Luận án Nghiên cứu một số đặc tính của virus gây bệnh marek ở gà nuôi công nghiệp tại phía bắc Việt Nam và giải pháp nâng cao hiệu lực vắc xin phòng bệnh

ánh sự biến động về tình trạng sức khỏe của đàn tại thời điểm nhiễm bệnh hơn là đánh giá hiệu quả vắc xin. Mặt khác, cũng có thể do các chủng virus gây bệnh có độc lực khác nhau. 3.1.2. Phản ứng PCR xác định gen đặc hiệu của virus Marek. Trong thực tế, các bệnh do Avian leukosis virus (ALV) và Reticuloendotheliosis virus (REV) cũng có khả năng hình thành khối u ở gà mắc bệnh, để làm rõ các mẫu bệnh phẩm có MDV hay không, chúng tôi sử dụng phản ứng PCR để phát hiện các gen đặc hiệu của virus này. Theo Parcells et al. (2003) [93] gen Meq có kích thước 1.081 bp là gen đặc hiệu của MDV type 1. ADN tổng số được tách từ mẫu lách của gà nghi nhiễm bệnh được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm phản ứng được phát hiện bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trong hình 3.1. Hình 3.1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Meq (M: thang chuẩn; 1 - 8: các mẫu có sản phẩm PCR có gen Meq; 9 - 12: sản phẩm PCR không có gen Meq) Phản ứng PCR đã phát hiện được 8 mẫu lách có gen Meq, điều đó có nghĩa là có 8/126 cá thể gà nhiễm bệnh Marek. Điều đáng lưu ý là các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Nội, Phú Thọ có quy mô chăn nuôi gà công nghiệp lớn và các trang trại lấy mẫu đều thực hiện phòng ngừa bệnh Marek bằng vắc xin đúng theo quy trình. Như vậy, hiện tượng gà nhiễm bệnh sau khi đã sử dụng vắc xin là vấn đề cần được đánh giá, xem xét về các khía cạnh, bao gồm sự biến chủng của virus, sự thay đổi độc lực của chủng gây bệnh và sự suy giảm hiệu lực của vắc xin. 3.1.3. Nuôi cấy phân lập virus Marek Chúng tôi đã tiến hành phân lập virus từ bệnh phẩm tại phòng thí nghiệm. Tổng số 126 mẫu bệnh phẩm thu thập được sàng lọc trước hết bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho vùng gene Meq. Kết quả thu được 8 mẫu lách dương tính PCR, 5 mẫu từ Hà Nội, 2 mẫu từ Vĩnh Phúc và 1 từ mẫu Phú Thọ. Những mẫu này có lượng virus lớn hơn, thuận lợi cho phân lập căn bệnh. Trên cơ sở đó, 8 mẫu bệnh phẩm nhiễm MDV (dương tính PCR) được sử dụng để phân lập virus. Huyễn dịch bệnh phẩm của 8 mẫu dương tính PCR được sử dụng để gây nhiễm tế bào xơ phôi vịt như trình bày ở phần phương pháp nghiên cứu. Sau 5 ngày tiếp tục nuôi cấy ở nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2 và theo dõi hàng ngày, chúng tôi thu được một mẫu duy nhất có sự hủy hoại tế bào. Tám mẫu phân lập được cấy chuyển 1 lần cũng trên tế bào xơ phôi vịt, kết quả vẫn chỉ có 1 mẫu gây hủy hoại tế bào. Toàn bộ 8 mẫu phân lập được kiểm tra bằng PCR để xác nhận nếu có mặt virus Marek, tuy nhiên chúng tôi chỉ thu được một mẫu dương tính PCR. Đó cũng chính là mẫu phân lập có bệnh tích tế bào. Hình 3.2: Hình ảnh nuôi cấy phân lập MDV trên tế bào xơ phôi vịt (A: giếng tế bào đối chứng không có dịch phân lập virus, B: giếng nuôi cấy với dịch phân lập virus) Sử dụng phương pháp Plaque để xác định độc lực của chủng MDV 6.13 trên tế bào xơ phôi vịt cho kết quả: sau 5 ngày gây nhiễm, các đám tổn thương tế bào đã được phát hiện và dùng kính hiển vi để xác định số lượng Plaque (hình 3.3). Hiệu giá virus của chủng MDV 6.13 là 3 x 107 PFU/ml. Hình 3.3: Hình ảnh Plaque do MDV gây trên tế bào xơ phôi vịt sau 5 ngày gây nhiễm 3.1.4. Kết quả xác định trình tự gen Meq Tham khảo nghiên cứu của Laurent et al. (2001) [77] bằng cặp mồi Meq đã khuếch đại được đoạn gen có kích thước khoảng 1081 bp. Kết quả thu được ở hình 3.5 cho thấy một sản phẩm PCR với duy nhất một băng ADN sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ. Kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá của gen Meq của virus gây bệnh Marek ở gà. Tuy nhiên, để khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen Meq chúng tôi đã tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự gen này trên Gene bank. Hình 3.4: Kết quả khuếch đại gen Meq của chủng MDV 6.13 (M: thang chuẩn, 1-2: băng điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Meq) Plasmid pUC18-Meq tái tổ hợp được tạo ra bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR đã được xử lý cắt bằng Bam HI và Eco RI vào vector tách dòng pUC18 của hãng Fermentas nhờ enzyme T4-ADN ligase. Phản ứng nối được thực hiện dựa trên đặc tính xúc tác hình thành liên kết nối hai đoạn ADN của enzym T4-ADN ligase. Enzym này có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli, có khả năng nối hai trình tự ADN. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 22ºC trong thời gian 10 phút. Sản phẩm sau đó được biến nạp vào chủng E.coli JM109. Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn, ADN plasmid tái tổ hợp được tạo ra với số lượng lớn các bản sao. Quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt và được sàng lọc bước đầu trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100 µg/ml. Để kiểm tra kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector pUC18 và biến nạp vào tế bào E. coli JM109, 3 khuẩn lạc trắng được lựa chọn ngẫu nhiên rồi nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicilin (100 µg/ml) lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37°C. Sinh khối vi khuẩn được thu lại để sử dụng cho 2 thí nghiệm chứng minh sự có mặt của gen Meq cũng như kết quả tách dòng, bao gồm phản ứng PCR với mồi đặc hiệu của gen Meq và thí nghiệm tách plasmid cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Kết quả hai thí nghiệm này đều được điện di trên gel agarose 0,8% (hình 3.6). Hình 3.5: Kết quả tách plasmid từ khuẩn lạc trắng Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Meq từ khuẩn lạc trắng; (B) Hình ảnh điện di sản phẩm cắt bằng enzyme Bam HI và Eco RI với plasmid tái tổ hợp pUC18-T4 đã tách chiết được từ khuẩn lạc trắng Ở vị trí nhận biết đa điểm của vector PUC18 có một vị trí nhận biết của enzyme Bam HI và Eco RI. Và khi vector đã gắn sản phẩm PCR thì vị trí này nằm ở hai đầu của ADN ngoại lai. Do đó, khi xử lý vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn Bam HI và Eco RI, các enzyme sẽ cắt rời đoạn ADN ngoại lai và kích thước của nó thay đổi không đáng kể. Kết quả điện di trong hình 6B cho thấy ở các giếng 1-3 xuất hiện 2 băng trong đó 1 băng có kích thước khoảng hơn 1000 bp tương đương với đoạn gen Meq, 1 băng có kích thước khoảng 2,7kb tương đương với kích thước vecto pUC18. Cùng với kết quả phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen Meq từ khuẩn lạc trắng đã chứng tỏ gen Meq đã được tách dòng thành công. Vạch điện di tương ứng với kích thước của gen Meq được tinh sạch và xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình được thực hiện theo Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing, trình tự đoạn gen này được xác định như sau: cccccctcgatcttttctcgggtcgacttcgagacggaaaaaaaggaaaagtcacgacatccccaacagcccctccaaacaccccttccctgacggcctatctgaggaggagaaacaggtctacggtcaagccggggccttcccccctccaactggaaaggaggagaaaaaggaatcgtgacgccgctcggagaagacgcagggacagacgtactatgtagacaaactccatgaagcatgtgaagagcttggtggtttcgcagagggccaatgaacacctacgtaaggaaattcgagatctaaggactgagtgtttgtccctgcgtgcacagttggcttgtcatgagccagtttgccctatggcggtacccctaacggtgacccttggactgcttaccgccacatccggccccgcacgatcccgttcctgaacctcccatttgcactcctccacctccctcaccggatgaacctaacgctccacattgctccggttcccaacctcctatctgtaccccccgtcctcccgatacggaggaactttcgcccagctctgctcgaccccaccacctcccatctctactccccatattatctacgctccggggccttcccccctccaacctcctatctgtacccccgccacgtcctcccgatgcggaggagccgcccagctctgctcgaccccaccacctcccatctgtactccccattccctcttctgccctccccagcctccatctccctttttacccggagggcatcttccctgcattgtgtcctgttaccgagccgtgtacccctccatcgccggggacggtttacgctcagctttgtcctgttggccaggctcccctttttaccccatctcccccacatccggctccggagccggagaggctttatgctcgtcttaccgaggatcccgaacaggattccttgtattcgggccagatttatattcagtttccctaggatactcagtctacggtctggtggtttccaggtgacgggagaccctga Sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương đồng của trình tự gen Meq thu được với các trình tự của GenBank cho thấy đoạn gen này có độ tương đồng là 95% với các trình tự gen Meq của Gallid herpesvirus (Hình 3.6). Hình 3.6: Bảng tổng hợp các trình tự tương đồng của Gene bank với gen Meq của chủng MDV 6.13 Bằng công cụ Blast, so sánh với trình tư gen Meq có mã số KP888857.1 đã thu được kết quả tai phụ lục 2. Như vậy trên cơ sở so sánh độ tương đồng của đoạn gen Meqcủa chủng virus phân lập được giải trình tự với gen Meq của Gallid herpesvirus đã xác định được trình tự gen Meq của chủng MDV 6.13 chỉ tương đồng 95% với các trình tự của Gene bank. Với mức độ tương đồng thấp như vậy và có đặc tính di truyền gần gũi nhất với chủng MDV có độc lực rất cao lưu hành tại Trung quốc. Chúng tôi nhận định có thể chủng MDV 6.13 đã có sự biến chủng có độc lực cao và có khả năng gây bệnh cả khi gà đã được tiêm vắc xin phòng bệnh. 3.2. Khả năng gây bệnh của chủng MDV phân lập được 3.2.1. Khả năng gây bệnh của MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn ba giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 để đánh giá khả năng gây bệnh của chủng MDV 6.13 phân lập được. Với liều gây nhiễm là 2.000 PFU/con, sau thời gian theo dõi ba tháng chúng tôi đã thu được các kết quả trong bảng 3.2. Bảng 3.2: Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập trên các giống gà thí nghiệm Giống gà Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) Tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Gà Ri (n=120) 85 70,83 Gầy ốm, mào tái 70,83 40 33,33 Đi loạng choạng 54,17 Liệt, sệ cánh 39,17 Liệt chân 9,17 Viêm mống mắt, mù 0,83 Gà Lương Phượng (n=120) 102 85 Gầy ốm, mào tái 85 52 43,33 Đi loạng choạng 56,67 Liệt, sệ cánh 40 Liệt chân 15,83 Viêm mống mắt, mù 1,67 Gà Ross 308 (n=120) 107 89,17 Gầy ốm, mào tái 89,17 69 57,5 Đi loạng choạng 60 Liệt, sệ cánh 45,83 Liệt chân 33,33 Viêm mống mắt, mù 4,17 Đối chứng (n=40) 0 0 Gầy ốm, mào tái 0 0 0 Đi loạng choạng 0 Liệt, sệ cánh 0 Liệt chân 0 Viêm mống mắt, mù 0 Kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng MDV 6.13 có độc lực tương đối cao, sau ba tháng theo dõi, virus gây bệnh với các triệu chứng điển hình với tỷ lệ là 70,83%, 85% và 89,17% cho ba giống gà tương ứng là gà Ri, Lương Phượng, Ross 308. Theo dõi các triệu chứng lâm sàng của bệnh Marek ở các giống gà được gây nhiễm với chủng MDV 6.13 chúng tôi nhận thấy gà có biểu hiện gầy ốm, mào tái cao nhất, chiếm tới 70,83%, 85% và 89,17 số gà thí nghiệm. Theo Lê Văn Năm (1996) [8] sở dĩ gà mắc bệnh Marek có thể trạng gầy xơ xác trong khi vẫn ăn uống bình thường là do không có khả năng chuyển hóa thức ăn. Các triệu chứng liên quan đến thần kinh ở các lô gà thí nghiệm tương ứng như đi lại loạng choạng chiếm tỷ lệ 54,17%, 56,67% và 60%; tỷ lệ gà bị liệt chân chiếm 9,17%, 15,83%, 33,33%; liệt và sệ cánh chiếm tỷ lệ 39,17%, 40%, và 45,83%. Các biểu hiện này đã chứng tỏ có sự tổn thương thần kinh vận động ở gà thí nghiệm. Điều đáng lưu ý là chủng MDV 6.13 có khả năng gây viêm mống mắt ở gà thí nghiệm, tỷ lệ tương ứng ở các lô có biểu hiện là 0,83%, 1,67% và 4,17%. Kết quả này có sự khác biệt với nghiên cứu của Lê Văn Năm (1996) [8], tác giả không ghi nhận được triệu chứng gà viêm mống mắt gà được gây nhiễm bằng cách sử dụng máu gà bị bệnh Marek cho 4 giống gà khác nhau là Rốt-Ri, Lơgo lai Rốt-Ri, Lơgo và Plymút. Các kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng MDV 6.13 có khả năng gây bệnh cả thể thần kinh và thể viêm mắt; gà Ri có sức đề kháng với virus gây bệnh Marek cao hơn giống gà nhập ngoại Ross 308. Kết quả này cũng phù hợp với thông báo của Cole R.K. (1966, 1968) [48, 47] cho thấy các giống gà địa phương có sức đề kháng cao với bệnh Marek hơn các giống gà nhập ngoại. Theo dõi tiến trình phát triển của bệnh Marek trên gà sau các tháng thí nghiệm cho kết quả được trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng bệnh Marek qua từng tháng theo dõi Tháng theo dõi Biểu hiện Gà Ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Lô đối chứng Tháng thứ nhất Tỷ lệ có biểu hiện bệnh (%) 26,67 31,67 35,00 0 Tỷ lệ chết (%) 5,00 6,67 9,17 0 Gầy ốm, mào tái 26,67 31,67 35,00 0 Đi loạng choạng 17,50 23,33 29,17 0 Liệt, sệ cánh 14,17 17,50 25,83 0 Liệt chân 6,67 9,17 10,83 0 Viêm mống mắt, mù 0 0 0,83 0 Tháng thứ hai Tỷ lệ có biểu hiện bệnh cộng dồn/tổng số thí nghiệm (%) 55,83 59,17 65,83 0 Tỷ lệ chết cộng dồn trên tổng số thí nghiệm (%) 25,83 30,83 35,83 0 Gầy ốm, mào tái 55,83 59,17 65,83 0 Đi loạng choạng 32,50 40,83 43,33 0 Liệt, sệ cánh 31,67 31,67 31,67 0 Liệt chân 8,33 10,83 16,67 0 Viêm mống mắt, mù 0 0 1,67 0 Tháng thứ ba Tỷ lệ có biểu hiện bệnh cộng dồn/tổng số thí nghiệm (%) 70,83 85 89,17 0 Tỷ lệ chết cộng dồn trên tổng số thí nghiệm (%) 33,33 43,33 57,5 0 Gầy ốm, mào tái 70,83 85 89,17 0 Đi loạng choạng 54,17 56,67 60 0 Liệt, sệ cánh 39,17 40 45,83 0 Liệt chân 9,17 15,83 33,33 0 Viêm mống mắt, mù 0,83 1,67 4,17 0 Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy sau 3 tháng theo dõi, tất cả các lô gà thí nghiệm đều có biểu hiện mắc bệnh Marek với các triệu chứng lâm sàng đặc trưng như gầy ốm, mào tái, đi loạng choạng, liệt, sệ cánh, liệt chân, viêm mống mắt, mù Nhìn chung, chủng MDV6.13 có độc lực tương đối cao, ngay từ tháng đầu tiên sau gây nhiễm, virus gây bệnh với tỷ lệ là 26,67%, 31,67% và 35% tương ứng ở các lô gà thí nghiệm; gây chết với tỷ lệ là 5%, 6,67% và 9,17% trên các giống gà Ri, Lương Phượng và Ross 308. Sang tháng thứ 2, tỷ lệ mắc bệnh tăng nhanh, cao gấp đôi trong khi đó tỷ lệ chết tăng gấp 5 lần so với tháng thứ nhất, cụ thể trên các giống gà Ri, Lương Phượng và Ross 308, virus gây bệnh với tỷ lệ mắc tương ứng là 55,83%, 59,17% và 65,83%; tỷ lệ chết tương ứng là 25,83%, 30,83% và 35,83%. Ở tháng thứ 3, tỷ lệ mắc bệnh và chết tiếp tục tăng, số gà mắc bệnh Marek lên tới 70,83%, 85% và 89,17%; số gà chết do bệnh là 33,33%, 43,33% và 57,5% tương ứng trên các giống gà Ri, Lương Phượng và Ross 308 (Hình 3.7). Ở lô đối chứng, gà không gây nhiễm virus nhưng được nuôi với điều kiện nuôi và chăm sóc giống với lô thí nghiệm không có tình trạng gà ốm và chết. Hình 3.7: Mức độ gây bệnh và gây chết của chủng MDV 6.13 ở gà thí nghiệm Theo Hồ Đình Chúc (1987) [2] gà thí nghiệm sau khi gây nhiễm 4 - 6 tuần bắt đầu có triệu chứng thần kinh. Tuy nhiên, kết quả trong bảng 3 cho thấy ngay từ tháng thứ nhất gà đã có biểu hiện tổn thương thần kinh vận động, cụ thể tỷ lệ gà có biểu hiện liệt, sệ cánh là 14,17%, 17,50% và 25,83%; tỷ lệ liệt chân là 6,67%, 9,17% và 10,83% tương ứng với các giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 (Hình 3.8). Hình 3.8: Các biểu hiện tổn thương thần kinh của gà gây nhiễm với MDV 6.3 Theo dõi ở tháng tiếp theo cho thấy tỷ lệ gà bị liệt, sệ cánh tăng nhanh, đặc biệt ở lô gà Ri thí nghiệm số cá thể có biểu hiện loạng choạng tương đương với số gà bị liệt, sệ cánh, cụ thể gà đi loạng choạng tỷ lệ là 32,5%, liệt sệ cánh là 31,67%, cũng trong tháng này, tỷ lệ liệt sệ cánh ở 3 giống gà là như nhau. Điều đáng lưu ý là ở tháng thứ 3, hiện tượng tổn thương thần kinh vận động của gà thí nghiệm tăng cả về số cá thể mắc và mức độ mắc. Cụ thể gà đi lại loạng choạng chiếm tỷ lệ 54,17%, 56,67%, 60%; gà bị liệt chân chiếm 9,17%, 15,83% và 33,33% tương ứng với các giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308. Trong đó gà Ross 308 có mức độ tổn thương cao hơn so với gà Lương Phượng và gà Ri. 3.2.2. Khả năng gây bệnh của MDV phân lập được trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi khác nhau Các nghiên cứu của Biggs et al. (1965) [28], Callnek (1986) [38] đã cho thấy gà mẫn cảm nhất với Marek ở giai đoạn từ 1-30 ngày tuổi, gà con một ngày tuổi mẫn cảm hơn từ 1.000 - 10.000 lần so với gà ở giai đoạn 14-26 ngày tuổi. Theo Hồ Đình Chúc (1987) [2] trong điều kiện tự nhiên, bệnh Mark thường quan sát thấy ở gà 3-5 tháng tuổi, ở thể cấp tính bệnh có thể thấy ở tuổi gà sớm hơn. Nhưng nếu bệnh ở dạng cổ điển thì thường thấy ở gà lớn hơn 6-8 tháng tuổi. Khả năng nhiễm bệnh Marek tỷ lệ nghịch với tuổi gà. Trong nghiên cứu này, gà ở các độ tuổi là 1 ngày, 1 tuần, 1 tháng và 3 tháng thuộc ba giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 được sử dụng để nghiên cứu khả năng gây bệnh của chủng virus Marek phân lập được. Với các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ chết, các biểu hiện lâm sàng, mức độ bài thải virus. Kết quả chúng tôi thu được trình bày ở hình 3.9. Hình 3.9: Tỷ lệ gà mắc bệnh và chết do chủng virus MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi So sánh tỷ lệ mắc bệnh của gà thí nghiệm ở các độ tuổi có sự sai khác rõ rệt giữa gà 1 ngày tuổi và 1 tuần tuổi với gà 3 tháng tuổi. Đặc biệt là giống gà Ri có từ 90-100% số gà 1 tuần tuổi và 1 ngày tuổi có biểu hiện lâm sàng của bệnh Marek trong khi đó ở gà 3 tháng tuổi tỷ lệ này giảm xuống còn 26,67%, 66,67% tương ứng có biểu hiện lâm sàng của bệnh (bảng 3.4). Đối với 2 giống gà nhập nội Lương Phượng và Ross 308, kết quả theo dõi cho thấy 100% gà 1 ngày tuổi và 1 tuần tuổi có biểu hiện bệnh Marek, ở gà 1 tháng tuổi thấy tỷ lệ có biểu hiện bệnh vẫn rất cao, chiếm tới 83,33% và 96,67% tương ứng với gà Lương Phượng và Ross 308 thí nghiệm. So với gà Ri ở độ tuổi 3 tháng thì số gà thuộc hai giống Lương Phượng và Ross 308 có biểu hiện bệnh sau khi bị gây nhiễm với chủng MDV6.13 tăng gấp đôi, tương ứng chiếm tới 56,57% và 60%. Kết quả này lần nữa chứng tỏ các giống gà nhập ngoại mẫn cảm với virus gây bệnh Marek hơn so với gà nội địa ở tất cả các độ tuổi gây bệnh thực nghiệm. Đồng thời tuổi gà càng tăng thì mức độ mẫn cảm với MDV6.13 càng giảm. Tỷ lệ chết của gà thí nghiệm giảm dần theo tuổi gà. Theo dõi ở các độ tuổi khác nhau cho thấy hơn 50% số gà thí nghiệm 1 ngày tuổi bị chết do MDV6.13, cụ thể tỷ lệ chết chiếm tới 53,33%, 73,33% và 86,67% tương ứng với các lô gà Ri, Lương Phượng và Ross 308. Kết quả này cho thấy các giống gà thí nghiệm 1 ngày tuổi rất mẫn cảm với virus gây bệnh Marek. Ở 3 tháng tuổi, tỷ lệ gà chết do chủng virus MDV 6.13 giảm mạnh, chỉ còn 3,33% đối với gà Ri và 6,67% đối với gà Lương Phượng. Trong khi đó, ở lô gà Ross 308 thì tỷ lệ chết vẫn chiếm tới 26,67 (bảng 3.4). Như vậy, ở độ tuổi này, giống gà nội địa dường như ít mẫn cảm hơn với bệnh Marek. Theo Hồ Đình Chúc (1984, 1987) [1, 2], Phan Văn Lục (2008) [7] gà bệnh Marek xuất hiện rất sớm từ 1,5 - 2 tháng tuổi. Theo Lê Văn Năm (1996) [8] từ năm 1982 - 1990 đã xác định được bệnh Marek gây ra ở gà 6 - 8 tháng tuổi và ở giai đoạn từ năm 1988 - 1995 thấy gà bị bệnh Marek chủ yếu ở thể cấp tính và tập trung ở gà 3 - 5 tháng tuổi, sớm nhất sau 45 ngày. Bảng 3.4: Mức độ gây bệnh của chủng MDV phân lập được trên các giống gà ở các độ tuổi Giống gà Gà ri Gà Lương Phượng Gà Ross 308 Ngày buổi Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) Tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%) Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) Tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%) Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Số gà có biểu hiện bệnh Marek (n) Tỷ lệ có biểu hiện bệnh Marek (%) Triệu chứng của gà mắc bệnh Tỷ lệ các triệu chứng bệnh Marek (%) Số gà chết do bệnh Marek (n) Tỷ lệ chết do bệnh Marek (%) Một ngày tuổi (n=30) 30 100,00 Gầy ốm 100,00 30 100 Gầy ốm 100,00 22 73,33 30 100 Gầy ốm 100,00 26 86,67 Mất thăng bằng 100,00 Mất thăng bằng 100,00 Mất thăng bằng 100,00 Sệ cánh 73,33 16 53,33 Sệ cánh 76,67 Sệ cánh 83,33 Liệt chân 20,00 Liệt chân 26,67 Liệt chân 53,33 Viêm, mù mắt 3,33 Viêm,mù mắt 6,67 Viêm, mù mắt 13,33 Một tuần tuổi (n=30) 27 90,00 Gầy ốm 90,00 30 100 Gầy ốm 90,00 15 50 30 100 Gầy ốm 96,67 19 63,33 Mất thăng bằng 76,67 Mất thăng bằng 83,33 Mất thăng bằng 90,00 Sệ cánh 43,33 13 43,33 Sệ cánh 50,00 Sệ cánh 53,33 Liệt chân 10,00 Liệt chân 16,67 Liệt chân 36,67 Viêm ,mù mắt - Viêm ,mù mắt - Viêm ,mù mắt 3,33 Một tháng tuổi (n=30) 20 66,67 Gầy ốm 66,67 25 83,33 Gầy ốm 66,67 13 43,33 29 96,67 Gầy ốm 76,67 16 53,33 Mất thăng bằng 26,67 Mất thăng bằng 30,00 Mất thăng bằng 33,33 Sệ cánh 26,67 10 33,33 Sệ cánh 26,67 Sệ cánh 33,33 Liệt chân 3,33 Liệt chân 13,33 Liệt chân 30,00 Viêm mù mắt - Viêm mù mắt - Viêm, mù mắt - 3 tháng tuổi (n=30) 8 26,67 Gầy ốm 26,67 17 56,67 Gầy ốm 83,33 2 6,67 18 60 Gầy ốm 83,33 8 26,67 Mất, thăng bằng 13,33 Mất ,thăng bằng 13,33 Mất ,thăng bằng 16,67 Sệ cánh 13,33 1 3,33 Sệ cánh 6,67 Sệ cánh 13,33 Liệt chân 3,33 Liệt chân 6,67 Liệt chân 13,33 Viêm ,mù mắt Viêm mù mắt Viêm mù mắt - Theo Kanji Hirai (2001) [70] virus Marek tác động tới hệ thần kinh ngoại biên nhiều hơn là thần kinh trung ương. Bệnh Marek ở gà có biểu hiện tổn thương thần kinh rất đặc trưng bao gồm bị liệt (Paralisis) hoặc bán bại liệt (Paresis). Lúc đầu gà đi lắc nhẹ, ngón chân chụm lại với nhau, gà sã một trong hai cánh theo chu kỳ, sau đó nặng dần và liệt hoặc bán liệt trở thành cố định. Gà đứng không cân đối, đi loạng choạng, lúc ngã bên này lúc ngã bên kia, vì thế gà lười đi lại, hay nằm hoặc ngồi bằng đầu gối với các tư thế chụm các đầu ngón chân lại với nhau hoặc uốn duỗi một trong hai chân. Khi bệnh nặng chân gà có thể bị liệt hoàn toàn, gà nằm với tư thế rất điển hình như một chân duỗi thẳng cẳng ra phía trước, chân còn lại duỗi thẳng ra phía sau, bàn chân sau ngửa hẳn lên trời (Hình 3.10). Nhiều con chân bị choãi ra hai bên, do liệt nên gà đi lại không bình thường, ở cơ đùi, cơ ngực thường hay quan sát thấy các vết thương. Nhiều trường hợp khi xua đuổi gà thấy hiện tượng như con chụm cả bàn chân chạy nghiêng ngả, con ngã sấp chúi đầu xuống sàn, con ngã bên này hay bên kia, nhiều con chuyển động một chiều vòng tròn tại chỗ hoặc nghiêng bên này, bên kia như một bánh lái chèo xoay tại một điểm cố định. Hình 3.10: Gà 6 tuần tuổi bại liệt sau khi gây nhiễm bằng chủng MDV 6.13 Hình 3.11: Tỷ lệ xuất hiện các biểu hiện tổn thương thần kinh do chủng virus MDV 6.13 trên các giống gà thí nghiệm ở các độ tuổi Theo dõi các biểu hiện tổn thương thần kinh vận động ở gà thí nghiệm sau khi gây nhiễm với chủng virus MDV 6.13 cho thấy toàn bộ lô gà 1 ngày tuổi thuộc cả 3 giống gà Ri, Lương Phượng và Ross 308 đều có biểu hiện mất thăng bằng, đi loạng choạng. Hiện tượng này giảm dần ở các lô gà có độ tuổi lớn hơn và có sự sai khác đáng kể giữa các giống gà thí nghiệm, cụ thể tương ứng với các giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308lô gà 1 tuần tuổi, tỷ lệ gà có triệu chứng mất thăng bằng là 76,67%, 83,33% và 90%; lô gà 1 tháng tuổi có tỷ lệ đi loạng choạng là 26,67%, 30% và 33,33% (hình 3.11) Trên đối tượng gà 3 tháng tuổi, chủng virus MDV 6.13 gây tổn thương thần kinh ở mức độ thấp hơn rất nhiều so với các lứa tuổi gà trước đó. Tỷ lệ gà mất thăng bằng chỉ chiếm 13,33% ở hai lô gà Ri và Lương Phượng, 16,67% ở lô gà Ross 308. Bên cạnh đó, tỷ lệ gà bị liệt, sệ cánh chỉ chiếm 13,33% ở lô gà Ri và Ross 308, 6,67% ở lô gà Lương Phượng; tỷ lệ gà bị liệt chân chiếm 3,33%; 6,67% và 13,33% tương ứng với giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308 (hình 3.11). Nhìn chung, qua theo dõi biểu hiện tổn thương thần kinh ở gà có các độ tuổi khác nhau cho thấy tỷ lệ xuất hiện và mức độ biểu hiện các triệu chứng như đi loạng choạng, liệt sã cánh, liệt chân tỷ lệ nghịch với tuổi gà, đồng thời giống gà Ross 308 cũng có biểu hiện tổn thương nặng nề hơn so với giống gà Ri và Lương Phượng. Kết quả này một lần nữa cho thấy bên cạnh yếu tố độc lực thì đặc điểm di truyền của các giống gà cũng là yếu tố mấu chốt ảnh hưởng đến mức độ tổn thất do bệnh Marek gây nên. Kanji Hirai (2001) [70] đã cho thấy một đặc điểm nữa của bệnh Marek là xuất hiện những tổn thương ở mắt do sự thâm nhiễm các tế bào u vào màng và con ngươi mắt từ màng tiếp hợp và cơ cận mắt. Những điểm sáng màu trắng xám là tập hợp của các tế bào lympho với tổ chức liên kết làm cho con ngươi mắt gắn liền với niêm mạc mắt dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc của con ngươi. Trong dây thần kinh số 4 (Nervus Ophtalmicus) có nhiều tế bào tăng sinh nhỏ, vừa và lớn là nguyên nhân làm tê liệt chắc năng điều tiết mắt, gây viêm mống mắt và mù. Theo dõi gà thí nghiệm bị gây nhiễm với chủng virus MDV 6.13 chúng tôi nhận thấy rải rác ở các lô gà 1 ngày tuổi xuất hiện các cá thể gà bị mù mắt, chiếm tỷ lệ là 3,33%, 6,67% và 13,33% tương ứng với các giống gà Ri, Lương Phượng, Ross 308; 3,33% số gà thí nghiệm 1 tuần tuổi có biểu hiện viêm mống mắt. 3.2.3. Nghiên cứu sự bài thải của virus từ gà thí nghiệm gây nhiễm virus gây bệnh MDV Theo Aminul (2007) [20] khi nghiên cứu trên giống gà Ross 308 được gây nhiễm với 3 serotype của MDV, bao gồm MDV1, MDV2 và HVT đã phát hiện MDV1 và HVT được bải thải ra không khí chuồng nuôi từ ngày thứ 7 thông qua nang lông còn chủng MDV2 được bài thải ra từ ngày thứ 12 sau khi gây nhiễm. Mức độ bài thải virus tăng rất nhanh đối với chủng MDV1 trong khoảng thời gian từ ngày 7 - ngày 28 sau khi gây nhiễm, đạt khoảng 109 bản copy cho mỗi cá thể gà trong 1 ngày, tỷ lệ bài thải của các chủng trong cùng serotype MDV1 không có sự khác biệt. Trong nghiên cứu này, sự bài thải virus gây bệnh Marek được đánh giá bằng phản ứng Realtime PCR đối với bụi chuồng nuôi của 12 lô gà thí nghiệm. Lượng virus bài thải được xác định bằng số bản copy