Luận án Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (Carica papaya Linn

g gồm 20 tài liệu tiếng Việt, 86 tài liệu tiếng Anh). 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây đu đủ Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có 1 chi và một loài. Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan. Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu đủ Đài Loan được trồng ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất, 1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ Trong lá đu đủ có các chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosis, phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,. Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, . Ngoài ra còn có vitamin C, E, nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,... N C H 2 C C H 2 C C H H H C H 3(C H 2 )7 O C = O N C C C H 2 C H 2 C H H (C H 2 ) 7C H 3 H H C = O O N C H 2 C C H 2 C C H C H 3 H H(C H 2 ) 7 O C = O N C C C H 2 C H 2 C H H (C H 2 )7C H 3 H H C = O O Carpaine Pseudocarpaine 1.3. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ Một số nhóm chất trong lá đu đủ có hoạt tính chống ung thư. Ví dụ: nhóm glucosise bao gồm các chất benzyl glucosinolate, benzyl isothiocyanate có hoạt tính chống nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Nhóm các chất phenol bao gồm các chất: 5,7-dimethoxy coumarin, axi protocatechui, axit ρ- coumaric, axit caffeic, kaempferol, quercetin. Nhóm các chất này đã được chứng minh là có hoạt tính: ưc chế sự tăng sinh tế bào, tăng cường chức năng miễn dịch, ức chế enzyme ở pha I và II trong chu kỳ phân bào, ức chế sự kết dính tế bào và xâm lấn, cảm ứng quá trình tự chết. Nhóm các chất carotenoid các chất: β-carotene, lycopene, β-cryptoxanthin. Nhóm các chất này có tác 4 dụng phòng ung thư phổi, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư gan, Trong lá đu đủ có chứa protein bất hoạt ribosome (RIPs). RIPs có khả năng gây độc tế bào ung thư vú T47D với IC50 = 2,8 μg/ml. Chất chiết bằng nước từ các phần khác nhau của đu đủ có tác dụng ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc ức chế nhiều loại tế bào ung thư như: dạ dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu, lymphoma, bệnh bạch cầu,..Dịch chiết lá đu đủ bằng nước (nồng độ 0,625-20 µg/ml) có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Tác giả đã chứng minh dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u. Sau đó tác giả sử dụng màng lọc để tách thành 2 phần có trọng lượng phân tử khác nhau. Các chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư và điều hòa miễn dịch được xác định là nằm ở phần có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 1000. Chất chiết lá đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa. Các giống đu đủ khác nhau có tổng hàm lượng phenol khác nhau và hoạt tính chống oxy hóa cũng khác nhau. Điều đó chứng tỏ rằng các chất phenol gây ra hoạt tính chống oxy hoá. Các bộ phận khác nhau của cây đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt. Tuy nhiên, các hoạt chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập. Dịch chiết lá đu đủ có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn và nấm. Cao lá đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T. rubrum và Staphylococcus aureus. Ngoài ra, dịch chiết lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, kháng virut sốt xuất huyết,. 5 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Giống đu đủ Đài Loan (Carica papaya L.) được trồng tại Nam Hồng – Đông Anh – Hà Nội. Thu hái lá trên cây đu đủ cái, dạng lá bánh tẻ, không bị sâu bệnh, không bị dập nát. Lá thu hái vào tháng 10 năm 2012. Lá cây đu đủ thu hái về được sấy ở nhiệt độ 40 - 500C cho đến khô rồi nghiền thành bột. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất: dùng phương pháp chiết ngâm, chiết bằng sóng siêu âm để thu cặn chiết từ lá đu đủ. Sử dụng sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để phân lập các chất tinh khiết. Sử dụng phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được. 2.2.2. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.2.2.1. Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay): Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: - Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; 4 g/ml; 0,8 g/ml. - Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào, thêm lượng tế bào phù hợp và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. - Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. - Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng axit trichloracetic trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 0C. 6 - Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. - Ellipticine luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương. - DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư. 2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3 / 7: Được thực hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng loại bỏ gốc tự do DPPH Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ. 2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của Stroev E A, Makarova V G (1989), Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006). Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu. 2.2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột 7 Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan. Tế bào gan sau phân lập được nuôi ổn định 1-2 ngày. Thêm hoạt chất nghiên cứu hoặc cucurmin (đối chứng dương). Thêm 100 µM H2O2 vào mỗi giếng, ủ trong 2 giờ. Cho 50 µl/giếng MTT nồng độ 1mg/ml, ủ trong 4 giờ. Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO 100%. Đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 492 nm. 2.2.2.6. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ (Multimicrodilution assay). 2.2.2.7. Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch Động vật thí nghiệm: Thỏ 3 tháng tuổi khỏe mạnh, được nuôi tại chuồng nuôi của viện Công nghệ sinh học. Hoạt tính kích thích miễn dịch của các mẫu được xác định theo phương pháp MTT (Mosmann (1983)). Tế bào lympho được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x106 tế bào/ml. Bổ sung chất thử pha trong DMSO 10%. Concavalin A được sử dụng làm đối chứng. Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37 oC, 5% CO2. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT 1mg/ml. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37o C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 µl DMSO. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm. 8 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập cặn chiết phân đoạn CH2Cl2 Từ 101,90 gam cặn chiết CH2Cl2, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient (bắt đầu từ 0% MeOH đến 50% MeOH). Cuối cùng dùng dung môi MeOH 100% để dội cột nhằm rửa toàn bộ các chất còn bị giữ lại trên cột sắc ký. Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn, soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện màu bản mỏng bằng thuốc thử Ce(SO4)2 và vanilin. Kết quả, thu được 13 phân đoạn chính như sau: Bảng 3.1: Khối lượng các phân đoạn từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ (bảng 3.2 của luận văn) TT Kí hiệu phân đoạn Khối lượng (g) 1 F1 1,0530 2 F2 2,4254 3 F3 2,3174 4 F4 3,6284 5 F5 2,2090 6 F6 3,0837 7 F7 1,2896 8 F8 5,2600 9 F9 13,8602 10 F10 10,0700 11 F11 20,5137 12 F12 4,2901 13 F13 27,6800 3.2. Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn Từ phân đoạn F5, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient, thu được 6 phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1-F5.6 Phân đoạn F5.2 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP1 (139,6 mg). 9 Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi Hx/EtOAc gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.5 Phân đoạn F8.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel hệ dung môi Hx/EtOAc xuất hiện tinh thể. Lọc rửa bằng Hx/CH2Cl2 thu được chất sạch CP2 (6,7 mg). Từ phân đoạn F9.I, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient và HCOOH (1%) thu được 11 phân đoạn nhỏ kí hiệu F9.I.1-F9.I.11 Phân đoạn F9.I.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi EtOH và cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradient thu được chất sạch CP3 (6 mg). Phân đoạn F9.I.11 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/axeton geadient thu được chất sạch CP4 (16,4 mg). Từ phân đoạn F11.II, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và CH2Cl2/MeOH/NH4OH thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F11.II.1- F11.II.7. Kết tinh phân đoạn F11.II.4 bằng hệ dung môi Hx/CH2Cl2 thu được chất sạch CP5 (210,1 mg). Dịch cái tiếp tục được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc/NH4OH và sắc ký cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP6 (18,7 mg). 3.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã được phân lập 3.3.1. Hợp chất CP1 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 145 – 1460C 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3,58 (1H, t, J = 4,5 Hz, OH), 3,94 (6H, s, 2 x OCH3), 4,83 (2H, d, J = 4,5 Hz, CH2-2), 6,21 (1H, s, OH), 7,18 (1H, s, H-2’ + H-6’). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 56,5 (2 x OCH3), 64,9 (C-2), 105,0 (C- 2’ + C-6’), 124,8 (C-1’), 140,8 (C-4’), 147,1 (C3’ + C5’), 196,6 (C=O). Phân tích chi tiết các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất CP1 là danielone. Hợp chất này lần đầu tiên được tách ra từ lá đu đủ. 10 OCH3 OH OCH3 HO O 1 2 1' 2' 3' 4' 5' 6' Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất danielone (hình 3.3 của luận văn) 3.3.2. Hợp chất CP2 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 135 - 1370C. ESI-MS: m/z 274 [M+Na]+. HR-ESI-MS (+) m/z: 274,1411. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm): 1,37 (6H, m, CH2-4’+ CH2-5’+ CH2- 6’); 1,06 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH2-7’); 1,69 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH2-3’); 2,28 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-8’); 2,30 (3H, s, CH3); 2,71 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-2’); 5,97 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-4); 6,92 (1H, d, J= 3,5 Hz, H-5) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 12,8 (CH3); 26,1 (C-7’); 27,1 (C-3’); 30,1 (C-6’); 30,2 (C-5’); 30,3 (C-4’); 35,1 (C-8’); 38,4 (C-2’); 110,3 (C-4); 119,7 (C-5); 132,2 (C-2); 138,6 (C-3); 177,0 (C-9’); 192,1 (C-1’).. Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS (+) của hợp chất CP2 (hình 3.4 của luận văn) Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP2 (hình 3.6 của luận văn) 11 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP2 (hình 3.7 của luận văn) Hình 3.5: Phổ COSY của hợp chất CP2 (hình 3.9 của luận văn) Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất CP2 (hình 3.10 của luận văn) 12 Hình 3.7: Phổ HSQC của hợp chất CP2 (hình 3.11 của luận văn) Phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC chúng tôi xác định được chất CP2 là axit 9’-(3-methyl-pyrrol-2-yl)-9’- oxononanoic. Đây là một hợp chất mới được đặt tên là carpainone. Trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công bố về hợp chất này trong lá đu đủ cũng như ở các loại thực vật khác. N H COOH O 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 2 3 5 4 9' Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpainone (hình 3.12 của luận văn) 3.3.3. Hợp chất CP3 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 192 – 1930C. ESI-MS: m/z 167 [M- H]-. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 3,91 (3H, s, OCH3), 6,83 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-6), 7,55 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz, H-5), 7,58 (1H, dd, J = 1,5 Hz, H-3). Sau khi so sánh các số liệu phổ của chất CP3 với tài liệu tham khảo chúng tôi đi đến kết luận chất CP3 là axit pluchoic. COOH OCH3 OH 1 2 4 5 6 3 13 Hình 3.9: Cấu trúc hóa học của hợp chất axit pluchoic (hình 3.15 của luận văn) 3.3.4. Hợp chất CP4 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 100 - 1040C [α]25D +288 (c=0,25 g/100ml trong MeOH) 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 0,97 (3H, s, CH3-12), 1,01 (3H, s, CH3- 13), 1,26 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-10), 2,10 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-2a), 2,38 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-2b), 2,56 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 4,11 (1H, dd, J = 1,5; 17,0 Hz, H-11a), 4,20 (1H, dd, J = 1,5; 17,0 Hz, H-11b), 4,20 (1H, quint, J = 6,0 Hz, H-9), 5,57 (dd, J = 8,5; 15,5 Hz, H-7), 5,66 (1H, dd, J = 5,5; 15,5 Hz, H-8), 6,17 (1H, s, H-4). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 23,5 (CH3-10), 27,0 (CH3-12), 27,7 (CH3-13), 36,2 (C-1), 48,1 (C-2), 50,8 (C-6), 63,8 (C-11), 68,0 (C-9), 122,3 (C-4), 126,3 (C-8), 138,6 (C-7), 165,9 (C-5), 199,6 (C=O). Phân tích chi tiết các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT COSY, HSQC, HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định được chất CP4 là Apocynol A. Hợp chất này lần đầu tiên được tách ra từ lá đu đủ. OH O OH 12 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 3.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất Apocynol A (hình 3.19 của luận văn) 3.3.5. Hợp chất CP5 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 118 – 1200C. ESI-MS: m/z 479 [M+H]+, 240 [M/2+H]+ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,05 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-2), 1,19 (1H, m, H-5a), 1,32 (9H, m, CH2-8+ CH2-9 + CH2-10 + CH2-11 + H-7a), 1,47 (2H, m, H-7b + H-5b), 1,65 (3H, m, CH2-12 + H-4a), 2,01 (1H, m, H-4b), 2,32 (1H, m, H-13a), 2,42 (1H, m, H-13b), 2,59 (1H, m, H-6), 2,87 (1H, dq, J=1,0, 7,0 Hz, H-2), 4,77 (1H, br, s, H-3). 14 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 18,6 (CH3-2), 25,4 (C-12), 25,4 (C- 8), 26,2 (C-5), 28,7 (C-11), 29,1 (C-4), 29,7 (C-9), 29,7 (C-10), 34,6 (C-13), 37,2 (C-7), 53,6 (C-2), 50,6 (C-6), 70,3 (C-3), 173,5 (C=O). Từ các dữ liệu phổ 1D, 2D-NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định đây là một alkaloid có cấu trúc đối xứng hai bên có tên carpaine. N H H ( C H 2 ) 7 C O O N H H 3 C ( C H 2 ) 7 C H 3 H O C = O 2 3 4 5 6 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 6 ' Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpaine (hình 3.24 của luận văn) 3.3.6. Hợp chất CP6 Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 72 – 730C ESI-MS: m/z 479 [M+H]+, 240 [M/2+H]+ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3), 1,06 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3), 2,50 (2H, m, H-6 + H-6’), 2,69 (1H, m, H-2a), 2,86 (1H, dq, J=1,5, 6,5 Hz, H-2’), 4,33 (1H, m, H-3), 4,83 (1H, br s, H-3’), 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 18,5 (CH3), 19,1 (CH3), 24,7 (CH2), 24,9 (CH2), 25,1 (CH2), 25,4 (CH2), 26,7 (CH2), 27,8 (CH2), 28,0 (CH2), 28,1 (CH2), 28,4 (CH2), 28,5 (CH2), 28,8 (CH2), 29,1 (CH2), 29,5 (CH2), 30,6 (CH2), 30,9 (CH2), 34,5 (CH2), 34,8 (CH2), 35,4 (CH2), 37,3 (CH2), 53,8 (CH), 54,9 (CH), 55,7 (CH), 56,6 (CH), 70,1 (CH), 75,8 (CH), 173,3 (C=O), 173,7 (C=O). Kết hợp các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất CP6 là đồng phân của chất CP5, chỉ khác nhóm CH3 ở C-2 dưới dạng axial. Hợp chất này có tên pseudocarpaine và đã được phân lập từ lá cây đu đủ. 15 N C H 3 H ( C H 2 ) 7 C O O N H H 3 C ( C H 2 ) 7 H H O C = O 2 3 4 5 6 2 ' 3 ' 4 ' 5 ' 6 ' Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất pseudocarpaine (hình 3.28 của luận văn) Kết luận: Từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ, chúng tôi đã tách chiết được 6 hợp chất. Trong đó, hợp chất danielone (CP1) được tách ra từ phân đoạn F5 của cặn chiết. Hợp chất carpainone (CP2) được tách ra từ phân đoạn F8 của cặn chiết, Hợp chất axit pluchoic (CP3), apocynol A (CP4) được tách ra từ phân đoạn F9 của cặn chiết. Hợp chất carpaine (CP5), pseudocarpaine (CP6) được tách ra từ các phân đoạn F11 của cặn chiết. 3.4. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết từ lá đu đủ Cặn chiết các phân đoạn đem thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư: ung thư biểu mô người KB, ung thư phổi người LU-1, ung thư vú người MCF-7. Kết quả thu được ở hình 3.13: Trong 5 phân đoạn cặn chiết thì 4 loại cặn chiết (Hx, EtOAc, BuOH và cặn nước còn lại) không có hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB, LU-1, MCF- 7 (với IC50>100 μg/ml). Chỉ có duy nhất cặn chiết CH2Cl2 là có hoạt tính gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm: KB, LU-1, MCF-7 với giá trị IC50 (μg/ml) lần lượt là: 18,44; 18,21; 19,16. Hình 3.13: Tổng hợp kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cặn chiết từ lá đu đủ (Hình 3.32 của luận văn) 16 3.5. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn phân lập từ cặn chiết CH2Cl2 từ lá đu đủ Sau khi phân lập cặn CH2Cl2 bằng sắc ký cột silica gel thu được 13 phân đoạn F1- F13. Các phân đoạn F1- F13 được đem thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB, kết quả như sau: Hình 3.14: Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn cặn chiết CH2Cl2 từ lá đu đủ (Hình 3.33 của luận văn) Kết quả trên cho thấy: Các phân đoạn F8, F9, F10, F11 có thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB với IC50 từ 15,41 đến 6,86 g/ml. Đặc biệt 2 phân đoạn F10, F11 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB rất mạnh (IC50 tương ứng là 7,17 và 6,86 g/ml). Các phân đoạn còn lại không có hoặc có hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô KB yếu (IC50 từ 23,93 đến >100 g/ml). Đối chứng dương là ellipticine hoạt động ổn định. 3.6. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ Chúng tôi tiến hành xác định khả năng diệt hoặc kìm hãm sự phát triển tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ lá đu đủ trên bốn dòng tế bào ung thư khác nhau. Ngoài ra, các mẫu nghiên cứu còn được thử nghiệm trên tế bào thường NH3T3 của người và xem như là dòng tế bào đối chứng để kiểm tra khả năng gây độc tế bào với tế bào bình thường. Kết quả cụ thể như sau: 17 Hình 3.15: Tổng hợp kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ (hình 3.49 của luận văn) Bốn hợp chất (danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A) không có hoạt tính gây độc tế bào đối với 04 dòng tế bào ung thư và 1 dòng tế bào thường thử nghiệm. Hai hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính rất tốt trên cả 4 dòng tế bào ung thư nghiên cứu (ung thư biểu mô KB, ung thư máu LH- 60, ung thư phổi LU-1, ung thư vú MCF-7) với các giá trị IC50 từ 1,13 đến 3,49 µg/ml. 3.7. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của một số hợp chất lên tế bào ung thư phổi LU-1 Xác định khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của 2 hợp chất (carpaine và pseudocarpaine) tách chiết được từ lá đu đủ trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. Kết quả cụ thể như sau: 3.7.1. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 Hợp chất carpaine tách chiết được từ lá đu đủ được đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. Hình 3.16: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1(hình 3.50 của luận văn) 18 Hợp chất carpaine thể hiện khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 ở nồng độ thử cao nhất (20 µg/ml) là 386,5 RFU. Chất đối chứng dương tamoxifen hoạt động ổn định trong thí nghiệm với hoạt tính caspase ở nồng độ 20 µg/ml là 3100 RFU. Thông qua thí nghiệm xác định độ độc của hoạt chất lên dòng tế bào nuôi cấy bằng phương pháp nhuộm SRB, kết quả tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng của hoạt chất ở nồng độ thử nghiệm nằm trong khoảng 84,67 đến 90,44% cho thấy hợp chất carpaine không gây chết tế bào trên diện rộng nhưng cũng đã có tác động nhất định lên tế bào. 3.7.2. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất psuedocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 Hợp chất pseudocarpaine tách chiết từ lá đu đủ được đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. Hình 3.17: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất pseudocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1(hình 3.51 của luận văn) Kết quả trên cho thấy hợp chất pseudocarpaine thể hiện khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 ở nồng độ thử cao nhất (30µg/ml) là 778 RFU. Chất đối chứng dương tamoxifen hoạt động ổn định trong thí nghiệm với hoạt tính caspase ở nồng độ 20 µg/ml là 3100 RFU. Thông qua thí nghiệm xác định độ độc của hoạt chất lên dòng tế bào nuôi cấy bằng phương pháp nhuộm SRB, kết quả tỉ lệ tế bào sống sót so với đối chứng của hoạt chất ở nồng độ thử nghiệm nằm trong khoảng 89 đến 96 19 % cho thấy hợp chất pseudocarpaine không gây chết tế bào trên diện rộng nhưng cũng đã có tác động nhất định lên tế bào. 3.8. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ 3.8.1. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ bằng phương pháp thử DPPH. Hình 3.18: Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH của các hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (hình 3.52 của luận văn) Kết quả cho thấy: 6 hợp chất thử nghiệm đều có EC50 > 128 µg/ml, lớn hơn nồng độ cao nhất của phép thử. Chất tham khảo là resveratrol có EC50 là 8,3 µg/ml. Kết quả này chứng tỏ, cả 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ chưa thể hiện hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ thử nghiệm. 3.8.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm MDA của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ bằng phương pháp thử nghiệm MDA. 20 Hình 3.19: Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phép thử MDA của các hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (hình 3.53 của luận văn) Bằng thử nghiệm MDA để kiểm tra khả năng chống oxy hóa in vitro của các hợp chất: danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine chúng tôi nhận thấy chỉ có duy nhất hợp chất pseudocarpaine ở nồng độ thử nghiệm cao nhất 100 µg/ml cũng chỉ có hoạt tính chống oxi hoá khoảng 33,59%, cho thấy có hoạt tính yếu. Các hợp chất còn lại bao gồm: danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A và carpaine đều không thể hiện hoạt tính chống oxi hóa trên thử nghiệm MDA ở các nồng độ nghiên cứu. 3.8.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ trên tế bào gan chuột. Hình 3.20: Kết quả xác định hoạt tính chống oxi hóa trên tế bào gan chuột của các hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (hình 3.54 của luận văn) 21 Qua quá trình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan phân lập của 6 hoạt chất cho thấy các chất đều không thể hiện hoạt tính ở nồng độ nghiên cứu. Cucurmin hoạt động ổn định trong thí nghiệm. 3.9. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập được Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân từ lá đu đủ (bảng 3.5 của luận văn) Chất thử Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi khuẩn và nấm - IC50