo tôm cái riêng và tôm đực riêng, tổng là 100% đối với mỗi nhóm tôm đực - cái). - Xét trong cùng một dòng: có sự chênh lệch lớn về tỷ lệ góp vật liệu di truyền giữa tôm cái (tôm mẹ) và tôm đực (tôm bố) trong cùng một dòng tôm ở nhóm tôm Ấn Độ Dương (19 tôm cái, 10 tôm đực) và nhóm tôm Gia hóa (6 tôm cái, 16 tôm đực); Ở hai nhóm còn lại là Nội địa và Thái Bình Dương, tỷ lệ tôm đực và tôm cái tham gia sinh sản tạo thế hệ Go là tương đương nhau (lần lượt là 17 tôm cái và 14 tôm đực ở dòng N; 13 tôm cái và 13 tôm đực ở dòng T). Sự chênh lệch cũng thể hiện rõ ở tỷ lệ đóng góp tôm mẹ (nhóm Ấn Độ Dương là 34,5% so với nhóm Gia hóa là 10,9%) và tôm bố (nhóm Ấn Độ Dương là 18,9% so với nhóm Gia hóa là 30,2%) giữa bốn nhóm vật liệu ban đầu. * Tôm bố mẹ Go được ghép cặp để sản xuất các gia đình G1 cùng cha mẹ (full-sibs family) và các cặp gia đình cùng cha khác mẹ (half-sibs group). Tổng cộng có 246 cá thể tôm thế hệ Go (bao gồm 112 tôm cái và 134 tôm đực) thuộc 69 gia đình Go được sử dụng làm tôm bố mẹ để sản xuất thế hệ G1. Kết quả đã tạo được 76 gia đình thế hệ G1. Số lượng các nhóm gia đình và số lượng cá thể tương ứng được trình bày ở Bảng 3.9. 84 Kết quả ở Bảng 3.9 cho thấy: Trong tổng số 76 gia đình của thế hệ G1 có 15 nhóm gia đình cùng cha khác mẹ (bao gồm 50 gia đình, chiếm tỷ lệ 65,8%) và 26 gia đình cùng cha mẹ (không có nhóm cùng cha khác mẹ tương ứng), chiếm tỷ lệ 34,2%. Tổng số cá thể tôm sú thế hệ G1 thu được là 7.412, trong đó có 5.155 cá thể (chiếm tỷ lệ 69,5%) thuộc nhóm gia đình cùng cha khác mẹ và 2.257 cá thể (chiếm tỷ lệ 30,5%) thuộc nhóm gia đình cùng cha mẹ. Bảng 3.9. Số lượng các nhóm gia đình tôm sú thế hệ G1 Kiểu gia đình Tôm bố Tôm mẹ Số lượng tôm con Tôm bố x tôm mẹ Số lượng nhóm gia đình cùng cha khác mẹ Số lượng gia đình cùng cha mẹ Tổng Cùng cha khác mẹ 15 50 5.155 1 x 2 6 12 50 1 x 3 3 9 1 x 4 3 12 1 x 5 2 10 1 x 7 1 7 Cùng cha mẹ 26 26 2.257 26 Tổng 7.412 76 Tôm sú thế hệ Go, G1 ở các giai đoạn khác nhau (từ ấu trùng đến giai đoạn thành thục) được ương nuôi trong điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt về các thông số môi trường sống. Tất cả mẫu của các gia đình lai đều được sàng lọc mầm bệnh và đều cho kết quả âm tính với mầm bệnh virus. Các quần đàn tôm lai thế hệ Go và thế hệ G1 sẽ là nguồn vật liệu được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử (SNP) liên kết với tính trạng tăng trưởng. 85 3.3. SÀNG LỌC CÁC ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN (SNP) LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG Ở TÔM SÚ 3.3.1. Giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời * Các thư viện DNA được tạo ra từ hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm được đánh giá bằng điện di tự động trước khi tiến hành giải trình tự, sử dụng các chỉ thị ngưỡng dưới và ngưỡng trên có kích thước lần lượt là 35bp và 10038bp (đây là các thông số kích thước mặc định phù hợp với thiết bị điện di tự động 2100 Bioanalyzer của Agilent Technology). Kết quả đánh giá thư viện được thể hiện ở Hình 3.4. Hình 3.4. Kết quả điện di tự động bằng máy 2100 Bioanalyzer (Agilent Technology) đánh giá thư viện DNA - Vùng biểu thị cho thư viện DNA cần đánh giá nằm giữa chỉ thị ngưỡng dưới (kích thước 35 bp) và chỉ thị ngưỡng trên (kích thước 10038 bp). - Mồi kết đôi (primer dimer) có tín hiệu huỳnh quang thấp (không đáng kể). C ư ờ n g đ ộ h u ỳ n h q u a n g 10038 bp Size Standard Primer Dimer 35 bp Size Standard Thời gian 198 bp 86 Hình 3.4 cho thấy: Chỉ thị ngưỡng dưới được thể hiện bằng đỉnh 35 bp Size Standard, chỉ thị ngưỡng trên được thể hiện bằng đỉnh 10038 bp Size Standard. Vùng biểu thị cho thư viện DNA cần đánh giá nằm giữa hai ngưỡng này với cường độ huỳnh quang cao. Mồi kết đôi (primer dimer) độ dài 78 bp có cường độ huỳnh quang thấp (gần ngang đường nền) nên có thể xem như không xuất hiện mồi kết đôi hoặc xuất hiện với nồng độ rất thấp. Kích thước trung bình của thư viện là 208 bp. Như vậy, về cơ bản thư viện DNA phù hợp cho việc giải trình tự bằng NGS Illumina NexSeq500. * Kết quả giải trình tự hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tôm tăng trưởng nhanh và tôm tăng trưởng chậm trên hệ thống Illumina NextSeq® 500 (với độ sâu giải trình tự 50x) đã thu được 145.836.644 đoạn trình tự thô (raw reads); trong số đó có 120.438.739 (chiếm tỷ lệ 83%) đoạn trình tự mang barcode và điểm cắt của ApeKI. Sau khi tinh sạch loại bỏ các đoạn adaptor và các đoạn trình tự chất lượng thấp, thu được 102.505.713 (70,2%) đoạn trình tự có chất lượng tốt để sử dụng cho việc kết nối contig và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm thời, với dung lượng dữ liệu khoảng 100 GB. Từ 102.505.713 đoạn trình tự, sau khi kết nối (với độ sâu bao phủ, read depth, ≥ 10) đã thu được 510.076 contig với sự phân bố kích thước các contig được thể hiện ở Hình 3.5. Các contig có chiều dài 70 - 150 bp chiếm số lượng nhiều nhất (211.389), tiếp đến là các contig có chiều dài 150 - 300 bp và ít nhất là các contig có chiều dài 450 - 547 bp. Các contig kích thước ngắn dưới 70 bp bị loại bỏ. Do chưa có hệ gen tham chiếu đối với loài tôm sú Penaeus monodon nên trong nghiên cứu này, từ dữ liệu giải trình tự các đoạn DNA có chất lượng tốt nhất, hệ gen tham chiếu tạm thời của tôm sú đã được thiết lập de novo, với kích thước 76.299.742 bp (Bảng 3.10). Hệ gen tham chiếu tạm thời này được sử dụng để sàng lọc các SNP và xác định chỉ thị SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú. 87 Bảng 3.10. Tóm tắt kết quả xử lý dữ liệu giải trình tự GBS Chỉ số phân tích Giá trị Độ sâu giải trình tự 50x Dung lượng dữ liệu (Gb) ~ 100 Số lượng đoạn trình tự thô (raw reads) 145.836.644 Số lượng đoạn trình tự (read) sử dụng kết nối contig 102.505.713 Tổng số contig 510.076 Kích thước hệ gen tham chiếu tạm thời (bp) 76.229.742 Hình 3.5. Phân bố độ dài các contig sau tinh sạch Các contig có kích thước 70 - 150 bp chiếm số lượng nhiều nhất (211.389), ít nhất là các contig có kích thước >450 bp, loại bỏ các contig kích thước ngắn < 70bp. S ố l ư ợ n g c o n ti g Phân bố độ dài contig 88 Theo tác giả You et al., 2010, kích thước hệ gen tôm sú có dung lượng khoảng 2.17×109 bp. Như vậy với hệ gen tham chiếu tạm thời được thiết lập de novo có kích thước 76.299.742 bp trong nghiên cứu này thì tỷ lệ bao phủ giải trình tự đạt được khoảng 3,5%. 3.3.2. Sàng lọc SNP Tổng cộng có 2887 SNP đã được phát hiện, trong đó có 1799 SNP chỉ xuất hiện ở nhóm tôm tăng trưởng nhanh, 587 SNP chỉ xuất hiện ở nhóm tôm tăng trưởng chậm và 501 SNP xuất hiện ở cả hai nhóm (Hình 3.6). 3.3.3. Chú giải gen chức năng từ dữ liệu giải trình tự tôm sú Từ dữ liệu giải trình tự và dữ liệu sàng lọc SNP, chỉ những đoạn trình tự contig chứa SNP được sử dụng để chú giải nhằm tìm kiếm sự tương đồng với các trình tự gen chức năng được lưu trữ ở GenBank (NCBI). Toàn bộ 2887 đoạn trình tự chứa SNP ở cả hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm được chú giải chức năng bằng công cụ BlastX (nr-NCBI). Kết quả có 510 (chiếm tỷ lệ Hình 3.6. Số lượng SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và nhóm tôm sú tăng trưởng chậm A- Số lượng SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh (1799) B- Số lượng SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng chậm (587) C- Số lượng SNP ở cả hai nhóm (501). B C A 89 17,67%) contig chứa SNP có trình tự nucleotide tương đồng với các trình tự trên cơ sở dữ liệu nr-NCBI (với tham số E-value < 1e-6); trong đó có 287 (56,27 %) trình tự contig chứa SNP thuộc nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh, 126 (24,71 %) trình tự contig chứa SNP thuộc nhóm tôm sú tăng trưởng chậm và 97 (19,02 %) trình tự contig chứa SNP thuộc cả hai nhóm. Một lượng lớn (82,33%) contig của nghiên cứu này không cho kết quả chú giải gen chức năng (Hình 3.7). Từ kết quả BlastX, chúng tôi thu được danh sách chú giải gồm các protein đã biết chức năng hoặc các protein dự đoán cùng với tên loài tương ứng. Với mục tiêu nghiên cứu là tìm kiếm và xác định sự liên quan giữa các gen mã hóa các protein có liên quan đến tăng trưởng ở tôm sú với các SNP đã sàng lọc được, chúng tôi đã so sánh đối chiếu lần lượt 22 protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng trong họ giáp xác (Jung et al., 2013) với các protein đã chú giải được để rà soát và tìm ra Hình 3.7. Kết quả chú giải gen chức năng Có 2377 contig chứa SNP không cho kết quả chú giải, 510 contig chứa SNP cho kết quả chú giải, trong đó: 287 contig chứa SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh, 126 contig chứa SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng chậm và 97 contig chứa SNP ở cả hai nhóm. Có kết quả chú giải Không có kết quả chú giải 90 loại protein tương ứng với trình tự contig chứa SNP của hai nhóm tôm sú nghiên cứu. Kết quả đã xác định được hai contig (contig83953 dài 98 bp và contig260347 dài 80 bp) ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh có trình tự amino acid tương ứng tương đồng với trình tự amino acid của protein Myosin Heavy Chain (MHC). Trong đó, contig83953 tương đồng với MHC type a (MHCa) và contig260347 tương đồng với MHC type 1 (MHC1). Trong nghiên này, chúng tôi không tìm thấy contig nào của nhóm tôm sú tăng trưởng chậm có sự tương đồng với 22 protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng trong họ giáp xác đã được công bố bởi nhóm tác giả Jung et al. (2013). Trình tự nucleotide của contig83953 và contig260347 được trình bày ở Bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả chú giải các gen liên quan tính trạng tăng trưởng ở tôm sú Contig được chú giải Gen bank ID Protein tương ứng Loài tương ứng Trình tự nucleotide (đối với contig83953 là trình tự bổ sung) Contig83953 (98 bp) gi|34318315 3|dbj|BAK61 429.1| Myosin heavy chain type a Marsupenaeus japonicus CAAGGTCGTCGAT CTTCAGCTTCCAT TCAGAGATGATCT TATCGAAGTTCTT CTGTTTCTTCTCA GCGGAGTTGGCCA GAGTCTGTGCACG TTCAGCA Cluster260347 (80 bp) gi|41050930 6|dbj|BAM65 719.1| Myosin heavy chain type 1 Penaeus monodon CTCGTCTCGAGGA AGCCGAAATGCA GATTGAGTCTCTC AATGTTAAGAACT TGCATTTGGAGAA GACCAAGATGCGT GCG 91 3.3.4. Xác định chỉ thị SNP và tương quan giữa các contig chứa SNP với gen MHC Từ các kết quả sàng lọc SNP và kết quả chú giải protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (chỉ các contig chứa SNP được chọn để chú giải gen chức năng, sau đó so sánh trình tự của contig chứa SNP với trình tự của gen chức năng tương ứng để xác định loại nucleotide thay thế), chúng tôi đã xác định được vị trí SNP trên contig83953 và contig260347 ở tôm sú tăng trưởng nhanh như sau: SNP T C (Bảng 3.11) tại vị trí nucleotide thứ 20 trên mạch bổ sung với contig83953, tức là SNP A G trên mạch gốc contig83953 và SNP G A (Bảng 3.11) tại vị trí nucleotide thứ 19 trên contig260347. Ký pháp HGVS (Human Genome Variation Society) của hai SNP trên đây được thể hiện ở Bảng 3.12. Bảng 3.12. Kết quả xác định SNP trên contig83953 và contig260347 Tên Contig Ký pháp HGVS của SNP tương ứng Nucleotide thay thế Nucleotide tham chiếu Ghi chú Contig83953 Contig83953:g.20T>C C T Trình tự bổ sung G A Trình tự mạch gốc Contig260347 Contig260347:g.19G>A A G Mạch gốc Để xác đị

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_da_hinh_he_gen_cac_dong_tom_su_penaeus_mo.pdf
Tài liệu liên quan