Luận án Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-Nông nghiệp để thu nhận bioethanol

t độ khác nhau từ 30-800C trong đệm MOPS (100 mM, pH 6,0). 55 2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch Để đánh giá độ bền nhiệt và độ bền pH của acetyl esterase tinh sạch, dịch enzyme (250 µl cho mỗi phản ứng) được ủ ở nhiệt độ 400C và 600C tại pH 5,0 và giá trị pH 3; pH 5 và pH 6 (pH 3,0-6,0 với đệm acetate; pH 6,0-8,0 với đệm phosphate) ở 400C, Xác định hoạt tính sau khoảng thời gian ủ tại 2, 4, 6, và 8 giờ. Hoạt tính còn lại của enzyme acetyl esterase tinh sạch cũng được xác định theo phương pháp ở mục 2.2.4. Sự ổn định pH của feruloyl esterase đã tinh sạch được thử nghiệm trong dung dịch citrate-phosphate (50 mM) ở pH 5.0, 7.0, 8.0 và 10.0 ở 400C. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định enzyme được nghiên cứu ở 400C và 600C trong đệm MOPS (100 mM, pH 6,0). Sau khoảng thời gian ủ tại 2, 4, 6 và 8 giờ các mẫu thử nghiệm được lấy ra và hoạt động feruloyl esterase còn lại được đo như mô tả mục 2.2.4. 2.2.7. Phương pháp hóa sinh 2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng Sản phẩm của phản ứng chuyển hóa là các đường đơn được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC) sử dụng hệ dung môi: n-butanol: aceton: H2O (8:1:2). Thuốc thử là H2SO4 (5-10%) được sử dụng để xác định vết chất đường trên bản mỏng [118]. Chất chuẩn là các đường D-glucose, D-galactose, D-xylose và D-mannose (SigmaAldrich- Mỹ) pha trong nước cất với nồng độ 0,1mg/ml. Mỗi chất được chấm lên một điểm hoặc theo đường được đánh dấu vị trí trên bản sắc kí mỏng TLC để xác định vị trí Rf. 2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao Để xác định thành phần và hàm lượng các đường đơn trong dung dịch chuyển hóa, hỗn hợp phản ứng được ly tâm nhanh ở 12000 v/ph và chuyển sang các ống HPLC thể tích 1,5 mL. Glucose được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng pha động là axít sulfuric 0,01 N. Mẫu và chất chuẩn được chạy ở nhiệt độ cột: 600C, tốc độ pha động 1 ml/phút. Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp 56 nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao. Căn cứ vào thời gian lưu của từng chất và so sánh với chất chuẩn, có thể kết luận về thành phần các chất có trong dung dịch mẫu. Nếu cần có thể xác định bằng cách thêm chuẩn vào mẫu. Để phân tích các đường đơn (glucose, mannose, galactose) sử dụng cột sắc ký ion-exclusion RezexTM (RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) 7.8 mm x 300 mm, Phenomenex), cột này có thể đo đường, axít hữu cơ và cồn, sử dụng đầu dò chỉ số khúc xạ (RI). 2.2.7.3. Xác định peptide bằng phương pháp phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu ESI-MS Kỹ thuật ESI-MS/MS là phương pháp ion hóa mẫu bằng phương pháp phun chùm ion trong dung dịch tạo thành đám sương mù với các giọt nhỏ dễ bay hơi. Cơ chế hoạt động của nguồn ESI khá đơn giản. Dưới áp lực dòng liên tục, đường kính cột bé và hiệu điện thế cao (2500V), peptid sẽ được phun tơi thành các giọt nhỏ đa điện tích ra khỏi đầu kim phun. Kim phun sẽ tạo thành các giọt nhỏ, như đám sương mù (đám mây khí ion), dễ bay hơi, các giọt này chứa peptid và các thành phần dung môi khác. Quá trình bay hơi được thực hiện bởi nhiệt độ hoặc màng chắn khí nitơ làm cho mẫu dễ bay hơi. Kết quả là chỉ còn peptid tích điện và bay vào bộ phận phân tích khối của máy khối phổ liên tục MS/MS. Peptid tồn tại ở dạng ion bởi vì chúng chứa các nhóm chức và điện tích của chúng phụ thuộc vào pH của dung môi. Ở pH trong môi trường là axit (pH 3,5 hoặc thấp hơn) protein/peptid sẽ mang điện tích dương và được phân tách bằng sắc ký nano đa chiều tốt hơn. Do đó, nguồn ESI hay được kết nối trực tiếp với hệ sắc ký lỏng và thường phân tích các peptid ở chế độ ion dương. Hệ ESI-MS/MS có khả năng ion hóa cao, có khả năng kết nối linh động với sắc ký và khối phổ, peptid thường ở trạng thái đa điện tích (+2, +3). Hệ nanoLC-MS/MS có thể phân tách hỗn hợp protein phức tạp với hàng ngàn protein được nhận dạng ion peptid sẽ bị phân mảnh thành các đoạn nhỏ hơn được đo và ghi phổ tại detector. Sau khi điện di, băng protein trên gel SDS-PAGE được chuyển lên màng PVDF và gửi đi phân tích bởi Proteomics International (Broadway, Nedlands, Australia). Protein được thủy phân bằng trypsin và phân tách các peptide theo phương pháp chuẩn của 57 Bringans và công sự (2008). Peptide được phân tích bằng phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) với hệ Agilent 1260 Infinity HPLC [Agilent] kết nối thiết bị phổ khối Agilent 6540 [Agilent]. Đoạn peptide sau thủy phân trypsin được nạp lên cột 18C 300 SB, 5 µm [Agilent] và phân tách với hệ gradient H2O/acetonitrile/0.1% formic axít (v/v). Phổ được phân tích để xác định protein/peptide bằng phần mềm Mascot [MatrixScience] với MSPnr100 database [119]. 2.2.7.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic Nguyên lý Glucose hay đường khử nói chung phản ứng tạo màu với thuốc thử là axit dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường glucose trong một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu ở bước sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính được hàm lượng đường của mẫu nghiên cứu [120]. Hinh 2.3. Phương trình phản ứng giữa đường khử và axít dinitrosalicylic - Pha hóa chất Cân 5g DNS cho vào 300 ml nước cất hòa tan ở 500C, sau đó cho thêm 5ml dung dịch NaOH 4M. Cuối cùng cho thêm 150g muối tartrat kép hòa tan rồi cho vào bình định mức và thêm nước cất đủ 500ml, đựng trong lọ thủy tinh sẫm màu. Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 0.1N với chỉ thị phenolphtalein, nếu hết 5-6ml HCl là được. - Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường Lần lượt hút chính xác 0.2µl các dung dịch chuẩn từ 0,1 – 0,6 mg/ml cho vào các ống eppendorf, sau đó cho vào các ống mỗi ống 0.6µl dung dịch thuốc thử DNS, lập tức lắc đều. Đun các ống eppendorf trong nước sôi 5 phút. Thuốc thử DNS sẽ phản ứng với 58 đường trong quá trình đun nóng cho sản phẩm có màu nâu đỏ đến màu đen đỏ tùy thuộc hàm lượng đường có trong dung dịch. Làm lạnh nhanh và pha loãng 20 lần rồi đem đi đo. - Chuẩn bị mẫu blank: bằng cách hút 0.2µl nước cất và thêm vào 0.6µl dung dịch DNS, tiến hành các bước tiếp theo như các mẫu của thang chuẩn. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là nồng độ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540nm; x = [glucose] (mg/ml) và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel. - Mẫu phân tích: Cũng tiến hành như với thang chuẩn. Hút 0.2µl dung dịch cần xác định hàm lượng glucose cho vào ống nghiệm, cho thêm 0.6µl DNS và lắc đều, đun sôi trong nước 5 phút, làm lạnh. Pha loãng 20 lần, khuấy đều và tiến hành đo. - So màu thang chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 540 nm. Đồ thị đường chuẩn glucose được xây dựng từ mối liên hệ giữa mật độ quang OD với nồng độ glucose tại các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 (mg/ml) (Hình 2.4). Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định được hàm lượng đường khử có trong mẫu nghiên cứu. Hinh 2.4. Đường chuẩn glucose biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ glucose 2.2.7.5. Xử lý nguyên liệu Xử lý bằng NAOH kết hợp “enzyme cocktail”: Bã mía (10%; w/v) được tiền xử lý cơ học sau đó ngâm trong dung dịch NaOH ở các nồng độ khác nhau: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45 và 0,5 M, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 850C trong 2,5 giờ, kết thúc thí nghiệm dung dịch chuyển hóa được làm y = 1,359x + 0,106 R² = 0,997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 M ật đ ộ qu an g (O D ) Nồng độ glucose (mg/ml) Độ hấp thụ (OD) Linear (Độ hấp thụ (OD) ) 59 nguội và điều chỉnh về pH 5 nhằm tạo điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển hóa sinh học bằng “enzyme cocktail”. Hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 400C, sau 48 giờ trong điều kiện có khuấy đảo liên tục (200 vòng/phút). Dịch sau chuyển hóa được bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy mẫu đã thủy phân ở 90oC trong 10 phút để dừng phản ứng chuyển hóa. Cuối cùng, dịch chuyển hóa được lọc bỏ cặn bằng cách lọc và ly tâm rồi xác định tổng hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS để đánh giá hiệu suất chuyển hóa. Xử lý bằng axít H2SO4 kết hợp “enzyme cocktail”: Các bước xử lý bã mía bằng axít H2SO4 được thực hiện giống như với NAOH. Bã mía (10%; w/v) ngâm trong dung dịch axít H2SO4 ở các nồng độ khác nhau: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5 và 0,6%, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 850C trong 2,5 giờ. Sau phản ứng, dung dịch chuyển hóa được làm nguội và điều chỉnh về pH 5 và bổ sung hỗn hợp “enzyme cocktail” theo tỉ lệ tối ưu, hỗn hợp tiếp tục được ủ ở 400C trong 48 giờ. Kết thúc phản ứng tiến hành xác định tổng đường khử trong dung dịch trước và sau khi ủ với hỗn hợp enzyme, từ đó đánh giá hiệu suất chuyển hóa. Xử lý bằng thiết bị gia nhiệt kết hợp “enzyme cocktail”: Nguyên liệu bã mía (10%; w/v) đặt trong bình chứa đưa vào thiết bị gia nhiệt ở 1210C, 1atm, trong 120 phút. Toàn bộ khối nguyên liệu ở nhiệt độ và áp suất cao, khi đó nước thấm trong nguyên liệu sẽ hóa hơi, tăng thể tích độ ngột. Chính điều này tạo lực xé vỡ xơ sợi, làm cho cấu trúc xơ sợi trở nên dễ dàng hơn cho enzyme tấn công. Kết thúc thí nghiệm, dịch chuyển hóa được làm nguội và điều chỉnh về pH 5. Sau đó cũng tiến hành theo các bước trung hòa pH, chuyển hóa sinh học, bất hoạt “enzyme cocktail” và xác định tổng hàm lượng đường khử để đánh giá hiệu suất quá trình chuyển hóa [121]. 2.2.7.6. Xác định hàm lượng bioethanol Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên các phản ứng [122, 123]: 2Cr2O72- + 16H+ + 3C2H5OH 4Cr3+ + 11H2O + 3CH3COOH Cr2O72- + 14 H+ + 6I- 2 Cr3+ + 3I2 + 7H2O 2 S2O32- + I2 S4O62- + 2 I- Về bản chất phương pháp này dựa trên nguyên tắc chuẩn độ oxi hóa khử để tìm nồng độ bioethanol trong dung dịch. Bioethanol bị oxi hóa thành axít acetic bằng phản ứng với một lượng kali dicromat dư thừa trong dung dịch. Lượng dicromat không phản 60 ứng sau đó được xác định bằng cách thêm dung dịch KI, phản ứng oxy hóa xảy ra tạo thành iốt. Sau đó, iốt được chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn natri thiosulfat và các kết quả chuẩn độ được sử dụng để tính hàm lượng bioethanol của dung dịch ban đầu. Chuẩn bị: Dung dịch A – axít Dicromic: Cho 125 ml H2O vào bình dung tích 500 ml, thêm 70 ml H2SO4 đặc, làm lạnh. Sau đó thêm 0,75 g K2Cr2O7 và thêm 250 ml nước cất. Dung dịch B – Hồ tinh bột 1 %; dung dịch C – Na2S2O3 0,03 M; dung dịch D – KI 1,2 M. Chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml có nắp cao su. Cho 10 ml dung dịch A vào bình tam giác đã chuẩn bị, cho 1ml dịch mẫu (pha loãng 10 lần) vào bình, sau đó để tối khoảng 10 phút. Mở nắp cao su, lần lượt cho vào các bình 100 ml nước cất (lắc đều), 1 ml dung dịch D lắc đều và cuối cùng bổ sung 1 ml dung dịch B, thu được dung dịch màu xanh đen. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng dung dịch C. Kết quả thu được thể tích dung dịch C tiêu tốn tại điểm tương đương, dung dịch từ xanh đen chuyển sang mất màu. Mẫu đối chứng: Tiến hành các thao tác như trên với mẫu sử dụng nước cất (1 ml), thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình. Cách tính: Hàm lượng bioethanol thu được tính theo công thức sau: Trong đó: T: Hàm lượng bioethanol (mg/ml) ∆V: Thể tích Na2S2O3 tham gia phản ứng với mẫu V: Thể tích Na2S2O3 đã sử dụng để chuẩn độ dung dịch mẫu Vblank: Thể tích trung bình của 3 lần chuẩn độ với mẫu nước 0,03: Nồng độ ban đầu của Na2S2O3 d: Độ pha loãng 2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose Chuyển hóa các sinh khối giàu lignocellulose được thực hiện với sự có mặt của đơn enzyme (XpoAE, Cell/xyl hoặc AltFAE) và phối hợp với hai enzyme hoặc tất cả các enzyme thủy phân trong nghiên cứu [bao gồm XpoAE (13,1 U/mg) hoặc AltFAE (11,2 U/mg) và carboxymethyl cellulase/glucuronoxylanase (Cell/Xyl, 1-1,6 U/mg); từ T. T = (∆V x 0.03) x 4 x 46 x d ∆V = V - Vblank 61 reesei (AB Enzyme, Darmstadt, CHLB Đức)]. Sinh khối được ủ với các enzyme trong 24 giờ ở 400C và thực hiện trong đệm 100 mM MOPS (pH 5,0-5,5), so sánh với mẫu đối chứng được bất hoạt enzyme bằng cách đun sôi ở 950C trong 30 phút. Sản phẩm chuyển hóa là các đường đơn được phân tích bằng phương pháp DNS để xác định tổng đường khử và phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định thành phần, hàm lượng các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Xúc tác đơn enzyme hoặc hỗn hợp “enzyme cocktail” được nghiên cứu với rong túi (RT), bã cà phê (CFA), bã mía (MIA), rơm (RR) và mùn gỗ (MG) [124]. 2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm Quy hoạch thực nghiệm được thực hiện theo mô tả của Nguyễn Minh Tuyền, là việc chọn số lượng thí nghiệm, các điều kiện tiến hành thí nghiệm cần và đủ để giải quyết nhiệm vụ đặt ra với độ chính xác cần thiết, chọn các phương pháp toán học xử lý kết quả thực nghiệm và thừa nhận kết quả đó. Theo định nghĩa trên, nhờ có vị trí tối ưu của các điểm trong không gian yếu tố và phép biến đổi tuyến tính của tọa độ mà ta có thể khắc phục được những nhược điểm của phương pháp phân tích hồi quy cổ điển (thực nghiệm thụ động, thay đổi lần lượt từng biến số). Kết quả là số lượng thí nghiệm giảm đi đáng kể, thông tin nhận được chính xác hơn, và do đó hiệu quả quá trình thực nghiệm cao hơn (tiết kiệm thời gian, công sức, chi phí cho thí nghiệm). Trong phương pháp này sử dụng hai kế hoạch sau [124,125]: Kế hoạch bậc một 2k: Với k là số yếu tố ảnh hưởng (ví dụ: nhiệt độ, áp suất, thời gian, nồng độ,) và mỗi yếu tố Zj (j = k,1 ) thay đổi trong khoảng 2 mốc từ Z minj đến Z max j thì số thí nghiệm cần phải tiến hành là: N = 2k (1) Với mỗi yếu tố ta có mức cơ bản: Z o j = 2 minmax jj ZZ  (2) Và khoảng biến thiên:  jZ 2 minmax jj ZZ  (3) Điểm với tọa độ là ( okoo ZZZ ,...,, 21 ) gọi là tâm kế họach. Bằng phép biến đổi tuyến tính ta có thể chuyển từ hệ tọa độ Z1, Z2,Zk về hệ tọa độ vô thứ nguyên của x1 , x2 ,xk 62 Xj = j o jj Z ZZ   với j = 1,2,3k (4) Dễ dàng nhận thấy xj sẽ nhận các giá trị -1, 0, +1 ứng với maxmin ,, j o jj ZZZ . Ma trận kế hoạch thực nghiệm có tính chất trực giao nên việc xử lý số liệu thực nghiệm tìm mô hình hồi quy dạng: y = bo+   k j 1 bj xj +   k ju 1, bujxuxj u  j (5) Trở nên dễ dàng bằng cách nhân các cột của ma trận X với vectơ kết quả Y (y1, y2, y3,y8), sau đó tiến hành phân tích thống kê mô hình nhận được (5) gồm: kiểm định ý nghĩa của hệ số và tính tương hợp của mô hình với thực nghiệm theo các tiêu chuẩn t – Student và F (Fisher) mà ta sẽ nói rõ hơn ở phần mô hình bậc 2. Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson: Khi mô hình bậc 1 không phù hợp với thực nghiệm, người ta tiến hành những thí nghiệm bổ sung tiến về vùng tối ưu (gần dừng) hoặc trên cơ sở phân tích số liệu mà tiến hành kế hoạch trực giao bậc 2 Box – Wilson. Phương trình hồi quy trong trường hợp này có dạng: y = bo+   k j 1 bj xj +   k ju 1, bujxuxj +   k j 1 bjj x 2j (1) u  j Trong đó: bo – thành phần tự do bj – các hiệu ứng tuyến tính buj– các hiệu ứng tương tác đôi bjj – các hiệu ứng bình phương Để có được mô hình (1) phải tiến hành kế hoạch thực nghiệm với số thí nghiệm: N = 2k + 2k + no Trong đó: no – số thí nghiệm ở tâm kế hoạch 2k – các điểm sao (thí nghiệm thiến hành ở mức ∝ là cánh tay đón sao). Giá trị của ∝ phụ thuộc vào k và no. Tính tương hợp của mô hình sau đó được kiểm định theo tiêu chuẩn Fisher bằng cách tính: 2 2 s th t sF s  63 Phương tình hồi quy tương hợp nếu F <Fp(f1f2), trong đó Fp(f1f2) là giá trị tra bảng ở p = 0.05, f1 = N – l là số bậc tự do của phương sai tương hợp , f2 là số bậc tự do của phương sai tái sinh. Sau khi nhận được phương trình hồi quy tương hợp với thực nghiệm có thể tiến hành tìm điều kiện tối ưu cụ thể: max [ y = f(x1x2x3)] Với điều kiện ràng buộc 1.215 1.215jx   , j = 1, 2, 3 bằng một chương trình tối ưu hóa của quy hoạch phi tuyến. 2.2.10. Xử lý số liệu Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê, sử dụng một số phần mềm như: Microsoft Excel, Mascot (xác định trình tự peptipe), Treview (xác định cây phân loại), Bioedit, Clustal W, GeneDoc 2.7 (xác định trình tự nucleotide ITS) Kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm, 2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm Sơ đồ xác định các thông số thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm trong chuyển hóa bã mía. 64 Hình 2.5. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm Bất hoạt enzyme Lọc, ly tâm loại cặn Thu nhận đường đơn Nghiền nhỏ đến kích thước 0,5 – 1 mm Điều chỉnh pH: 4,5; 5,0; 5,5 Ủ mẫu ở nhiệt độ (0C): 35; 37; 40; 42,5; 45 Thời gian (giờ): 24; 36; 48; 60, , 81 Bổ sung “enzyme cocktail” với hoạt độ (U) khác nhau Bã mía (DS) (10% w/v) Xác định pH thích hợp Xác định nhiệt độ thích hợp Xác định thời gian thích hợp Sử dụng quy hoạch thực nghiệm tối ưu hỗn hợp “enzyme cocktail” 65 Các bước tiến hành sử dụng quy hoạch thực nghiệm tối ưu hỗn hợp “enzyme cocktail”: Quá trình thủy phân nguyên liệu giàu liglocellulose thành các đường lên men sử dụng đơn enzyme thủy phân (AltFAE, XpoAE và Cell/Xyl) hoặc đa enzyme hay “enzyme cocktail” với các yếu tố ảnh hưởng: thời gian (h), nhiệt độ phản ứng (0C), pH, lượng cơ chất (%) và hoạt tính enzyme (U). Thông số tối ưu hóa được tổng hợp bằng hàm lượng đường khử Y (mg/g cơ chất khô). Bằng cách khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa để tìm hiệu suất tối ưu (y) thông qua các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp “enzyme cocktail”. Do vậy, mục đích chính của quy hoạch thực nghiệm nhằm tìm ra các giá trị tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian) và hoạt độ enzyme (U) của từng enzyme trong hỗn hợp “enzyme cocktail” trong cùng một phản ứng. Bằng việc bố trí các thí nghiệm với lượng cơ chất thay đổi 0,4 - 0,8 gram (tương đương 8% đến 16%) và sự thay đổi thể tích tương ứng hoạt độ enzyme (U) của mỗi enzyme trong hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl: 0,45 ml – 1 ml; AltFAE: 0,12 - 0,7 ml; XpoAE: 0,14 – 0,6 ml). Đồng thời cũng thay đổi các điều kiện như nhiệt độ (35 – 450C), pH (4,5 – 5,5) và thời gian (24 – 72 giờ) trong phản ứng. Kết quả phân tích hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS được tính bằng trung bình của 3 lần thí nghiệm độc lập. Sau khi sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa các điều kiện của “enzyme cocktail” cho quá trình thuỷ phân bã mía thành các đường lên men. Bước tiếp theo, bã mía được tiền xử lý hóa học bằng axít H2SO4, NAOH và thiết bị gia nhiệt, kết hợp với chuyển hóa sinh học bằng “enzyme cocktail” nhằm nâng cao hiệu suất chuyển hóa thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. 66 2.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” Hinh 2.6. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” Nghiền nhỏ kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm Xử lý bằng: (H2SO4/NAOH/Gia nhiệt) Điều chỉnh pH 5.0 Thủy phân: “enzyme cocktail” H2SO4/NAOH: 850C, 2.5 giờ; Gia nhiệt: 1atm, 2 giờ Bất hoạt enzyme cocktail Ly tâm loại bã Enzyme cocktail: (Cell/Xyl:100 -160 U/gds; AltFAE:7.56 U/gds; XpoAE:10.8 U/gds); 400C; pH: 5.0; 48 giờ ủ Thu nhận các đường đơn Bã mía (DS) (10% w/v) 67 Các bước tiến hành: Xử lý cơ học: Bã mía sau thu hoạch được xử lý cơ học bằng cách xấy khô, nghiền nhỏ bằng hệ thống nghiền bi (thiết bị Fritsch, Oberstein, CHLB Đức) và lọc qua rây để đạt được kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm. Mẫu sau xử lý tiến hành trên ba thí nghiệm độc lập bằng axit H2SO4, NaOH và thiết bị gia nhiệt nhằm tìm ra phương pháp thích hợp để tiếp tục chuyển hóa sinh học bằng “enzyme cocktail”. Xử lý bằng axit H2SO4/NAOH/Gia nhiệt: Bã mía được xử lý bằng dung dịch NaOH ở nồng độ: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5 M và axít H2SO4 ở nồng độ: 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5, 0,6%. Sau đó, hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ 850C trong 2,5 giờ. Bã mía được làm ẩm (60%) đưa vào thiệt bị gia nhiệt ở 1210C, áp suất 1atm, trong 120 phút. Toàn bộ khối nguyên liệu ở nhiệt độ và áp suất cao, nước thấm trong nguyên liệu sẽ hóa hơi, tăng thể tích độ ngột. Chính điều này tạo lực xé vỡ xơ sợi, làm cho cấu trúc xơ sợi trở nên dễ dàng hơn cho enzyme tấn công. Xử lý bằng hỗn hợp “enzyme cocktail”: Toàn bộ dịch chuyển hóa sau khi xử lý theo phương pháp hóa lý được làm nguội và điều chỉnh về pH 5 nhằm tạo điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển hóa sinh học bằng enzyme. Hỗn hợp “enzyme cocktail” được sử dụng là Cell/Xyl = 100 U/gds, AltFAE = 7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds. Quá trình chuyển hóa sinh học diễn ra ở 400C, pH 5, thời gian chuyển hóa 48 giờ trong điều kiện có khuấy đảo liên tục (200 vòng/phút). Sau đó dịch chuyển hóa được bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy mẫu đã thủy phân ở 90oC trong 10 phút để dừng phản ứng. Cuối cùng, toàn bộ dịch chuyển hóa được lọc bỏ cặn bằng cách lọc và ly tâm rồi đem đi xác định tổng hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS để đánh giá hiệu suất chuyển hóa. 68 2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa Hình 2.7. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa Bổ sung thành phần dinh dưỡng Điều chỉnh pH 5.2 Khử trùng 1210C, 1atm, 20 phút Lên men bioethanol Chưng cất Điều kiện lên men: 280C; pH 5.2; 78 giờ; 5% nấm men Thu nhận bioethanol Nguồn dinh dưỡng Peptone: 10 (g/l); KH2PO4: 3(g/l); MgSO4.7H2O: 3(g/l) Dịch đường thủy phân 69 Các bước tiến hành: Bổ sung thành phần dinh dưỡng: Dịch đường sau chuyển hóa từ bã mía được bổ sung thêm một số thành phần dinh dưỡng trong môi trường hanxen. Điều chỉnh pH: Công đoạn này nhằm mục đích đưa pH trong môi trường lên men về giá trị thích hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 sinh trưởng và phát triển tăng sinh khối. Lên men bioethanol: Tiến hành lên men bioethanol dưới các điều kiện thích hợp đã được nghiên cứu (tỷ lệ nấm men, thời gian, pH và nhiệt độ). Chưng cất thu nhận bioethanol: Sau khi kết thúc quá trình lên men, dung dịch thu được đem đi chưng cất phân đoạn để làm tăng độ tinh khiết của bioethanol tạo thành bằng thiết bị cô quay chân không với số vòng quay 30 vòng/phút, nhiệt độ 500C, áp suất <100 mbar trong 30 phút. Đồng thời xác định hàm lượng đường khử còn lại trong dung dịch để đánh giá hiệu suất lên men. Dung dịch bioethanol thu được sau chưng cất được bảo quản trong bình kín, thoáng gió, tránh ánh sáng và các nguồn nhiệt. 70 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và sàng lọc nấm Từ các mẫu nấm thu từ rừng Quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) đã phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ và định tên khoa học đến loài. Các taxon nấm phân lập được: 3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr. consors, Tr. gibbosa, Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G. applanatum, Ganoderma sp. Họ Coriolaceae: Poria versipora Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates Họ Mycenaceae: Mycena galericulata Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca 3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X. carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp. (CP564), Nodulisporium sp. (CP582). Họ Helotiaceae: Bisporella citrine Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66) Họ Bionectriaceae: Bionectria sp. (CP587) Kết quả phân loại bằng sinh học phân tử của một số chủng nấm nghiên cứu được miêu tả trong phần Phụ lục. 3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm Sự sinh tổng hợp feruloyl esterase của 44 chủng nấm lựa chọn được đánh giá qua khả năng phân giải cơ chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) trên đĩa thạch. 71 Bên cạnh đó, dịch lên men của 44 chủng nấm được ly tâm để loại bỏ sinh khối cũng và các thành phần tạp cho xác định hoạt tính acetyl esterase (AE) qua khả năng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl acetate. Bảng 3.1 thể hiện kết quả đánh giá hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm. Bảng 3.1. Hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm STT Tên chủng Hoạt tính feruloyl esterase trên đĩa thạch (đường kính vòng phân giải - mm)(*) Hoạt độ enzyme acetyl esterase (U/L)(*) Nấm đảm (Basidiomycota) 1 Trametes consors G1