Luận án Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces Cavourensis YBQ59 - Vũ Thị Hạnh Nguyên

LỜI CẢM ƠN. i

LỜI CAM ĐOAN . ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT. xi

MỞ ĐẦU . 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 4

1.1. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu. 4

1.1.1. Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh. 4

1.1.2. Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật . 6

1.1.3. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược . 7

1.1.4. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu . 9

1.2. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu . 11

1.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật. 11

1.2.2. Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh. 12

1.2.3. Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ

cấp . 15

1.3. Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu

về loài Streptomyces cavourensis . 17

1.3.1. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu . 17

1.3.2. Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp kháng sinh của xạ

khuẩn. 19

1.3.3. Nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh . 24

1.3.4. Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn . 26

1.3.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh . 27iv

1.3.6. Một số nghiên cứu về xạ khuẩn Streptomyces cavourensis. 30

1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tại Việt Nam và tiềm năng

khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl). 31

1.4.1. Tình hình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam . 31

1.4.2. Đặc điểm của cây quế (Cinnamomum sp.). 33

1.4.3. Tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum sp.). 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 37

2.1. Vật liệu nghiên cứu . 37

2.1.1. Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật và các dòng tế bào ung thư. 37

2.1.2. Hóa chất và thiết bị . 37

2.1.3. Môi trường nuôi cấy. 38

2.2. Phương pháp nghiên cứu . 38

2.2.1. Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu quế. 38

2.2.2. Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh . 40

2.2.3. Phân loại các chủng xạ khuẩn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA. 42

2.2.4. Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn. 43

2.2.5. Tách chiết, giải trình tự và phân tích hệ gen của chủng xạ khuẩn YBQ59 . 44

2.2.6. Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn. 46

2.2.7. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các chất kháng khuẩn của chủng

xạ khuẩn . 47

2.2.8. Xử lý thống kê. 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. 48

3.1. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây

quế (C. cassia Presl) . 48

3.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl). 48v

3.2.1. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) . 49

3.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh . 55

3.2.3. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh. 57

3.2.4. Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và

nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng

sinh . 61

3.2.5. Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. 62

3.3. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của

chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 . 63

3.3.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59. 64

3.3.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh

của chủng S. cavourensis YBQ59. 67

3.3.3. Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis

YBQ59 . 70

3.3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh kháng sinh. 71

3.3.5. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.

cavourensis YBQ59 . 73

3.3.6. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S.

cavourensis YBQ59 . 75

3.3.7. Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. cavourensis

YBQ59 . 76

3.4. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S.

cavourensis YBQ59 . 78

3.3.1. Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp. 78

3.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S. cavourensis

YBQ59 . 83

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ. 86vi

4.1. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây

quế (C. cassia Presl) . 86

4.1.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl). 86

4.1.2. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh. 89

4.1.3. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh . 92

4.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của

chủng S. cavourensis YBQ59 . 93

4.2.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59. 93

4.2.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh

của chủng S. cavourensis YBQ59. 94

4.2.3. Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh của chủng S.

cavourensis YBQ59 . 96

4.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S.

cavourensis YBQ59 . 102

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 114

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ . 116

LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI . 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 125

pdf228 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 403 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces Cavourensis YBQ59 - Vũ Thị Hạnh Nguyên, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
2,0; 9,0 Hz, H-6); 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′); 8,06 (1H, d, J = 9,0 Hz , H-5); 8,11 (1H, s, H-2). Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 154,6 (C-2); 124,8 (C-3); 178,1 (C-4); 116,6 (C-4a); 128,5 (C- 5); 116,4(C-6); 164,7 (C-7); 103,2 (C-8); 157,9 (C-8a); 126,0 (C-1′); 117,5 (C-2′); 146,1(C-3′); 146,6 (C-4′); 116,3 (C-5′); 121,7 (C-6′). ESI-MS (pos): m/z 271 [M+Ha]+. • Hợp chất 5,11-epoxy-10-cadinanol - M2B3.8 (6) Hợp chất M2B3.8 là một dạng chất rắn không màu, [α]D24 = +7,7 (c=0,1; MeOH) (Bảng 3.8; Phụ lục 15). Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,93 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-15); 1,08 (3H, s, H-13); 1,18 (3H, s, H-14); 1,24 (1H, m, Hb-2); 1,29 83 (1H, m, Hb-8); 1,31 (1H, m, H-6); 1,33 (3H, s, H-12); 1,38 (1H, m, H-1); 1.49 (1H, m, H-7); 1,52 (1H, m, Hb-3); 1,56 (1H, m, Hb-9); 1,59 (H, m, Ha-2); 1,65 (1H, m, Ha-8); 1,72 (1H, m, Ha-3); 1,80 (1H, m, Ha-9); 2,17 (1H, m, H-4); 3,49 (1H, dd, J = 5,0; 10,0 Hz, H-5). Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 49,8 (C-1); 20,0 (C-2); 31,2 (C-3); 32,0 (C-4); 83,3 (C-5); 44,4 (C-6); 53,9 (C-7); 24,5 (C-8); 43,9 (C-9); 73,4 (C-10); 83,7 (C-11); 29,1 (C-12); 24,8 (C-13); 21,4 (10-CH3); 10,9 (4-CH3). ESI-MS (pos): m/z 261,1 [M+Na]+. • Hợp chất prelactone B - M2B4.3 (7) Hợp chất M2B4.3 là dạng chất rắn không màu, [α]D24 = +2,5 (c=0,1; MeOH) (Bảng 3.8; Phụ lục 16). Phổ 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 0,95 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-8); 1,08 (1H, d, J = 6,5 Hz, 5-CH3); 1,11 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-9); 1,72 (1H, m, H-5); 2,03 (1H, m, H-7); 2,42 (1H, dd, J = 7,0, 17,0 Hz, Hb-3); 2,94 (1H, dd, J = 5,5, 17,0 Hz, Ha-3); 3,75 (1H, m, H-4); 3,89 (1H, dd, J = 3,0; 10,0 Hz, H-6). Phổ 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 174,4 (C-2); 39,5 (C-3); 70,4 (C-4); 40,2 (C-5); 87,7 (C-6); 29,9 (C-7); 14,4 (C-8); 20,4 (C-9); 14,0 (5-CH3). ESI-MS (neg): m/z 170,9 [M-H]-. • Hợp chất daucosterol - M2B6.17 (8) Hợp chất M2B6.17 có dạng bột màu trắng (Bảng 3.8; Phụ lục 17). Phổ 1H NMR (DMSO-d6):δH 0,66 (3H, s, H-18); 0,81 (6H, d, J = 7,2 Hz, H-26, H-27); 0,86 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J = 7,2 Hz, H-21); 0,98 (3H, s, H-19); 3,21 (3H, m, H-2′, H-4′, H-5′); 3,55 (1H, m, H-3); 4,19 (1H, dd, J = 11,5; 6,0 Hz; Ha-6′); 4,42 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-6′); 4,87 (1H, d, J = 7,8 Hz; H-1′); 5,3 (1H, m, H-6). 3.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S. cavourensis YBQ59 • Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Hợp chất daucosterol khá phổ biến trong tự nhiên và đồng thời không thể hiện tác dụng gây kháng khuẩn và độc tế bào theo các công bố trước đây. Do đó hợp chất này không được thử tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế trong nghiên cứu này. Hợp chất daucosterol (8) có thể được tách chiết từ thành phần môi trường lên men xạ khuẩn hoặc từ dịch lên men của chủng xạ khuẩn YBQ59. 84 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất tinh sạch từ chủng S. cavourensis YBQ59 Các hợp chất tinh sạch Giá trị MIC50 (µg/ml) MRSA MRSE 1-Monolinolein (1) 8,5e ± 0,02 14,7e ± 0,05 Bafilomycin D (2) 11,2d,e ± 0,04 30,3c ± 0,08 Nonactic acid (3) 18,6c ± 0,03 23,9d ± 0,07 Daidzein (4) 24,8b ± 0,01 35,2b ± 0,04 3′-Hydroxydaidzein (5) 36,1a ± 0,08 54,2a ± 0,11 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) 0f 0g Prelactone B (7) 0f 0g Azithromycin (đối chứng dương) 13,3d ± 0,12 11,7f ± 0,21 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê theo đánh giá của Fisher (p <0,05). Do vậy, muốn xác định hợp chất 8 từ nguồn nào thì cần phải có thêm thí nghiệm tách chiết chất từ thành phần lên men xạ khuẩn có hợp chất này hay là được sinh tổng hợp từ dịch lên men. Các hợp chất 1-7 được đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn trên chủng MRSE và MRSA bằng phương pháp MIC50 và kháng sinh azithromycin được sử dụng làm đối chứng dương. Kết quả thể hiện trong Bảng 3.9 trong số các hợp chất tinh sạch từ dịch lên men chủng S. cavourensis YBQ59 được kiểm tra, 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7) không có hoạt tính kháng 2 chủng vi khuẩn kháng kháng sinh MRSA và MRSE. Các hợp chất 1-5 thể hiện khả năng kháng cả MRSA và MRSE, trong đó hợp chất 1-monolinolein (1) tác động mạnh đến hai chủng gây bệnh MRSA, MRSE với giá trị MIC50 lần lượt là 8,5 µg/ml, cao hơn so với nồng độ ức chế tối thiểu của azithromycin (13,33 µg/ml) và 14,7 µg/ml, thấp hơn so với azithromycin (11,7 µg/ml). Bafilomycin D (2) chỉ thể hiện khả năng kháng lại MRSA mạnh với giá trị MIC50 đạt 11,2 µg/ml. Các chất còn lại, 3’-hydroxydaidzein (5), daidzein (4), nonactic acid (3) đều có khả năng kháng khuẩn nhưng không cao. 85 • Hoạt tính gây độc tế bào ung thư Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 1-7 đối với ung thư phổi A549, dòng tế bào ung thư gan Hep3B và vú MCF7 đã được đánh giá bằng phương pháp MTT (Bảng 3.10). Hợp chất 1-monolinolein (1), bafilomycin D (2) và 3'- hydroxydaidzein (5) có hoạt tính ức chế với dòng tế bào ung thư thử nghiệm A549 với giá trị lần lượt là IC50 là 3,6; 6,7; 7,8 μM. Hoạt tính này có ý nghĩa so với tác nhân chống ung thư là camptothecin. Hai hợp chất 5,11-epoxy-10-cadinanol (6) và prelactone B (7) chỉ ức chế dòng tế bào ung thư A549. Hợp chất nonactic acid (3) hoàn toàn không có tác dụng trên dòng A549 khi thử nghiệm. Trên 2 dòng MCF7 và Hep3B chỉ có hợp chất bafilomycin D (2) và 1-monolinolein (1) là có tác dụng trung bình với giá trị IC50 trong khoảng 15,6-24,7 μM. Trái ngược với kết quả kháng khuẩn, hợp chất 3 không có hoạt tính ức chế cả hai tế bào ung thư MCF7 và Hep3B. Bảng 3.10. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ chủng S. cavourensis YBQ59 (IC50, μM) STT Ký hiệu Phân đoạn Hợp chất tinh sạch Giá trị IC50 (µM) A549 MCF7 Hep3B Đối chứng 100,0b ± 2,83 100,0a ± 2,85 100,0a ± 2,36 1 M2B5.1 1-Monolinolein (1) 3,6b ± 1,05 19,4c ± 2,16 24,7b ± 1,35 2 M2B5.0 Bafilomycin D (2) 6,7b ± 0,31 18,5d ± 1,33 15,6c ± 0,71 3 M2B9.8 Nonactic acid (3) >100a >100a >100a 4 M2B8.3 Daidzein (4) 30,8b ± 1,91 >100a >100a 5 M2B7.5 3′-Hydroxydaidzein (5) 7,8b ± 1,23 >100a >100a 6 M2B3.8 5,11-Epoxy-10- cadinanol (6) 65,1a ± 2,12 >100a >100a 7 M2B4.3 Prelactone B (7) 15,6b ± 1,02 >100a >100a Camtothecin (Đối chứng dương 2,4b ± 0,56 36,1b ± 2,94 18,3c ± 2,32 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê theo đánh giá của Fisher (p <0,05). 86 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) 4.1.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) Nghiên cứu sự đa dạng XKNS trên cây quế có tuổi >10 năm từ ba khu vực Tây Bắc, Việt Nam cho thấy, số lượng XKNS nhiều nhất được phân lập từ Hòa Bình (111 chủng, 37,3%), sau đó là Yên Bái (105 chủng, 35,4%) và Lai Châu (81 chủng, 27,3%) (Hình 3.1, Phụ lục 5). Điều này chứng tỏ tính đa dạng XKNS có mối liên quan giữa mùa lấy mẫu và số lượng xạ khuẩn phân lập được. Trong khuôn khổ luận án, các mẫu cây quế thu thập ở Hòa Bình vào mùa đông (mùa khô) cho số lượng chủng xạ khuẩn cao nhất, còn mẫu ở Yên Bái và Lai Châu, vào mùa xuân cho số lượng thấp hơn. Kết quả này cho thấy. số lượng XKNS phân lập từ thực vật tại các vị trí địa lý và thời điểm lấy mẫu khác nhau là không giống nhau. Senanayake và Wijesekera (2003) cho rằng trên cùng một loài nhưng thành phần tinh dầu quế thu được từ các bộ phận là khác nhau và thay đổi theo mùa thu hoạch và từng vùng địa lý. Điều này theo đó có thể ảnh hưởng tới đa dạng VSV nội sinh trong các mẫu thực vật thu thập tại các thời điểm khác nhau. Trên thế giới, sự đa dạng của XKNS được thay đổi tùy theo khu vực địa lý, loài thực vật, mô thực vật và môi trường phân lập (Qin và cs., 2009; Janso và Carter, 2010; Kaewkla và Franco, 2013; Gohain và cs., 2015; Salam và cs., 2017). Các nghiên cứu của Salam và cs. (2017) đã công bố sự đa dạng của XKNS trên cây long huyết là khác nhau ở 4 tỉnh khác nhau của Trung Quốc và Việt Nam; tiếp theo Qin và cs. (2009) phân lập được 2174 chủng XKNS từ gần 90 cây trong rừng mưa nhiệt đới ở Xishuangbanna của Trung Quốc (khoảng 24 chủng/cây), trong khi đó Janso và Carter (2010) chỉ phân lập được 123 chủng vi khuẩn từ 113 loài thực vật rừng nhiệt đới ven biển ở Papua New Guinea và Mborokua Quần đảo (1 chủng/cây); Li và cs. (2012) đã phân lập được 228 chủng XKNS từ cây thanh hao 87 hoa vàng (Artemisia annua); Passari và cs. (2015) phân lập được 42 chủng XKNS từ 7 mẫu cây dược liệu tại Ấn Độ. Gần đây, Saini và cs. (2016) phân lập được 50 chủng XKNS từ cây trâm vối (Syzygium cumini) vùng Ludhiana, Ấn Độ. Điều này cho thấy, từ các mẫu cây quế trong luận án số lượng XKNS phân lập được là tương đối cao so với các nghiên cứu được công bố thế giới. Nghiên cứu sự phân bố của XKNS liên quan các mô thực vật khác nhau cho thấy, số lượng XKNS phân lập từ cây quế cao nhất thu được từ thân (45,5%), tiếp theo là rễ (34,0%) và lá (20,5%) (Hình 3.2A, B). Kết quả này khác so với các nghiên cứu khác về XKNS chủ yếu được phân lập từ rễ, tiếp theo là thân và lá (Kaewkla và Franco, 2013; Gohain và cs., 2015). Ví dụ, ở Ấn Độ đã phân lập được 76 chủng vi khuẩn nội sinh, trong đó 54% từ rễ, 29% từ thân và 17% từ lá (Kaewkla và Franco, 2013; Gohain và cs., 2015); tương tự, ở Trung Quốc đã phân lập được 560 chủng từ 26 cây thuốc, trong đó hầu hết từ rễ (58,2%), tiếp theo là thân (27,8%) và lá (14%) (Zhao và cs., 2011). Taechowisan và cs. (2003) đã sàng lọc 5.400 mẫu rễ, thân, lá từ 36 loài thực vật và phân lập được 212 chủng từ rễ, 97 chủng từ lá, và 21 chủng từ thân. Tỷ lệ XKNS phân lập được nhiều nhất từ rễ có thể được lý giải do rễ đóng một vai trò quan trọng trong việc hấp thụ nước và chất dinh dưỡng cho cây trồng và XKNS xâm nhiễm vào cây khi lớp biểu bì bị nứt do rễ phụ mọc ra từ rễ chính (Sardi và cs., 1992). Theo Shirling và Gottlieb (1966) các môi trường của ISP là môi trường phát triển tốt nhất cho các chủng xạ khuẩn, tuy nhiên, trong nghiên cứu này, số lượng chủng phân lập từ môi trường ISP5 chỉ đạt 4% trên tổng số XKNS, thấp hơn so với các môi trường còn lại. Điều này phù hợp với nhận định của một số nghiên cứu trước đây, cho rằng thành phần môi trường là một yếu tố quan trọng quyết định đến kết quả phân lập và phát hiện các loài mới (Li và cs., 2012; Kaewkla và Franco, 2013). Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng chi Streptomyces luôn chiếm tỷ lệ cao (>50%) trong tổng số XKNS phân lập, do vậy, việc thay đổi thành phần môi trường để tìm ra các loài mới và hiếm không thuộc chi Streptomyces là cần thiết, xu hướng này ngày càng trở nên phổ biến (Qin và cs., 2009; Li và cs., 2012; Kaewkla và 88 Franco, 2013). Qin và cs. (2009) sử dụng 11 môi trường khác nhau trong đó có HV, ISP5, TWYE để phân lập XKNS từ cây dược liệu ở Trung Quốc, kết quả cho thấy hầu hết các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các môi trường đơn giản như HV và TWYE, các môi trường còn lại không thích hợp do nồng độ các chất dinh dưỡng cao tạo điều kiện cho các vi khuẩn nội sinh phát triển. Coombs và Franco (2003) cũng cho rằng, các môi trường nghèo như HV, TWYE và YECD (yeast extract- casein hydrolysate agar) là hiệu quả nhất để phân lập các XKNS từ cây lúa mì (Triticum aestivum L.). Waheeda và Shyam (2017) khi phân lập XKNS trên 3 cây dược liệu Ocimum basillicum, Withania somnifera và Rauvolfi tetraphylla cho thấy, môi trường SCA (starch casein agar) cho số lượng XKNS cao nhất và YEMA (yeast extract malt extract agar) là ít nhất, kết quả này trái ngược với một số nghiên cứu trước đây khi sử dụng 2 loại môi trường này để phân lập các chủng VSV nội sinh trên một số cây dược liệu khác (Zin và cs., 2007). Trong nghiên cứu này nhấn mạnh rằng việc sử dụng nhiều môi trường phân lập là điều cần thiết để tăng số lượng XKNS, đặc biệt là có thể phân lập các chủng mới và/hoặc các chủng XKNS hiếm (Hình 3.3). Số lượng XKNS phân lập trên cả 3 khu vực có màu sắc hệ khuẩn ty thuộc 6/7 nhóm màu xuất hiện với tỷ lệ khác nhau. Trong đó, tỷ lệ các chủng XKNS phân lập thuộc nhóm màu xám là cao nhất (42,1%), tiếp theo là vàng (22,6%), trắng (17,8%), đỏ (14,5%) trên tổng số chủng xạ khuẩn (n=297) (Hình 3.4 ). Kết quả phân lập theo màu sắc khuẩn ty của các chủng XKNS khá phù hợp với một số nghiên cứu phân lập xạ khuẩn từ đất và một số thực vật. Passari và cs. (2015) đã tiến hành quan sát màu sắc khuẩn ty trên 42 chủng xạ khuẩn phân lập được từ 7 loài dược liệu thuộc 4 nhóm màu. Kết quả cho thấy, 19 chủng thuộc nhóm màu nâu (45,2%), 11 chủng thuộc nhóm màu vàng (26,3%), 4 chủng màu xám (9,5%) và 8 chủng màu trắng (19%). Gayathri và Muralikrishnan (2013) phân lập XKNS trên các mẫu thực vật ở rừng ngập mặn cho thấy, các chủng phân lập thuộc 2 nhóm màu xám (66,7%) và trắng (33,3%) chiếm đa số. Phuakjaiphaeo và Kunasakdakul (2015) phân lập được 36 chủng xạ khuẩn từ cây Entella asiatica (L.) Urban, trong đó nhóm mầu chiếm ưu 89 thế nhất là màu trắng (50%), tiếp đến là màu vàng (41,7%) và ít nhất là màu xám (8,3%). Kết quả trên phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khi phân lập xạ khuẩn từ đất và biển cũng đã nhận thấy nhóm màu xám, trắng thường chiếm tỷ lệ cao hơn (Lê Gia Hy, 1994; Davis và cs., 2005). 4.1.2. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh Trong nghiên cứu này, có 96 chủng (chiếm 32,3%) có khả năng kháng ít nhất một trong chín chủng VSV kiểm định (Bảng 3.1, Hình 3.7, Phụ lục 6). Đáng chú ý, một nửa (50%) có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và hoạt tính phổ rộng, kết quả này tương đồng với giả thuyết rằng các đặc tính chữa bệnh của thực vật có thể dựa một phần vào sự tồn tại của XKNS trong đó (Strobel và cs., 1999). Sự hiện diện của hoạt tính đối kháng chống lại các VSV kiểm định là mục tiêu tiếp tục nghiên cứu tìm các hợp chất kháng khuẩn tiềm năng. Chủng Streptomyces thermocarboxydus BPSAC38 có hoạt tính kháng S. aureus (14,8 mm) cao; tương tự, chủng BPSAC28, 35 và 37 phân lập từ cây M. jalapa và C. colebrookianum, có hoạt tính kháng E. coli, P. aeruginosa, và C. albicans. Hơn nữa, các hoạt động chống oxy hóa, kháng khuẩn và tăng huyết áp đã xuất hiện trên các chủng phân lập được (Verma và cs., 2009; Golinska và cs., 2015). Kết quả trong luận án phù hợp với công bố của Li và cs. (2008) đã giả thuyết rằng XKNS thuộc chi Streptomyces phân lập từ cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn và kháng u. Trong thập kỷ qua, nhiều loại kháng sinh mới đã được phân lập từ XKNS, như munumbicin đã được phân lập từ dịch lên men của Streptomyces NRRL 30562 (Castillo và cs., 2002), actinoallolide từ Actinoallomurus fulvus MK10-036 (Inahashi và cs., 2015), stenothricin và bagremycin từ Nocardia caishijiensis SORS 64b (Tanvir và cs., 2016). Đặc biệt, một số loại kháng sinh mới có tác dụng mạnh đối với vi khuẩn đa kháng thuốc (Castillo và cs., 2002; Tanvir và cs., 2016). Nhiều nhà nghiên cứu cũng ủng hộ giả thuyết, XKNS thu thập từ cây thuốc truyền thống là ứng viên tiềm năng cho việc sản xuất các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên tiềm năng (Sharma và cs., 2001; Golinska và cs., 2015). 90 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của XKNS phân bố theo vị trí mô cho thấy, tuy số lượng xạ khuẩn phân lập được từ thân chiếm cao nhất (45,5%), nhưng tỷ lệ các chủng kháng khuẩn phân lập từ lá cao hơn hẳn từ rễ và thân. Theo công bố của Senanayake và Wijesekera (2003) đã chỉ ra loài quế đơn chứa lượng tinh dầu giảm dần theo các bộ phận cụ thể là: 2,0% ở vỏ, 0,63% ở lá và 0,37% ở rễ. Các tác giả chỉ ra rằng trong tinh dầu quế chứa hơn 90 hợp chất hóa học khác nhau. Thành phần chính trong tinh dầu từ vỏ quế là cinnamaldehyde, trong khi đó tinh dầu lá quế lại bao gồm chủ yếu là eugenol và ở rễ quế bao gồm chủ yếu là camphor. Ngoài các thành phần chính ra còn có các thành phần khác thay đổi theo các bộ phận thu hái của quế như coumarin, cinnamyl acetate, cinnamic acid, α-pinene, benzandehyd... Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu quế đơn (Cinnnamomum cassia) thu ở các bộ phận khác nhau của cây quế tại Trung Quốc được Ooi và cs. (2006) nghiên cứu trên các chủng vi khuẩn thử ngiệm là Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus và Samonella typhymurium với đường kính VVK từ 28 – 46 mm. Điều này có thể gợi ý rằng, hàm lượng tinh dầu trong các bộ phận của cây quế có mối liên hệ với tính kháng VSV của XKNS trong mô thực vật. Để dự đoán khả năng sinh tổng hợp các chủng xạ khuẩn, phương pháp tìm kiếm các gen mã hóa PKS và NRPS, chịu trách nhiệm tổng hợp các hợp chất thuộc nhóm polyketide và peptide hoạt tính sinh học cao đã được sử dụng rộng rãi để đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp của các VSV có thể và không thể nuôi cấy (Minowa và cs., 2007). Tuy nhiên, tiềm năng kháng khuẩn của xạ khuẩn có thể nuôi cấy chỉ có thể được đánh giá bằng cách sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn chống lại các tác nhân gây bệnh kiểm định. Số lượng các chủng có đặc tính kháng khuẩn không tương quan với tỷ lệ phân lập cho thấy sự hiện diện của gen pks và nrps, ngược lại (Li và cs., 2008; Qin và cs., 2009). Trong nghiên cứu này, hầu hết các chủng cho thấy sự hiện diện của gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS, cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại hầu hết các tác nhân gây bệnh được thử 91 nghiệm (Hình 3.9 và Phụ lục 8). Tuy nhiên, 10 chủng phân lập đều thuộc chi Streptomyces mang cả 3 gen pks-I, pks-II và nrps, cũng đã chứng minh tiềm năng kháng ít nhất 3 chủng VSV gây bệnh. Ngược lại, các chủng HBQ16, HBQ86, LCQ61, LCQ93, YBQ50, YBQ101, YBQ106 và YBQ119 không mang cả ba gen pks-I, pks-II và nrps và đều cho hoạt tính kháng khuẩn thấp. Tuy nhiên, chủng LCQ7, LCQ91 có hoạt tính kháng khuẩn thấp nhưng mang cả 3 gen pks-I, pks-II và nrps. Cũng như các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ các chủng mang gen pks-II cao hơn so với pks-I, nrps. Sự phổ biến của các gen chủ yếu các chủng thuộc chi Streptomyces. Điều này là hợp lí bởi các báo cáo chỉ ra rằng gần 80% kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces (Li và cs., 2008). Một số nghiên cứu trước đã cho thấy tỷ lệ các chủng mang gen pks-I, pks-II, nrps và tỷ lệ các chủng có khả năng kháng khuẩn không tương quan với nhau (Qin và cs., 2009; Zhao và cs., 2011). Tương tự trong nghiên cứu này, một số chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn nhưng không mang 1 hoặc 2 hoặc cả 3 gen. Có thể lý giải rằng chủng XKNS không mang gen hoặc cũng có thể do các cặp mồi suy biến sử dụng trong nghiên cứu chưa phù hợp hoặc đã có những đột biến tại điểm bắt cặp của các mồi nên không thể khuếch đại bởi phản ứng PCR (Miller và cs., 2012). Ngược lại, các chủng mang gen nhưng không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, có thể do nồng độ của chất chuyển hóa thứ cấp do chúng tạo ra quá thấp để kìm hãm sự phát triển của VSV kiểm định (Zhao và cs., 2011) hoặc hoạt tính kháng khuẩn trong các chủng này có thể là do một số gen sinh tổng hợp khác như pkse, phz E, cyp-450, dtgd ngoài các gen mã hóa pks-I, pks-II và nrps (Yuan và cs., 2014). Trên thực tế, kháng sinh thuộc nhóm anthracycline được tạo ra bởi con đường sinh tổng hợp polyketide và chủ yếu được tìm thấy đều thuộc chi Streptomyces (Metsä-Ketelä và cs., 2007). Vì vậy, một số báo cáo đã phân lập được các tác nhân chống khối u mới từ XKNS (Trease và Evans, 1996; Zhang và cs., 2014; Ventola, 2015). Ví dụ, lupinacidin, kháng sinh chống khối u mới thuộc nhóm anthraquinone, đã được phân lập từ chủng Micromonospora lupin sp. nov (Trease và Evans, 1996). Các kháng sinh thuộc nhóm anthracycline đã được phân lập từ các vi khuẩn gây ung 92 thư ruột kết tràng được tổng hợp từ chủng Streptomyces sp. Eg23 (Ventola, 2015) và Streptomyces sp. NEAU-L3 (Zhang và cs., 2014). Tỉ lệ phát hiện các gen sinh tổng hợp kháng sinh và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline đã khẳng định rằng XKNS phân lập từ cây quế có thể là những nguồn quan trọng cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tương lai gần. 4.1.3. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh Tổng số 82 chủng kháng ít nhất 1 chủng VSV kiểm định được khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA bằng cách sử dụng PCR. Các chuỗi sản phẩm được phân tích để dự đoán sự đa dạng của các chủng phân lập dưới loài. Trình tự DNA của hầu hết 82 chủng phân lập có độ tương đồng đến 97-100% với một số chủng tham chiếu trong GenBank. Tổng số 82 chủng XKNS phân lập được phân thành 6 họ và 6 chi, chỉ ra sự tương tác cộng sinh của các XKNS trong cây dược liệu (Bảng 3.2, Bảng 3.3 và Phụ lục 7). Thành phần của XKNS trong nghiên cứu này đa dạng hơn nhiều so với XKNS phân lập được từ cây Azadirachta indica (Verma và cs., 2009), cây thuốc từ rừng nhiệt đới của Trung Quốc (Li và cs., 2008; Zhao và cs., 2011). Tất cả các chủng phân lập chủ yếu thuộc chi Streptomyces, do đó được nhóm lại thành một nhóm và một số chủng thuộc chi hiếm hơn như Microbacterium, Brevibacterium, Micromonospora, Saccharothrix và Nocardia được nhóm lại với nhau hình thành một cụm lớn, phù hợp với những nghiên cứu trước đây (Zhao và cs., 2011). XKNS hiếm từ các chi Microbacterium, Brevibacterium, Micromonospora lần đầu tiên được tìm thấy bởi Qin và cs. (2007, 2012). Cả hai công trình đều nghiên cứu về cây thuốc truyền thống của Trung Quốc. Để phân lập XKNS với số lượng lớn Qin và cs. (2012) đã đưa ra các môi trường phân lập đặc hiệu và các phương pháp phân lập XKNS từ cây dược liệu. Kết quả trong luận án, cho thấy đây là báo cáo đầu tiên về Saccharothrix xinjiangensis LCQ61 được phân lập như một XKNS từ cây quế. Các trình tự nucleotide của gen mã hóa16S rRNA của tất cả các XKNS đã được đăng ký GenBank (Bảng 3.2). So sánh với nhiều nghiên cứu trên các loài thực vật khác nhau, Streptomyces là chi phổ biến, chiếm 90% tổng số chủng phân lập từ cây quế. Do vậy, Kaewkla và 93 Franco (2013) đã phân loại 576 chủng XKNS dựa trên phân tích trính tự gen 16S rDNA, có 72% trên tổng số chủng phân lập trong các loài thảo mộc của Úc đều thuộc chi Streptomyces. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác chỉ có 27% trong số 123 chủng được thu hồi từ thực vật ở các đảo Somalia, có nghĩa là các chi không phải Streptomyces chiếm ưu thế trong các cây thực vật này (Janso và Carter, 2010). Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tỷ lệ chủng không thuộc chi Streptomyces nội sinh trên các cây thuốc khác nhau là cao hơn hẳn (Zhao và cs., 2011). Tất cả những phát hiện này cho thấy sự đa dạng di truyền của XKNS có liên quan chặt chẽ với các loài thực vật cụ thể và do đó chúng có thể có khả năng khác nhau để có được các đặc tính quan trọng của XKNS từ cây chủ. Kết quả nghiên cứu trong luận án, cho thấy chi Streptomyces chiếm ưu thế (92,7%), trong đó có 49 loài Streptomyces khác nhau được phân bổ theo phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA, cho thấy sự đa dạng cao trong loài này. 4.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 4.2.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59 Trong nhiều nghiên cứu, chủng S. cavourensis được tìm thấy trong trầm tích biển, đất, phân compost, cây trồng, và cỏ dại (Yuan và cs., 2008; Xu và cs., 2013; Lee và cs., 2014; Pan và cs., 2015) nhưng chưa được tìm thấy ở loài thực vật đặc biệt là cây quế. Nhiều chất chuyển hóa thứ cấp tiềm năng được công bố từ các loài xạ khuẩn có hoạt tính sinh học. Các chủng tham chiếu của S. cavourensis subsp. cavourensis như NRRL 2740 đã được ứng dụng để sinh tổng hợp chất kháng ung thư như chromomycin, flavensomycin và humidin kháng nấm (Narendhran và cs., 2014). Các thuốc kháng sinh thuộc nhóm macrolide bao gồm bafilomycin (B1, C1 và D) và hygrobafilomycin được ghi nhận ở các loài S. cavourensis có hoạt tính kháng nấm mạnh (Xu và cs., 2013; Pan và cs., 2015). Ngoài ra, chất chuyển hóa thứ cấp 2 (S)-30-hydroxybutan-20-yl 2-hydroxypropanoat, (E)-3-hydroxy-2,4- dimethylhept-4 enamit và acid 2-hydroxy-3-methylbutanoic cũng cho thấy, tiềm năng chống ung thư và được phân lập từ chủng S. cavourensis YY01-17 (Su và cs., 94 2013). Một nghiên cứu gần đây đã công bố chủng S. cavourensis NEAE-42 có thể sản xuất oxidase cholesterol ở nồng độ cao (El-Naggar và cs., 2017). Trong luận án này, đã khẳng định đây là công bố đầu tiên về chủng S. cavourensis nội sinh được phân lập từ cây quế (Cinnamomum cassia Presl). Hơn nữa, chủng S. cavourensis YBQ59 thể hiện tiềm năng kháng khuẩn mạnh chống lại các mầm bệnh khác nhau của con người, đặc biệt, chủng YBQ59 cũng cho thấy tiềm năng sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính sinh học. 4.2.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 Kết quả hệ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm Velvet với tổng kích thước 10,2 Mb và với độ sâu trung bình là 18X. Đây là độ sâu khá cao so với các hệ gen lắp rá

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_su_da_dang_kha_nang_sinh_khang_sinh_cua_x.pdf
Tài liệu liên quan