Luận án Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

ó ý nghĩa (p<0,05) Hình 4.10. Ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 62 Kết quả cho thấy, khi bổ sung 1% các nguồn carbon khác nhau vào môi trường lên men xốp, hoạt tính của 3 enzyme đều tăng so với khi không bổ sung carbon. Với các nguồn carbon khác nhau, hoạt tính của glucoamylase, α-amylase không có sự sai khác (p > 0,05), còn hoạt tính của cellulase cao nhất với 35,9 (U/g) trên môi trường bổ sung glucose (Bảng 4.9, Hình 4.10). Điều này cho thấy glucose là nguồn carbon bổ sung có ảnh hưởng tích cực đến sản xuất cellulase từ chủng nấm đột biến Aspergillus niger GA15. Theo Alva & cs. (2007) việc sản xuất amylase tối đa đạt được khi sử dụng glucose là nguồn carbon đối với chủng Aspergillus trong lên men xốp và với hoạt tính 12,2 U/mg. Tương tự, Varalakshmi & cs. (2009) cũng báo cáo rằng sản lượng tối đa của amylase đạt được từ Aspergillus spp. JGI 12 khi glucose là chất bổ sung carbon trong môi trường lên men. Như vậy, đối với chủng Aspergillus niger GA15, nguồn carbon thích hợp nhất cho sản sinh đa enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase là glucose, với hoạt tính tương ứng là 46,84; 67,94; 35,9 (U/g). 4.1.5.8. Nguồn Nitơ Nitơ là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Việc lựa chọn nguồn nitơ rẻ tiền và thích hợp cho lên men xốp chủng nấm sợi Aspergillus niger GA15 để sản xuất cao đa enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase là rất cần thiết. Các nguồn nitơ khác nhau (nitơ hữu cơ và vô cơ) đã được lựa chọn để nghiên cứu. Bảng 4.10. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp Nguồn nitơ Hoạt tính enzyme (U/g), n=3 Glucoamylase (Mean ± SE) α-amylase (Mean ± SE) Celullase (Mean ± SE) NH4Cl 48,06 ± 0,31 69,68ab ± 0,44 31,50b ± 1,07 NH4NO3 48,06 ± 1,30 69,68ab ± 1,86 31,34b ± 0,49 (NH4)2SO4 47,39 ± 0,34 68,73b ± 0,48 32,06b ± 1,43 Cao nấm men 49,73 ± 1,73 72,06ab ± 2.48 32,95b ± 1,00 Peptone 47,40 ± 1,64 73,02ab ± 2,34 34,89b ± 0,47 Ure 50,00 ± 0,78 76,75a ± 1,11 40,11a ± 0,73 Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05) Kết quả cho thấy, khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp của chủng nấm sợi Aspergillus niger GA15, hoạt tính của các enzyme tăng 63 so với không bổ sung và sai khác rõ rệt khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp. Hoạt tính của cellulase đạt cao nhất khi bổ sung ure với 40,11 (U/g), các nguồn nitơ khác không thấy sự sai khác về hoạt độ của enzyme này. Hoạt tính của glucoamylase đạt cao nhất là 50 (U/g) khi môi trường lên men xốp có bổ sung thêm ure, tuy nhiên không sai khác đáng kể so với khi bổ sung các nguồn nitơ khác (P>0,05). Hoạt tính của α-amylase tương đương nhau khi bổ sung ure, peptone, cao nấm men, NH4NO3 và NH4Cl (Bảng 4.10, Hình 4.11). Như vậy, có thể lựa chọn ure là nguồn bổ sung nitơ thích hợp nhất vào môi trường lên men xốp cho sự sản sinh của cả 3 loại enzyme glucoamylase, α-amylase và cellulase từ chủng đột biến Aspergillus niger GA15. Hình 4.11. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 Hàm lượng nitơ trong các nguồn nitơ bổ sung là khác nhau, trong đó ure có hàm lượng nitơ cao nhất với 46,67%. Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng, nguồn nitơ đã làm tăng đáng kể năng suất của enzym được tạo ra và nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+, chúng xâm nhập vào tế bào dễ dàng và tạo nên các nhóm amine. Ure là nguồn thức ăn nitơ trung tính về mặt sinh lý, khi bị phân giải bởi enzyme ure nó sẽ giải phóng thành NH3 và CO2. NH3 được vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường như các muối amon. Theo Suganthi & cs. (2011), sự sản sinh enzyme amylase tăng đáng kể khi môi trường lên men xốp được bổ sung amoni nitrat và amoni clorua. Pandey (1999) cho biết việc bổ sung các nguồn nitơ (hữu cơ hoặc vô cơ) đã làm tăng sản lượng enzyme 64 amylse trong lên men xốp các chủng nấm sợi. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng, peptone, natri nitrat và casein thủy phân là những nguồn bổ sung nitơ tốt để sản xuất amylase ở A. fumigatus, A.niger và A. oryzae (Pandey & cs., 1992). Tổng hợp các kết quả trên, có thể xác định điều kiện lên men xốp thích hợp đối với chủng Aspergillus niger GA15 là: cơ chất cám mì, độ ẩm 50%, pH 5,5, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 5 ngày, giống 2 ngày tuổi, nguồn carbon bổ sung là glucose (1%), nguồn nitơ bổ sung là ure (1%), với hoạt tính của α- amylase, glucoamylase và cellulase đạt lần lượt là 76,75; 50 và 40,11 (U/g), hoạt tính này cao gấp 2,8; 1,29 và 3,3 lần so với lên men ở điều kiện chưa tối ưu. 4.2. XỬ LÝ BÃ SẮN THÀNH THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI 4.2.1. Thành phần hóa học của bã sắn tươi Bã thải tinh bột sắn là bã thải xơ để lại sau khi chiết xuất tinh bột từ củ sắn trong quá trình chế biến tinh bột sắn của các nhà máy. Phân tích thành phần hóa học của bã sẵn thu được trong các cơ sở chế biến tinh bột sắn ở Hoài Đức cho thấy: Trong bã thải tinh bột sắn còn chứa nhiều nước nên vật chất khô chỉ chiếm 15,91%. Hàm lượng xơ và tinh bột còn lại tương đối cao, tương ứng 21,02% và 60,37% (tính theo VCK), kết quả này phụ thuộc vào loại sắn, cách chế biến, song phần lớn vì quá trình ép chưa kỹ nên hàm lượng tinh bột còn lại trong bã sắn là tương đối cao. Hàm lượng Protein thô và protein thực thấp, chỉ có 2,19% và 1,23% (theo VCK), KTS, lipit và axit hữu cơ tổng số thấp, tương ứng lần lượt là 2,01%, 0,52 % và 2,02 g/kg. HCN chiếm 9,4 mg/kg bã sắn tươi (Bảng 4.11). Kết quả phân tích này cho thấy, bã sắn tươi còn chứa khá nhiều nước (độ ẩm cao), hàm lượng protein thấp, hàm lượng xơ và tinh bột khá cao. Bảng 4.11. Thành phần hóa học của bã sắn tươi Thành phần (% VCK) Mean (n=3) SE VCK 15,91 0,21 Protein thô 2,19 0,23 Protein thực 1,23 0,15 KTS 2,01 0,32 Lipit 0,52 0,24 Tinh bột 60,37 3,45 Xơ thô 21,01 1,23 Axit hữu cơ (g/kg tươi) 2,02 0,14 HCN (mg/kg tươi) 9,4 0,34 65 Các phân tích khác trên bã sắn cũng cho kết quả tương tự. Trong báo cáo của Nguyễn Hữu Văn & cs. (2008), bã sắn công nghiệp có VCK là 11,2%, protein thô 3,6%, xơ thô 31,2% và có 26,9 mg/kg tươi HCN. Le & cs. (2020) cho biết trong bã sắn có chứa 56% tinh bột và 35,9% xơ. Như vậy, có thể thấy rằng thành phần dinh dưỡng có trong bã sắn là rất thấp, trong khi đó hàm lượng tinh bột, xơ và các chất kháng dinh dưỡng như cyanua, tannin và phytate tương đối cao, do đó khi sử dụng làm thức ăn chăn nuôi khả năng tiêu hóa thấp, lượng thức ăn ăn vào ít và giảm khả năng sản suất của động vật. Lên men đã được xác định là một trong số ít các phương pháp để có thể vừa khử được các chất kháng dinh dưỡng, vừa có khả năng cải thiện chất lượng protein nên đã được một số nước sử dụng để tăng cường giá trị sử dụng của sắn và phụ phẩm sắn cho cả con người và gia súc (Ubalua, 2007; Aro, 2008; Herago & Agonafir, 2017). Đối với bã sắn, hàm lượng xơ và tinh bột cao, các vi sinh vật không thể sử dụng trực tiếp để sinh trưởng và phát triển, chỉ một số ít vi sinh vật như nấm sợi (Aspergillus, Penicillium), nấm men Saccharomyces và vi khuẩn Baccilus có khả năng sinh ra một số enzyme ngoại bào như amylase, cellulase để thủy phân tinh bột và xơ thành đường đơn, song hoạt tính của chúng tương đối thấp (Pandey & cs., 2000; Cherry & Fidantsef, 2003; Singh R. & cs., 2011). Đề tài tiến hành đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng việc bổ sung chế phẩm đa enzyme (α-amylase, gluco-amylase, cellulase), nấm men và vi khuẩn probiotic (Lactobacillus, Bacillus) để đường hóa tinh bột, xơ thành các đường đơn tạo cơ chất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm lên men giàu protein, nhiều vi khuẩn có lợi có thể sử dụng làm thức ăn chất lượng cao cho các động vật dạ dày đơn. 4.2.2. Đường hóa bã sắn Bã thải tinh bột sắn là bã thải xơ để lại sau khi chiết xuất tinh bột từ củ sắn trong quá trình chế biến tinh bột sắn của các nhà máy. Trong bã sắn còn chứa hàm lượng cao của tinh bột và xơ. Nguồn tinh bột và xơ này không thể sử dụng trực tiếp cho quá trình lên men, cần phải qua giai đoạn đường hóa. Quá trình đường hóa là quá trình chuyển hóa hoàn toàn dextrin thành đường khử. Trong cấu trúc của tinh bột, ngoài các liên kết α-1,4 glucoside để tạo nên cấu trúc của amylose, còn có các liên kết α-1,6 glucoside tạo nên phân nhánh amylopectin. Do đó, việc thủy phân hoàn toàn tinh bột cần có enzyme α-amylase và glucoamylase với những tác động đặc trưng riêng biệt. α-amylase được coi là 66 các amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa, chúng cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amylose và amylosepectin thành đường maltose hoặc các dextrin. Tiếp theo đó, enzyme glucoamylase sẽ thủy phân hoàn toàn tinh bột, dextrin, maltose thành glucose, nó được coi là enzyme đường hóa quan trọng nhất. Enzyme cellulase sẽ cắt các liên kết 1,4- β-glycoside trong cellulose thành các oligosaccharides và đường glucose. Việc đường hóa bã sẵn sẽ tạo cơ chất thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật, đặc biệt là các vi sinh vật có lợi để lên men chuyển hóa bã sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho động vật. Đề tài tiến hành đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng việc bổ sung chế phẩm đa enzyme (α-amylase, glucoamylase, cellulase), nấm men và vi khuẩn probiotic (Lactobacillus, Bacillus) để đường hóa tinh bột, xơ thành các đường đơn tạo cơ chất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của các vi sinh vật nhằm tạo ra sản phẩm lên men giàu protein, nhiều vi khuẩn có lợi có thể sử dụng làm thức ăn chất lượng cao cho các động vật dạ dày đơn. Mức độ đường hóa bã sắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: nồng độ enzyme, thời gian ủ và nồng độ cơ chất. Trong điều kiện thí nghiệm cơ chất không đổi, khi tăng nồng độ enzyme thì tốc độ phản ứng sẽ tăng, khi nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất ở mức bão hòa, nếu tăng nồng độ enzyme thì tốc độ phản ứng không thay đổi. Để xác định nồng độ enzyme thích hợp cho đường hóa bã sắn, các nồng độ khác nhau của enzyme (từ 0 đến 10%) được thêm vào bã sắn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau 24 giờ ủ, tiến hành lấy mẫu và xác định hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ thô. Kết quả cho thấy, khi tăng nồng độ enzyme từ 0 đến 8% thì hàm lượng đường khử tăng dần, tương ứng tăng từ 1,29 (g/l) đến 15,05 (g/l). Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme tăng lên tới 10%, thì hàm lượng đường khử không có sự khác biệt so với ở nồng độ enzyme 8%. Khi hàm lượng đường khử tăng thì hàm lượng tinh bột và xơ (cơ chất cho sự xúc tác của enzyme) giảm. Hàm lượng tinh bột còn lại trong bã sắn cao nhất trong các mẫu không có sự bổ sung enzyme với 61,31% (VCK) và giảm dần khi tăng lượng enzyme bổ sung, giảm thấp nhất là khi bổ sung tương ứng 8 và 10% enzyme vào bã sắn, mức độ giảm so với không bổ sung tương ứng 59,11% và 60%. Hàm lượng xơ thô cũng giảm rõ rệt ở các mức bổ sung enzyme khác nhau (P<0,05), giảm thấp nhất khi bổ sung 8 và 10% enzyme, tương ứng với 14,79 và 14,69 % (VCK), tuy nhiên mức độ giảm cao nhất chỉ khoảng 24% so với không bổ sung enzyme (Bảng 4.12 và Hình 4.12). Như vậy, có thể nói enzyme bị bão hòa ở nồng độ 8% hay nói cách khác đây là nồng độ tối ưu cho hoạt động đường hóa bã sắn của enzyme. 67 Bảng 4.12. Hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ của bã sắn ở các nồng độ enzyme khác nhau (n=3) Nồng độ enzyme (%) Chỉ tiêu Hàm lượng đường khử (g/l) (Mean ± SE) Tinh bột (%, VCK) (Mean ± SE) Xơ thô (%, VCK) (Mean ± SE) 0 1,29e ± 0,21 61,31a ± 0,53 19,57a ± 0,25 2 3,53d ± 0,08 53,3b ± 1,35 18,89b ± 0,08 4 5,96c ± 0,27 46,73c ± 1,63 16,92c ± 0,09 6 10,05b ± 0,14 32,85d ± 1,39 16,82c ± 0,13 8 15,05a ± 0,34 25,07e ± 0,33 14,79d ± 0,15 10 15,23a ± 0,37 24,53e ± 0,46 14,69d ± 0.37 Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05) Hình 4.12. Hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ của bã sắn ở các nồng độ enzyme khác nhau Việc bổ sung các enzyme bên ngoài khi lên men các bã thải nông nghiệp là cần thiết để nâng cao chất lượng và hiệu quả của quá trình lên men. Trong các sản phẩm đó, hàm lượng tinh bột và xơ còn lại tương đối cao, hầu như các chủng vi sinh vật sử dụng trong lên men không có hoạt tính phân giải tinh bột và cellulose 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 Nồng độ enzyme, % % V C K Đ ư ờ n g k h ử , g /l Hàm lượng đường khử Tinh bột, % VCK Xơ, % VCK 68 hoặc có hoạt tính thấp. Đường hóa bằng các enzyme của vi sinh vật cũng đã được tiến hành trên nhiều loại phụ phẩm và rác thải nông nghiệp. Vlasenko & cs. (1993) đã tiến hành đường hóa 30 nguyên liệu cellulose bởi cellulase của Penicillium sp. Latif & cs. (1994) đã nghiên cứu đường hóa rơm cỏ Kallar bằng cellulase của một số loài nấm, bao gồm Chaetomium thermophile, Trichoderma resei, Sporotrichum thermophile, Aspergillus fumigatus, Torula thermophila và Humicola grisea. 4.2.3. Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn Thời gian đường hoá có ý nghĩa thực tiễn trong sản xuất, quyết định năng suất, chất lượng dịch đường hoá. Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn được tiến hành với việc sử dụng nồng độ enzyme tối ưu (8%) và tiến hành ủ trong thời gian 12, 24, 36, 48 và 60 giờ. Tốc độ phản ứng của enzyme tăng theo thời gian phản ứng, do enzyme có thời gian tiếp xúc và gắn với cơ chất. Thời gian kết thúc phản ứng được xác định khi tốc độ phản ứng xảy ra chậm hoặc dừng lại, tức là nồng độ sản phẩm tăng ít hoặc không tăng nữa. Bảng 4.13. Hàm lượng đường khử khi đường hóa bã sắn ở thời gian khác nhau Thời gian (giờ) Hàm lượng đường khử (g/l), n = 3 (Mean ± SE) P 0 1.24d ± 0.10 <0,0001 12 7.56c ± 0.12 24 14.41a ± 0.47 36 13.71a ± 0.32 48 11.33b ± 0.16 60 11.11b ± 0.15 Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05) Khi tăng thời gian thủy phân từ 0 đến 24 giờ, hàm lượng đường khử tăng lên đáng kể do enzyme dễ dàng tiếp xúc với cơ chất, hàm lượng đường khử cao nhất đạt được ở 24 giờ là 14,4 g/l. Nếu tiếp tục tăng thời gian thủy phân từ 24 giờ đến 60 giờ thì hàm lượng đường khử tạo thành không những không tăng lên mà còn giảm đi, hàm lượng đường khử ở 36, 48 và 60 giờ tương ứng lần lượt là 13,71; 11,33 và 11,11 (g/l) (Bảng 4.13 và Hình 4.13), sự giảm sút này có thể do sự sử dụng đường của các vi sinh vật có mặt trong bã sắn. Như vậy có thể chọn 24 giờ là thời gian tối ưu cho đường hóa bã sắn. 69 Hình 4.13. Hàm lượng đường khử theo thời gian đường hóa bã sắn bằng enzyme 4.2.4. Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng enzyme và vi sinh vật Lên men vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao giá trị dinh dưỡng của các phụ phẩm công nông nghiệp. Để tránh cho vật nuôi không bị ngộ độc HCN, đồng thời làm tăng giá trị dinh dưỡng của bã sắn, đề tài tiến hành đường hóa và lên men lỏng đồng thời bã sắn bằng cách hòa bã sắn tươi vào nước với tỷ lệ 30%, bổ sung 8% chế phẩm sinh học chứa đa enzyme và 0,5% chế phẩm probiotic cùng nguồn nitơ và thời gian lên men thích hợp. 4.2.4.1. Ảnh hưởng của bổ sung nitơ đến làm giàu protein từ bã sắn Nitơ là nguồn thức ăn không thể thiếu được của vi sinh vật, nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Chúng sẽ sử dụng nitơ cho sự sinh trưởng của mình từ đó làm tăng hàm lượng protein trong sản phẩm lên men. Bã sắn được lên men lỏng với sự bổ sung nitơ bởi (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5%). Sau 48 giờ lên men, tiến hành lấy mẫu bã sắn, xác định hàm lượng protein thô, protein thực. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein thô, protein thực và sự tăng protein thực ở các mẫu bã sắn lên men khi bổ sung nitơ ở các nồng độ khác nhau là khác nhau (P<0.001) (bảng 4.14). Khi nitơ được bổ sung vào môi trường lên men sẽ làm thay đổi pH của cơ chất trong dịch lên men. Trong nghiên cứu này, khi bổ sung (NH4)2SO4 sẽ làm pH của dịch lên men tăng theo sự tăng mức bổ sung bổ sung (NH4)2SO4, pH tăng từ 3,74 khi không bổ sung (NH4)2SO4 lên đến 5,03 khi bổ sung 1,5% (NH4)2SO4, Sự thay đổi pH này không ảnh hưởng đến kết quả vì ở pH 5 vẫn tốt cho sự sinh trưởng của nấm men 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 10 20 30 40 50 60 70 Đ ư ờ n g k h ử , g /l Thời gian, giờ 70 S.cerevisiae. Song nếu bổ sung quá nhiều nitơ thì hoạt động của vi sinh vật có thể bị ức chế do sự tăng cao của pH môi trường (Correia & cs., 2007). (NH4)2SO4 được bổ sung vào dịch lên men đóng vai trò là nguồn nitơ cho sự sinh trưởng của các vi sinh vật có mặt trong dung dịch lên men. Kết quả cho thấy việc bổ sung 1% và 1,5% của (NH4)2SO4 là tốt nhất để làm giàu protein của bã sắn trong lên men lỏng với nấm men S. cerevisiae, Lacobacillus sp. và Bacillus sp.. Lượng protein thực sau lên men tăng 5,25 lần ở cả hai mức bổ sung (NH4)2SO4. Khi bổ sung 1,5% (NH4)2SO4 hàm lượng protein thô cao nhất, với 20,83% (VCK), song hàm lượng protein thực chỉ đạt 6,61% (VCK), tương đương với mức bổ sung 1% (NH4)2SO4. Như vậy, có thể chọn mức bổ sung 1% (NH4)2SO4 là mức bổ sung tối ưu trong lên men làm giàu protein của bã sắn. Bảng 4.14. Hàm lượng Protein của bã sắn sau lên men khi bổ sung (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau (n=3) Hàm lượng protein (%VCK) Nồng độ (NH4)2SO4 P 0% (Mean ± SE) 0,5% (Mean ± SE) 1% (Mean ± SE) 1,5% (Mean ± SE) Protein thô 5,82d ± 0,11 11,79c ± 0,15 15,81b ± 0,11 20,83a ± 0,10 <0,0001 Protein thực 3,71c ± 0,08 6,21b ± 0,11 6,73a ± 0,03 6,61a ± 0,01 <0,0001 Tăng protein thực (PG) 2,34c ± 0,13 4,79b ± 0,07 5,25a ± 0,13 5,27a ± 0,06 <0,0001 Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một hàng ngang khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05) Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra vai trò của nitơ trong quá trình lên men làm giàu protein. Haddadin & cs. (1999) cho biết, khi lên men xốp bã ô lưu, mức protein tăng khi cơ chất được bổ sung 0,5% (NH4)2SO4. Oboh & Akindahunsi (2003) cũng quan sát thấy khi lên men xốp các thành phần của sắn với S.cerevisiae trong môi trường có bổ sung ure, MgSO4 và axit citric thì lượng protein cuối cùng trong sản phẩm tăng gấp đôi ở gari và bột sắn. Aruna & cs. (2017) cho biết, khi tiến hành lên men vỏ khoai mỡ với S.cerevisiae có bổ sung (NH4)2SO4 đã làm tăng đáng kể lượng protein thô, protein thực sau 96 giờ lên men. Protein thô và protein thực tăng lên 15,54 và 13,37%. Ông cho rằng sự gia tăng đáng kể hàm lượng protein thô và protein thực có thể là do nitơ như nguồn dinh dưỡng và ảnh hưởng tích cực đến pH của môi trường lên men. Aruna & cs. (2017) cho biết vỏ khoai mỡ lên men có bổ sung S.cerevisiae (BY4743) có thành phần dinh dưỡng cao hơn so với vỏ khoai mỡ không lên men. Pandey & cs. (2000) cũng báo cáo rằng các sản phẩm lên men có thành phần dinh dưỡng tốt hơn và cải thiện cđược khả năng tiêu hóa của vật nuôi. 71 4.2.4.2. Tối ưu thời gian đường hóa và lên men bã sắn Bã sắn được lên men lỏng với sự bổ sung 8% chế phẩm đa enzyme và vi sinh vật probiotic cùng 1% (NH4)2SO4 trong 96 giờ, sau mỗi 24 giờ tiến hành lấy mẫu phân tích hàm lượng protein thực. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein thực tăng tuyến tính trong suốt 48 giờ đầu lên men, tăng từ 1,37 đến 6,7 % (VCK), sau đó giảm dần, ở 96 giờ lên men lượng protein thực chỉ còn 5,54% (VCK). Lượng protein cao ở 48 giờ chỉ ra khả năng sinh trưởng cao của các vi sinh vật trên cơ chất này (Bảng 4.15 và Hình 4.14) Bảng 4.15. Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau (n=3) Thời gian lên men (giờ) Hàm lượng protein thực (%, VCK) (Mean ± SE) P 0 1,37d ± 0,09 <0,0001 24 3,69c ± 0,17 48 6,73a ± 0,03 72 5,70b ± 0,07 96 5,54b ± 0,05 Ghi chú: Các chữ cái trong cùng một cột khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05) Hình 4.14. Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 120 P ro te in t h ự c (% C V K ) Thời gian lên men (giờ) 72 Trong 24 giờ đầu của quá trình lên men, lượng đường khử giải phóng ra nhiều, chúng được sử dụng nhanh chóng như cơ chất thích hợp cho sự nhân lên bởi nấm men và vi khuẩn. Đặc tính này của chúng cho thấy S.cerevisiae, Lacobacillus và Bacillus có khả năng chuyển hóa một cách có hiệu quả đường như là nguồn carbon của nó để làm giàu protein của bã sắn. Sau 48 giờ lên men, xảy ra quá trình phân hủy protein. John & cs. (2006) cho rằng, ở tất cả các nồng độ cơ chất sử dụng cho lên men, quá trình đường hóa và lên men đồng thời sẽ cho năng suất cao hơn nhiều so với quá trình đường hóa đơn giản hoặc lên men không có sự bổ sung các enzyme bên ngoài. Tiến hành thủy phân bã mía bằng enzyme và sử dụng dịch thủy phân để lên men, nhận thấy hơn 7,5% tinh bột không thể được sử dụng, do có sự ức chế phản hồi do mức đường khử trong dịch thủy phân cao. Yang & cs. (2020) tiến hành thủy phân và lên men đồng thời bột đậu nành với sự tham gia của các chủng vi sinh vật Lactobacillus plantarum, L. casei, Bacillus subtilis, B.licheniformis và Aspergillus oryzae trong 24 giờ và thủy phân bằng alcalase trong 15 phút. Kết quả cho thấy, hàm lượng peptide và axit amin tổng số tăng lên đáng kể ở sản phẩm lên men cuối cùng. 4.2.5. Đánh giá chất lượng của bã sắn sau lên men Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của bã sắn sau lên men ở điều kiện tối ưu cho thấy: Thành phần dinh dưỡng của bã sắn sau lên men lỏng với chế phẩm đa enzyme, vi sinh vật probiotic được cải thiện rõ rệt (p<0,05) (ngoại trừ hàm lượng lipit) so với mẫu bã sắn tươi không lên men (Bảng 4.16). Hàm lượng protein thô và protein thực đạt tương ứng 16,02 và 6,79% (tính theo VCK), tăng 7,3 và 5,5 lần so với bã sắn tươi không lên men. Sự gia tăng hàm lượng protein này là do sự tăng trưởng và tăng sinh của nấm men và vi khuẩn trong việc tạo thành protein đơn bào và một phần do proetin của enzyme bổ sung vào mẫu lên men. Sau lên men, tinh bột và xơ trong bã sắn đều giảm đáng kể, tinh bột giảm từ 60,37 % (VCK) xuống còn 25,15 % (VCK), xơ thô giảm từ 21,01 xuống 15,01 % (VCK), sự giảm này là do sự thủy phân của enzyme trong chế phẩm đa enzyme được bổ sung vào và có thể do hoạt động của các vi sinh vật có khả năng tiết ra một số enzyme ngoại bào, chúng sẽ thủy phân tinh bột và xơ thành các đường đơn làm cơ chất cho sự sinh trưởng và phát triển của mình. Sự gia tăng lượng khoáng tổng số trong bã sắn sau lên men có thể do sự thêm vào của muối amoni sunphat trong môi trường lên men. 73 Bảng 4.16. Thành phần dinh dưỡng và cảm quan của bã sắn lên men và không lên men (n=3) Thành phần Bã sắn không lên men (Mean) Bã sắn lên men (Mean) Vật chất khô (%) 15,91 10,45 Protein thô (%VCK) 2,19b 16,02a Protein thực (%VCK) 1,23b 6,79a Tinh bột (%VCK) 60,37a 25,15b Xơ thô (%VCK) 21,01a 15,01b Lipit (%VCK) 0,52a 0,61a Khoáng tổng số (%VCK) 2,01b 7,38a Axit hữu cơ (g/kg tươi) 2,02b 11,86a HCN (mg/kg tươi) 9,4a 1,4b pH 4,5b 3,7a Aflatoxin B1 - - Cảm quan Màu vàng nhạt, mùi hắc Màu vàng tương đỗ, thơm, chua Ghi chú: Các kết quả được tính theo vật chất khô, riêng axit hữu cơ và HCN tính theo mẫu tươi. Mỗi giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ cái trong cùng một hàng ngang khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa (p<0,05) Ezekiel & cs. (2010) cũng báo cáo sự gia tăng hàm lượng tro của vỏ sắn lên men trong quá trình lên men chìm vỏ sắn với T. viride là do bổ sung amoni sunphat vào môi trường lên men. Oboh & Akindahunsi (2003) cũng đã báo cáo sự gia tăng hàm lượng tro trong các sản phẩm sắn lên men Saccharomyces cerevisiae. Hàm lượng lipit trong bã sắn lên men là 0,61 %, cao hơn không đáng kể so với bã sắn chưa lên men, sự gia tăng hàm lượng chất béo có thể là kết quả của khả năng chuyển hóa sinh học carbohydrate thành chất béo trong quá trình lên men. Hàm lượng axit hữu cơ của bã sắn sau lên men tăng 5,9 lần do hoạt động của các vi sinh vật có mặt trong dung dịch lên men đã sinh ra axit lactic, acetic và ethanol làm giảm pH của hỗn hợp, đồng thời làm cho sản phẩm có mùi thơm, chua. Việc giảm pH sẽ ức chế vi sinh vật gây bệnh phát triển trong sản phẩm lên men. Hơn thế, khi hỗn hợp có pH thấp này nếu sử dụng làm thức ăn cho gia súc sẽ làm giảm pH trong dạ dày của lợn và ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh như Coliforms and Salmonella trong đường tiêu hóa (Missotten & cs., 2015). Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của quá trình lên men bao gồm: các vi sinh vật khởi động, số lượng và chất lượng của cơ chất, các thông số lên men (nhiệt độ, thời g