Luận án Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê

để cắt kiểm tra với enzyme hạn chế. Kết quả là khi cắt bằng các enzyme hạn chế đơn lẻ (NcoI, XhoI), plasmid đã được cắt mở vòng và khi cắt bằng cặp enzyme hạn chế (NcoI+XhoI) thì gen Egc đã được cắt ra có kích thước khoảng 0,8 kb đúng như lý thuyết (Hình 3.13B). Như vậy, vector pETSUMO-Egc đã được thiết kế thành công. Hình 3.13. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-Egc (A) và sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-Egc bằng các enzyme hạn chế (B). Đường chạy (-): Đối chứng âm pETSUMO; đường chạy 1-16: Các dòng pETSUMO-Egc; M: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas) 3.3.3.3. Chọn dòng vector pETSUMO-Fn3Egc Tương tự, để chọn dòng vector pETSUMO-Fn3Egc, chúng tôi đã tách dòng của 16 khuẩn lạc ngẫu nhiên và tách kiểm tra một khuẩn lạc mang vector pETSUMO làm đối chứng âm. Kết quả điện di 16 dòng đều có kích thước lớn hơn kích thước của dòng dòng đối chứng âm, chứng tỏ các dòng này chứa plasmid có mang thêm gen ngoại lai (Hình 3.14A). Tuy nhiên, trên bản điện di quan sát thấy plasmid được tách ở một số dòng không có kích thước tương đương nhau so với các dòng khác. Điều này có thể thấy điển hình như trên dòng số 8 và dòng 14, các plasmid được tách không đồng nhất giữa các mẫu nên chúng tồn tại ở các dạng cấu trúc khác nhau và có tốc độ di chuyển khác nhau trên gel agarose, hoặc trong một tế bào có thể có chứa vài loại plasmid có kích thước khác nhau. Từ các dòng này, 77 chúng tôi chọn ngẫu nhiên dòng số 1 có hình ảnh plasmid gọn nhất để cắt kiểm tra với enzyme hạn chế. Kết quả là khi cắt bằng các enzyme hạn chế đơn lẻ (NcoI, XhoI), plasmid đã được cắt mở vòng và khi cắt bằng cả hai enzyme hạn chế (NcoI+XhoI) thì gen Fn3Egc đã được cắt ra có kích thước khoảng 1,1 kb đúng với kích thước của gen Fn3Egc (Hình 3.14B). Như vậy, vector pETSUMO-Fn3Egc đã được thiết kế thành công. Hình 3.14. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-Fn3Egc (A) và sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-Fn3Egc bằng các enzyme hạn chế (B). Đường chạy (-): Đối chứng âm pETSUMO; đường chạy 1-16: Các dòng pETSUMO-Fn3Egc; M: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas) 3.3.3.4. Chọn dòng vector pETSUMO-XFn3Egc Để chọn dòng vector pETSUMO-XFn3Egc, chúng tôi đã lựa chọn và tách dòng của 16 khuẩn lạc và một khuẩn lạc mang vector pETSUMO làm đối chứng. Kết quả điện di plasmid cho thấy tất cả 16 dòng đều có kích thước cao hơn đối chứng, chứng tỏ các dòng này chứa plasmid có mang thêm gen ngoại lai (Hình 3.15A). Tuy nhiên, trên bản điện di cũng quan sát thấy plasmid được tách ở một số dòng không có kích thước giống nhau (dòng số 5) so với các dòng khác tương tự như trường hợp trên. Từ các dòng này, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một dòng để cắt kiểm tra với enzyme hạn chế. Kết quả là khi cắt bằng các enzyme hạn chế đơn lẻ (NcoI, XhoI), plasmid đã được cắt mở vòng và khi cắt bằng cả hai enzyme hạn chế (NcoI+XhoI) thì gen XFn3Egc đã được cắt ra có kích thước khoảng khoảng 1,6 kb tương ứng với kích thước XFn3Egc (Hình 3.15B). Như vậy, vector pETSUMO- XFn3Egc đã được thiết kế thành công. 78 Hình 3.15. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-XFn3Egc (A) và sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pETSUMO-XFn3Egc bằng các enzyme hạn chế (B). Đường chạy (-): Đối chứng âm pETSUMO; đường chạy 1-16: Các dòng pETSUMO-XFn3Egc; M: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas) 3.3.3.5. Chọn dòng vector pETSUMO-XFn3 Để chọn dòng vector pETSUMO-XFn3, chúng tôi đã tách dòng 4 khuẩn lạc và một khuẩn lạc mang vector pETSUMO làm đối chứng. Kết quả điện di plasmid cả 4 dòng đều thu được băng có kích thước lớn hơn kích thước của dòng đối chứng âm (Hình 3.16A). Chứng tỏ các dòng này chứa plasmid có mang thêm gen ngoại lai. Từ các dòng này, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một dòng để cắt kiểm tra với enzyme hạn chế. Kết quả là khi cắt bằng các enzyme hạn chế đơn lẻ (NdeI, XhoI), plasmid đã được cắt mở vòng và khi cắt bằng hai enzyme (NdeI+ XhoI) thì gen XFn3 đã được cắt ra có kích thước khoảng 1 kb (bao gồm 0,67 kb của gen XFn3 và 0,3 kb của gen sumo3) (Hình 3.16B). Như vậy, vector pETSUMO-XFn3 đã được thiết kế thành công. Hình 3.16. Điện di đồ kiểm tra các dòng plasmid pETSUMO-XFn3 (A) và sản phẩm cắt plasmid pETSUMO-XFn3 bằng các enzyme hạn chế (B). Đường chạy (-): Đối chứng âm pETSUMO; đường chạy 1-4: Các dòng pETSUMO- XFn3; M: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas). 79 3.4. Biểu hiện các gen trong tế bào E. coli 3.4.1. Khảo sát điều kiện biểu hiện gen SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3, SXFn3 Sau khi gắn với SUMO, các protein tái tổ hợp sẽ được biểu hiện dưới dạng dung hợp với SUMO nên kích thước cũng như tính chất về điểm đẳng điện và khối lượng phân tử của protein tái tổ hợp có sự thay đổi (Bảng 3.4). Thực tế trong quá trình biểu hiện gen, chúng tôi đã sử dụng cả vector không gắn SUMO, tuy nhiên các gen đều biểu hiện kém và protein biểu hiện hầu hết nằm ở pha tủa. Trong nghiên cứu này, vector pETSUMO (Champion™ pETSUMO Expression System) được sử dụng là vector biểu hiện gen. Vector này có mang đoạn gen SUMO làm tăng khả năng biểu hiện của gen đích và tăng tính tan cho protein ngoại lai được biểu hiện, đặc biệt là khi biểu hiện trong chủng tế bào E. coli. Ngoài ra, protein tái tổ hợp có đoạn 6-His-Tag được thiết kế trong vector pETSUMO làm cho quá trình tinh sạch và nghiên cứu protein sau này trở lên thuận lợi hơn. Bảng 3.4. Tổng hợp đặc điểm của các gen tách dòng và ước đoán đặc điểm của protein do các gen mã hóa Tên gen DNA thu đƣợc Chƣa dung hợp SUMO Sau khi dung hợp SUMO Kích thƣớc (bp) pI MW (kDa) Tên protein Số aa pI Mw (Da) Fn3 Fibronectin 3 276 9,79 9,8 SFn3 201 8,90 22851,5 Egc Cellulase 798 8,52 29,7 SEgc 378 7,29 42653,8 Fn3Egc Fibronectin 3- Cellulase 1134 9,26 41,5 SFn3Egc 487 8,95 54456,2 XFn3Egc X-Fn3-Egc 1545 9,64 59,0 SXFn3Egc 627 9,37 69478,2 XFn3 X-Fn3 612 10,1 22,0 SXFn3 316 9,62 35073,5 Để chọn được dòng biểu hiện các gen, 5 dòng thể biến nạp mang các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được biến nạp thành công vào chủng E. coli BL21 Rosetta (R) và E. coli BL21 (DE3) để kiểm tra khả năng biểu hiện và so sánh sự biểu hiện ở 2 chủng này. Các khuẩn lạc ngẫu nhiên được chọn và nuôi cấy trong môi trường LB có ampicillin (Amp) ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 thì bổ sung chất cảm ứng isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) nồng độ cuối cùng là 0,5 mM và nuôi tiếp trong thời gian 5 giờ ở nhiệt độ 25oC. Nhiều nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ biểu hiện thấp hơn 37oC, sự hình thành protein ngoại lại dạng tan trong vật chủ E. coli có thể được cải thiện. Nguyên nhân do nhiệt độ thấp làm cho 80 tốc độ sinh trưởng của tế bào chậm nên tăng thời gian cho các protein được hình thành cuộn gấp đúng cấu trúc của chúng [236]. Do đó, các thí nghiệm biểu hiện protein tái tổ hợp trong chủng E. coli hầu hết đều đạt được kết quả tốt khi biểu hiện ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh trưởng [237]. Các gen mã hóa cho 5 loại protein khác nhau được biểu hiện trong 2 chủng E. coli BL21 Rosetta (R) và E. coli BL21 (DE3). Kết quả cho thấy, trên đường chạy kiểm tra protein của cả 2 chủng đều xuất hiện một băng đậm có kích thước tương đương với kích thước tính toán của mỗi loại protein tương ứng được biểu hiện trong khi mẫu đối chứng không xuất hiện băng này. Như vậy, toàn bộ 5 protein đều được biểu hiện thành công trong cả 2 chủng chủng E. coli BL21 Rosetta (R) và E. coli BL21 (DE3). Các chủng tái tổ hợp biểu hiện protein ngoại lai có kích thước gắn với SUMO theo tính toán là SFn3 ~23 kDa, SEgc ~43 kDa, SFn3Egc ~54 kDa, SXFn3Egc ~69 kDa và SXFn3 ~35 kDa. Tuy nhiên, kết quả trên bản gel cho thấy kích thước của tất cả protein được biểu hiện đều cao hơn so với tính toán khoảng 6- 8 kDa. Nguyên nhân có sự chênh lệch kích thước này là do các protein tái tổ hợp được biểu hiện có điểm đẳng điện quá cao (Bảng 3.4). Chính điều này đã tạo sự chênh lệch về điểm đẳng điện, pH với đệm điện di (pH 8,3), gel cô (pH 6,8) và gel tách (pH 8,8) làm ảnh hưởng đến sự di chuyển của protein trong quá trình chạy điện di trên gel. Trong trường hợp này (hoặc cả trường hợp protein có điểm đẳng điện quá thấp), protein thường có tốc độ di chuyển chậm hơn trong quá trình điện di và thể hiện kích thước lớn hơn trên bản gel [238], [239]. Quan sát sự biểu hiện protein tổng số của 5 gen tương ứng trong 2 chủng E. coli BL21 (DE3) và E. coli Rosetta đều không có sự khác nhau nhiều. Tuy nhiên hàm lượng tế bào lúc thu mẫu của chủng BL21 (DE3) là lớn hơn. Do vậy, chủng này có khả năng sinh trưởng tốt hơn so với chủng BL21 (R). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn chủng BL21 (DE3) làm chủng biểu hiện các gen. Như vậy, gen XFn3Egc và các gen chứa các module khác nhau (Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3) đã được tách dòng và biểu hiện thành công trong chủng E. coli BL21. Để tiếp tục nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho biểu hiện vùng trung tâm hoạt động và vùng chưa biết chức năng, chúng tôi cũng đã tiến hành lựa chọn môi trường biểu hiện. Trong các môi trường LB, TB cải biến, PE, protein tổng số được biểu hiện có kích thước tương ứng với kích thước được tính toán. Lượng 81 protein tổng số được biểu hiện và protein ở pha tan trong môi trường LB có băng lớn hơn nhưng không đáng kể so với môi trường TB và PE (kết quả không trình bày). Vì vậy, chúng tôi đã chọn môi trường LB cho biểu hiện các gen. Hình 3.17. Điện di đồ kiểm tra protein tổng số của các dòng E. coli tái tổ hợp mang các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được biểu hiện trong E. coli BL21. Đường chạy B: Các dòng E. coli BL21 (DE3) mang các gen được cảm ứng IPTG; đường chạy R: Các dòng E. coli BL21 Rosetta mang các gen được cảm ứng IPTG; đường chạy (-): Các dòng tế bào tương ứng nuôi cấy không được cảm ứng; M: Thang protein chuẩn unstained (Thermo Scientific) 3.4.2. Kiểm tra protein tái tổ hợp được biểu hiện ở pha tan Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho biểu hiện, chúng tôi tiến hành biểu hiện các chủng E. coli BL21 (DE3) mang các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc trong môi trường LB có bổ sung Amp, nhiệt độ biểu hiện 25oC, nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTG, thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. Kết quả kiểm tra bằng điện di đối với các protein được biểu hiện cho thấy, ở pha tổng số cả 5 loại protein 82 đều được biểu hiện tốt (Hình 3.18). Các gen đều biểu hiện tốt ở pha tan trừ gen Egc (không chứa module FN3) có phần lớn protein biểu hiện ở pha tủa. Kết quả thể hiện trên bản điện di, gần như 100% SEgc biểu hiện ở pha không tan. Trong số các protein biểu hiện ở pha tan, tỷ lệ protein tan của SFn3 và SXFn3 chiếm phần lớn so với lượng protein không tan chỉ nhìn thấy các băng mờ trên bản điện di. Đối với SFn3Egc và SXFn3Egc, lượng protein biểu hiện ở pha tan cũng chiếm tới trên 50%. Điều này chứng tỏ, module FN3 trong cấu trúc của protein SFn3Egc và SXFn3Egc đã giúp cho protein được biểu hiện phần lớn ở pha tan thông qua khả năng làm ổn định cấu trúc của vùng hoạt tính (Egc), cũng như toàn bộ phân tử protein được biểu hiện. Việc module FN3 làm tăng tính tan của vùng hoạt tính là một phát hiện mới về vai trò của module này mà chưa được nghiên cứu trước đây. Hình 3.18. Điện di đồ kiểm tra protein tổng số, pha tan, pha không tan của các dòng E. coli tái tổ hợp mang gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được biểu hiện trong chủng E. coli BL21 (DE3) trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. pETSUMO: Đối chứng âm; Marker: Thang protein chuẩn unstained (Thermo scientific) 3.4.3. Kiểm tra hoạt tính endoglucanase Các protein chứa module FN3 được biểu hiện ở pha tan (SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3) sẽ được kiểm tra hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch aga- CMC. Dịch protein pha tan của mỗi loại được đưa vào giếng tương ứng đã được tạo trên đĩa thạch aga-CMC. Đĩa thạch sau khi được ủ qua đêm ở nhiệt độ 37oC được nhuộm với dung dịch Congo red 0,1% (w/v). Kết quả thử hoạt tính cellulase trên đĩa 83 thạch aga-CMC cho thấy chỉ có dịch pha tan của protein SXFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất CMC rõ nhất. Vòng hoạt tính thủy phân cellulose xuất hiện rõ ràng tương tự như với vòng hoạt tính của đối chứng dương (cellulase). Các protein khác như SFn3Egc, SFn3 và SXFn3 không thể hiện được hoạt tính cellulase do không quan sát thấy vùng thủy phân trên đĩa thạch sau khi được nhuộm bằng dung dịch Congo red (Hình 3.19A). Để đánh giá chính xác hoạt tính cellulase là do protein tái tổ hợp tạo ra, chúng tôi tiến hành theo phương pháp thử hoạt tính Zymogram (Hình 3.19B, C). Các protein tái tổ hợp không xử lý nhiệt, không sử dụng đệm chạy mẫu chứa các chất gây biến tính (2-mercaptoethanol, bromophenol) được điện di trên gel không biến tính (không SDS) để giữ nguyên được cấu trúc sinh học của protein. Hai bản gel được điện di song song (duplicate), sau đó một bản được nhuộm comassie và một bản ủ, nhuộm congo red. Kết quả cho thấy ở bản gel nhuộm comassie, cả 4 loại protein (SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3) mặc dù không được xử lý biến tính và chạy điện di trên gel không biến tính nhưng protein đều được di chuyển đúng vị trí như trong các trường hợp điện di biến tính khác. Đối với bản gel nhuộm congo red có xuất hiện 1 băng sáng tương tự như băng sáng của đối chứng dương (cellulase), trùng với vị trí của SXFn3Egc ở bản gel nhuộm comassie mà tại vị trí của các protein khác không có. Do đó, chỉ SXFn3Egc thể hiện được hoạt tính cellulase trên cơ chất CMC. Bên cạnh đó, đối với đường chạy SXFn3Egc, ngoài vùng thủy phân trùng với vị trí của enzyme trên bản gel còn quan sát thấy một vùng sáng nhưng mờ hơn ở đầu đường chạy. Điều này có thể do enzyme bị polymer hóa có kích thước lớn nên di chuyển chậm hơn nhưng vẫn thể hiện được hoạt tính thủy phân cơ chất. Kết quả này cho thấy, SXFn3Egc mang đầy đủ module FN3, X, vùng hoạt tính (Egc) có hoạt tính cellulase rõ ràng qua thử nghiệm phân hủy cơ chất tan là CMC trên đĩa thạch và trên gel điện di. Trong đó, module FN3 cũng đã được chứng minh có khả năng làm tăng hoạt tính của enzyme trên cơ chất giấy lọc và CMC, tuy nhiên cơ chế hoạt động của module này chưa được làm rõ [92], [98]. Các protein khác không bao gồm đủ các vùng cấu trúc trên, kể cả cấu trúc chứa vùng hoạt tính (SFn3Egc) đều chưa thể hiện được hoạt tính phân hủy cơ chất CMC. Như vậy, khi so sánh giữa 2 cấu trúc có mang vùng X và không mang vùng X (SXFn3Egc thể hiện hoạt tính mạnh, SFn3Egc chưa thể hiện được hoạt tính) cho thấy vùng X, FN3 có thể giúp ổn định cấu trúc và làm tăng hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, đối với 84 các protein chưa thể hiện được hoạt tính cần tiếp tục được nghiên cứu, xác định hoạt tính theo các phương pháp khác, đặc biệt là xác định hoạt tính của các enzyme sau khi đã được tinh sạch. Như vậy, nghiên cứu này cho thấy các vùng trong cấu trúc của gen đã có tác dụng khác nhau trong việc phối hợp thể hiện hoạt tính của cellulase được biểu hiện. Cấu trúc gen XFn3Egc biểu hiện được enzyme đúng kích thước và thể hiện hoạt tính rõ ràng với cơ chất CMC. Module FN3 được xác định có tác dụng làm tăng tính tan vùng xúc tác. Vùng X cũng có vai trò nhất định trong việc hỗ trợ hình thành cấu trúc, giúp enzyme thể hiện hoạt tính cellulase mạnh hơn. (A) (B) (C) Hình 3.19. Hoạt tính của các protein được biểu hiện ở pha tan (A) và phân tích protein pha tan bằng điện di không biến tính (B), và Zymogram (C) Marker: Thang protein chuẩn unstained (Thermo scientific); cellulase: Đối chứng dương (Sigma) 85 3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp tái tổ hợp và xác định hoạt tính 3.5.1. Tinh chế protein tái tổ hợp Để tinh chế protein tái tổ hợp cho nghiên cứu tính chất và hoạt tính, chúng tôi đã thử tinh chế bằng đệm phosphat và đệm tris với các nồng độ imidazole thay đổi từ 50-100 mM imidazole, dịch rửa từ 100-300 mM imidazole và đệm thu là 400-500 mM imidazole. Cuối cùng, để tinh chế được protein có độ sạch cao chúng tôi đã lựa chọn được đệm bám cột (Binding), đệm rửa, đệm thu mẫu với nồng độ imidazole tương ứng lần lượt là 50 mM, 150 mM và 400 mM. Trong thiết kế vector biểu hiện, để thuận lợi cho việc tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-tag, các gen được ghép nối vào vector ở tại vị trí có thêm trình tự mã hóa 6 axit amin His ở đầu 3’ của gen nên protein sẽ dễ dàng được giữ lại trên giá thể có gắn các ion Ni 2+ . Các protein khác không có hoặc có các His nằm riêng rẽ, rải rác sẽ có ái lực kém với Ni2+ nên chúng thường không bám hoặc bám yếu và trôi qua giá thể. 3.5.1.1. Tinh chế protein SFn3 Kết quả kiểm tra bằng điện di các phân đoạn protein thu được sau khi bơm lần lượt các đệm chảy qua cột cho thấy protein SFn3 được đẩy ra hoàn toàn ở đệm thu mẫu có nồng độ 400 mM imidazole ở các phân đoạn từ F5 đến F8. Protein SFn3 thu được ở các phân đoạn này tương đối sạch, đều có kích thước bằng kích thước của protein SFn3 theo tính toán và không quan sát thấy các băng protein tạp khác (Hình 3.20). Như vậy, protein SFn3 tái tổ hợp đã được tinh chế thành công. Để định lượng độ sạch của protein một cách tương đối, chúng tôi sử dụng phần mềm Quantity One (Hình 3.21). Đối với các đường chạy có xuất hiện chủ yếu lượng protein SFn3 được tinh chế là các phân đoạn thu mẫu bằng đệm chứa 400 mM imidazole, protein được tinh chế (từ phân đoạn F5 đến F7) có độ sạch đạt tới 99%. Dịch protein đã tinh sạch có chứa nhiều muối imidazole ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính thực của enzyme. Do đó, muối trong dịch chứa protein sẽ được loại bỏ để đánh giá hoạt tính của protein một cách chính xác nhất. Chúng tôi đã tiến hành loại muối bằng cột PD-10 với thể tích mẫu lên cột là 0,5 ml. Dịch protein tinh sạch này được bảo quản ở 4oC và được dùng để xác định hoạt tính và các tính chất của SFn3 tái tổ hợp. 86 Hình 3.20. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm các phân đoạn tinh chế SFn3 bằng cột sắc ký ái lực trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS Ghi chú: 1: Protein tổng số; 2: Protein pha tan; 3: Protein pha tủa; 4: Protein đi qua cột khi đưa mẫu lên giá thể; F1: Dịch rửa cột bằng đệm chứa 50 mM imidazole; F2: Dịch rửa cột bằng đệm chứa 150 mM imidazole; F3-F8: Các phân đoạn thu mẫu bằng đệm chứa 400 mM imidazole; F9-F10: Các phân đoạn thu mẫu bằng đệm chứa 500 mM imidazole; M: Thang protein chuẩn (Thermo Scientific) Hình 3.21. Kiểm tra độ sạch của SFn3 tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One tại các phân đoạn F5, F6, F7 chứa phần lớn lượng protein thu được 3.5.1.2. Tinh chế protein SFn3Egc Protein tái tổ hợp tập trung ở các phân đoạn thu mẫu từ F3 đến F7 và chỉ có một băng duy nhất trùng với kích thước của SFn3Egc được biểu hiện và không xuất hiện các protein tạp khác (Hình 3.22). Protein được xác định có độ sạch đạt tới trên 99%. Trên bản gel điện di được quét độ sạch cũng cho thấy không có băng protein tạp nào xuất hiện, chỉ có một số điểm pic nhỏ xuất hiện ở cuối đường chạy có thể quan sát được do đệm điện di (loading dye) chưa chạy hết còn lại trong quá trình SFn3 SFn3 87 điện di SDS-PAGE (Hình 3.23). Dựa trên kết quả thu được, chúng tôi tiếp tục tiến hành biểu hiện lượng lớn, tinh chế protein SFn3Egc tái tổ hợp và loại muối bằng cột PD-10 để phục vụ cho nghiên cứu hoạt tính và tính chất của enzyme. Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế SFn3Egc bằng cột sắc ký ái lực trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS Ghi chú: 1: Protein pha tan; 2: Dịch thu trong khi bơm mẫu lên cột; F1: Dịch rửa cột bằng đệm chứa 150 mM imidazole; F2-F7: Các phân đoạn thu mẫu bằng đệm chứa 400 mM imidazole; M: Thang protein chuẩn (Thermo Scientific) Hình 3.23. Kiểm tra độ sạch của SFn3Egc tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One tại các phân đoạn F3, F4, F5, F6 chứa phần lớn lượng protein thu được 3.5.1.3. Tinh chế protein SXFn3Egc Quá trình tinh chế SXFn3Egc với các điều kiện tương tự như tinh chế SFn3 và SFn3Egc đã được thực hiện theo các bước như trên. SXFn3Egc cũng được rửa ra hoàn toàn với đệm PBS 50 mM có nồng độ imidazole 400 mM (Hình 3.24). Protein bị đẩy ra hoàn toàn khỏi cột từ phân đoạn F4 đến F10 bởi đệm PBS chứa 400 mM SFn3Egc SFn3Egc 88 imidazole. Lượng protein tập trung phần lớn ở phân đoạn từ F8 đến F10. Qua kết quả kiểm tra điện di đồ sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế cho thấy từ phân đoạn F4 đến F10 chỉ xuất hiện 1 băng protein duy nhất có kích thước tương đương với SXFn3Egc như tính toán và không xuất hiện các protein tạp khác. Kết quả kiểm tra độ sạch của protein tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One cho thấy SXFn3Egc được xác định có độ sạch trên 99% (Hình 3.25). Như vậy, protein tái tổ hợp đã được tinh chế thành công với độ sạch cao. Chúng tôi tiến hành biểu hiện lượng lớn, tinh chế protein, loại muối bằng cột PD-10 và bảo quản ở 4oC để phục vụ cho nghiên cứu tính chất, cũng như hoạt tính của SXFn3Egc ở các thí nghiệm tiếp theo. Hình 3.24. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế SXFn3Egc bằng cột sắc ký ái lực His-tag trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS Ghi chú: 1: Protein tổng số; 2: Protein pha tan; 3: Dịch thu trong khi bơm mẫu lên cột; F1: Dịch rửa cột bằng đệm chứa 50 mM imidazole; F2: Dịch rửa cột bằng đệm chứa 150 mM imidazole; F3-F10: Các phân đoạn thu mẫu bằng đệm chứa 400 mM imidazole; M: Thang protein chuẩn (Thermo Scientific) Hình 3.25. Kiểm tra độ sạch của SXFn3Egc tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One tại các phân đoạn F8, F9, F10 chứa phần lớn lượng protein thu được SXFn3Egc SXFn3Egc 89 3.5.1.4. Tinh chế protein SXFn3 Kết quả tinh chế cho thấy protein SXFn3 thu được ở các phân đoạn rửa từ F2 đến F8. Phần lớn lượng protein tập trung ở phân đoạn F4 và F5 (Hình 3.26). Protein ở các phân đoạn này đều có kích thước tương đương với kích thước của SXFn3 và không quan sát thấy các băng protein tạp khác. Bản điện di SDS-PAGE sau tinh chế được quyét vào phần mềm Quantity One để đánh giá độ sạch tương đối. Kết quả các phân đoạn từ F3 đến F6 đều có độ sạch trên 99% (Hình 3.27). Như vậy, protein SXFn3 tái tổ hợp đã được tinh chế thành công. Chúng tôi tiến hành biểu hiện lượng lớn, tinh chế, loại muối để nghiên cứu tính chất và hoạt tính của protein tái tổ hợp. Hình 3.26. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế SXFn3 bằng cột sắc ký ái lực His-tag trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS Ghi chú: 1: Protein tổng số; 2: Protein pha tan; 3: Protein pha tủa; 4: Dịch thu trong khi bơm mẫu lên cột; F1: Dịch rửa cột bằng đệm chứa 50 mM imidazole; F2-F8: Các phân đoạn thu mẫu bằng đệm chứa 400 mM imidazole; M: Thang protein chuẩn (Thermo Scientific) Hình 3.27. Kiểm tra độ sạch của SXFn3 tái tổ hợp bằng phần mềm Quantity One tại các phân đoạn F3, F4, F5 chứa phần lớn lượng protein thu được SXFn3 SXFn3 90 3.5.2. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế 3.5.2.1. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ của các protein trên cơ chất CMC Để đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC, protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau tinh chế đều có độ sạch trên 99% được đưa vào các giếng (200 µl/giếng) đã được tạo trên đĩa thạch aga-CMC theo các bước thực hiện như phần phương pháp đã miêu tả. Kết quả cho thấy enzyme SXFn3Egc và SFn3Egc có khả năng thủy phân cơ chất CMC rõ rệt (Hình 3.28). Trong đó, vòng thủy phân cellulose của enzyme SXFn3Egc được quan sát thấy rõ ràng, có kích thước lớn hơn so với SFn3Egc. Như vậy, SXFn3Egc có cấu trúc đầy đủ các module (FN3, X) và vùng hoạt tính (Egc) thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất CMC mạnh nhất. Hình 3.28. Thử hoạt tính các protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau tinh chế trên đĩa thạch CMC-agar Đối chứng dương: Cellulase (Sigma); Đối chứng âm: Dung dịch glycerol 10% Các protein khác như SFn3 và SXFn3 không thể hiện được hoạt tính cellulase khi không quan sát thấy vùng thủy phân trên đĩa thạch được nhuộm bằng dung dịch Congo red như đối với SFn3Egc, SXFn3Egc và đối chứng dương (cellulase) (Hình 3.28). Kết quả này khác với thử nghiệm với các enzyme chưa được tinh chế, SFn3Egc trước tinh chế không thể hiện được hoạt tính cellulase trên cơ chất CMC. Điều này có thể giải thích do SFn3Egc chưa tinh chế có nồng độ thấp hơn nên hoạt tính cellulase chưa được quan sát rõ ràng. SFn3 và SXFn3 sau tinh chế cũng không có khả năng thủy phân cơ chất CMC. Như vậy, module FN3 đã có vai 91 trò giúp cho vùng Egc và toàn bộ cấu trúc enzyme SFn3Egc, SXFn3Egc được biểu hiện ở dạng tan, thể hiện được hoạt tính sinh học (cấu trúc chỉ có Egc không tan và không thể hiện được hoạt tính cellulase). Module FN3 cùng với vùng X còn giúp làm tăng sự hình thành cấu trúc vùng trung tâm hoạt tính chính xác, giúp vùng hoạt tính thể hiện phản ứng thủy phân cơ chất CMC mạnh hơn. 3.5.2.2. Đánh giá khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính của enzyme trên CMC Để đánh giá khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính cellulase của SFn3Egc và SXFn3Egc, chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính riêng rẽ với 4 loại protein tái tổ hợp chứa module FN3