Luận án Nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana phòng chống rệp sáp hại cà phê tại Tây Nguyên

99.8 % với loài Metarhizium anisopliae; mẫu BR16 tương đồng 100% với loài Paecilomyces cicadae (đạt 543/543 cặp nucleotide). Qua kết quả giám định các chủng nấm, chúng tôi thu được thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê được trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê (Viện BVTV, 2009 – 2011) TT Loài nấm Ký hiệu chủng Ký chủ (họ ký chủ) Địa điểm thu 1 Metarhizium anisopliae MR1 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk MR2 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk MR3 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La MR4 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk MR6 Rệp sáp mềm (Coccidae) Nghệ An MR7 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk MR8 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Gia Lai MR9 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Gia Lai 2 Beauveria bassiana BR1 Rệp sáp mềm (Coccidae) Sơn La BR2 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk BR3 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An BR4 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An BR5 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk BR6 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An BR8 Rệp sáp mềm (Coccidae) Đắk Lắk BR9 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk BR11 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Hà Nội BR14 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La 3 Cephalosporium lanoso-niveum BR12 Rệp sáp mềm (Coccidae) Đắk Lắk 4 Cordyceps nutans BR7 Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk Kết quả đã thu thập được 4 loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê, trong đó loài Metarhizium anisopliae thu được 8 chủng, loài Beauveria bassiana thu được 10 chủng, loài Cephalosporium lanoso-niveum thu được 1 98 98 chủng và loài Cordyceps nutans thu được 1 chủng. Như vậy, 2 loài nấm M. anisopliae và B. bassiana là những loài có tần suất ký sinh gây bệnh trên rệp sáp cao. Đây là kết quả lần đầu tiên xác định về thành phần các loài nấm ký sinh trên rệp sáp hại cà phê tại Việt Nam. Cùng với kết kết quả thu thập, phân lập và giám định các mẫu vật thuộc các loài sâu hại khác được thu thập bổ sung ở các vùng khác nhau đến năm 2011 được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7. Danh sách các chủng nấm ký sinh trên sâu hại đã phân lập được ở Việt Nam 2009 - 2011 TT Ký hiệu chủng Loài nấm Ký chủ (họ ký chủ) Địa điểm 1 MR1 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 2 MR2 Metarhizium anisopliae Rệp sáp (Pseudococcidae) Đắk Lắk 3 MR3 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La 4 MR4 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 5 MR5 Metarhizium anisopliae Rầy nâu (Delphasidae) Hà Nội 6 MR6 Metarhizium anisopliae Rệp sáp mềm xanh (Coccidae) Nghệ An 7 MR7 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 8 MR8 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Gia Lai 9 MR9 Metarhizium anisopliae Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Gia Lai 10 BR1 Beauveria bassiana Rệp sáp mềm xanh (Coccidae) Sơn La 11 BR2 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 12 BR3 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An 13 BR4 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An 99 99 TT Ký hiệu chủng Loài nấm Ký chủ (họ ký chủ) Địa điểm 14 BR5 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 15 BR6 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Nghệ An 16 BR7 Cordyceps nutans Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 17 BR8 Beauveria bassiana Rệp sáp mềm xanh (Coccidae) Đắk Lắk 18 BR9 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Đắk Lắk 19 BR10 Beauveria bassiana Sâu róm thông (Lymatridae) Nghệ An 20 BR11 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Hà Nội 21 BR12 Cephalosporium lanoso- niveum Rệp sáp mềm xanh (Coccidae) Đắk Lắk 22 BR13 Beauveria bassiana Sâu đo vải (Geometridae) Bắc Giang 23 BR14 Beauveria bassiana Rệp sáp bột (Pseudococcidae) Sơn La 24 BR15 Toxicocladosporium sp. Rầy nâu (Delphasidae) Hà Nội 25 BR16 Paecilomyces cicadae Ve sầu (Cicadidae) Đắk Lắk Kết quả đã thu thập được 25 chủng thuộc 6 loài nấm ký sinh, bao gồm 9 chủng thuộc loài nấm Metarhizium anisopliae trong đó 4 chủng thu được ở Đắk Lắk, 2 chủng ở Gia Lai, 1 chủng ở Sơn La, 1 chủng ở Nghệ An và 1 chủng ở Hà Nội; 12 chủng thuộc loài Beauveria bassiana trong đó 4 chủng thu được ở Đắk Lắk, 4 chủng ở Nghệ An, 2 chủng ở Sơn La, 1 chủng ở Hà Nội và 1 chủng ở Bắc Giang. 1 chủng thuộc loài Cordyceps nutans thu được ở Đắk Lắk, 1 chủng thuộc loài Cephalosporium lanosoniveum thu được ở Đắk Lắk , 1 chủng thuộc loài Toxicocladosporium sp. thu được ở Đắk Lắk và 1 chủng thuộc loài Paecilomyces cicadae thu được ở Đắk Lắk. Tóm lại: Thành phần thu thập được 20 chủng thuộc 4 loài nấm ký sinh 100 100 trên rệp sáp cà phê ở Việt Nam bao gồm: 8 chủng thuộc loài Metarhizium anisopliae, 10 chủng thuộc loài Beauveria bassiana, 1 chủng thuộc loài Cordyceps nutans và 1 chủng thuộc loài Cephalosporium lanoso-niveum. Riêng ở các tỉnh Tây Nguyên đã thu được 12 chủng thuộc 4 loài nấm ký sinh rệp sáp hại cà phê, trong đó 6 chủng thuộc loài Metarhizium anisopliae, 4 chủng thuộc loài Beauveria bassiana, 1 chủng thuộc loài Cordyceps nutans và 1 chủng thuộc loài Cephalosporium lanoso-niveum. Với thành phần các chủng đã thu thập rất phong phú sẽ là nguồn vật liệu phục vụ cho các thí nghiệm đánh giá độc lực và lựa chọn để sản xuất chế phẩm. 3.2.2. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy nấm Để xác định môi trường nuôi cấy nấm và nhân giống cấp 1 vừa đạt hiệu quả kỹ thuật về khả năng phát triển và sinh lượng enzyme ngoại bào lớn nhất, vừa đảm bảo hiệu quả kinh tế, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá môi trường thông qua khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng MR4 như sau: Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm MR4 trên các môi trường khác nhau (Viện BVTV, 2009) Môi trường Đường kính vòng phân giải của enzyme (cm) Trọng lượng khô Chitine - T Chitine - C CMC Glucose Lipid MT1 1,90b 2,00b 2,00a 2,06a 2,06a 2,45b MT2 1,53c 1,53c 1,55c 1,55b 1,56c 2,68a MT3 1,43d 1,45d 1,41e 1,43c 1,50d 1,92c CZ 1,41d 1,46cd 1,50d 1,46c 1,50d 0,66e N1 2,10a 2,16a 1,90b 2,03a 1,96b 1,18d CV % 2,9 2,6 1,1 2,5 2,1 1,7 Ghi chú: Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 Qua kết quả thí nghiệm bảng 3.8 cho thấy, môi trường N1 là môi trường khả thi nhất dùng để sản xuất giống cấp 1 vì hàm lượng enzyme ngoại bào phân giải Chitine-T và Chitine-C đạt giá trị cao nhất, mặt khác môi trường N1 có giá thành bằng 25% so với các loại môi trường còn lại. Vì vậy 101 101 các nghiên cứu về sau cũng như áp dụng trong sản xuất chế phẩm chúng tôi sử dụng môi trường N1 trong tất cả các nghiên cứu. 3.3.3. Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng nấm ở các mức nhiệt độ khác nhau Để lựa chọn các chủng thích nghi với các ngưỡng nhiệt độ khác nhau, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy trong tủ định ôn ở ngưỡng nhiệt độ 150C; 200C; 250C; 300C và 350C trong 15 ngày, tiến hành đo đường kính khuẩn lạc sau 3; 5; 7; 10; 15 ngày nuôi cấy để đánh giá tốc độ phát triển của các chủng ở các mức nhiệt độ khác nhau. Kết quả thu được trình bày trong các bảng sau: Bảng 3.9. Khả năng phát triển của các chủng nấm BR trên môi trường N1 ở 15oC (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng nấm Đường kính khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy (mm) 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày 15 ngày BR1 4,1cb 10,0b 15,0cb 25,6b 37,3b BR2* 3,3cb 6,6defg 12,0def 18,5de 26,8efg BR3 2,0d 4,6g 8,5g 16,8e 19,5h BR4 1,0d 5,0g 10,5fg 18,8ed 33,1cd BR5* 1,0a 5,0g 11,8def 20,3cde 30,1de BR6 3,1c 7,1def 13,0cde 21,1cd 33,5cd BR7* 4,0cb 9,5cb 14,1bcd 24,3cb 37,1b BR8* 4,0cb 9,6cb 15,1cb 22,3bcd 37,5b BR9* 3,8cb 8,1bcd 12,0def 19,0ed 23,6g BR10 3,5cb 10,0b 14,8cb 19,1ed 30,3cde BR11 1,0d 5,1fg 12,0def 22,1cd 34,0cb BR12* 1,6d 5,8efg 11,3ef 17,0e 27,8ef BR13 3,3cb 9,8cb 15,3cb 24,1cb 33,5cd BR14 1,0d 7,8cde 13,6bcde 16,6e 25,6fg BR15 4,5b 10,1b 15,6b 21,3cd 31,5cd BR16* 6,6a 14,1a 21,0a 30,0a 44,8a CV % 3,4 5,2 10,4 11,0 7,0 Ghi chú: - Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 - * Các chủng thu được ở Tây Nguyên 102 102 Kết quả thí nghiệm khả năng phát triển của các chủng nấm BR cho thấy, các chủng nấm BR đều có khả năng phát triển ở nhiệt độ 15oC, trong đó các chủng có khả năng phát triển tốt là BR16, BR8, BR7, BR1 có đường kính khuẩn lạc sau 15 ngày nuôi cấy tương ứng là 44,8; 37,5; 37,1 và 37,3mm. Điều này cho thấy các chủng nấm BR có khả năng phát triển ở mức nhiệt độ tương đối thấp. Bảng 3.10. Khả năng phát triển của các chủng nấm BR trên môi trường N1 ở 20oC (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng nấm Đường kính khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy (mm) 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày 15 ngày BR1 4,5fg 13,2defghi 20,8fg 30,0def 45,6de BR2* 5,1ef 11,1i 17,0i 24,3h 33,0f BR3 3,5g 11,5hi 20,3gh 28,1gf 41,5e BR4 5,5def 13,6cdefgh 22,5def 32,1cde 57,6b BR5* 5,6cdef 14,0cdefg 21,3efg 31,6cde 50,8c BR6 4,1fg 11,8ghi 19,8gh 27,8fg 43,1de BR7* 6,3bcde 15,3bc 24,6b 35,3b 58,3b BR8* 6,1bcde 13,1defghi 20,6g 29,8ef 44,1de BR9* 6,1bcde 12,3fghi 18,6h 25,5gh 42,5e BR10 7,5b 17,5ab 24,3cb 31,5cde 47,5cd BR11 7,5b 15,8bc 24,3cb 31,5cde 47,5cd BR12* 7,1bc 15,3bcd 23,0bcde 29,8ef 43,6de BR13 6,6bcde 15,0cde 22,8cde 33,6cb 56,3b BR14 2,0h 12,8efghi 15,1j 19,5i 28,3g BR15 7,0bcd 14,6cdef 23,8bcd 32,8bcd 77,0a BR16* 9,1a 19,0a 32,1a 48,3a 76,3a CV % 6,0 9,9 4,7 5,5 5,7 Ghi chú: - Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 - * Các chủng thu được ở Tây Nguyên Ở nhiệt độ 20oC, các chủng BR đều phát triển tốt, đạt kích thước lớn. Chủng BR15, BR16 đạt lớn nhất 77mm, 76,3mm, chủng BR14 phát triển kém 103 103 nhất, đường kính chỉ đạt 28,3mm sau 15 ngày nuôi cấy trên môi trường N1. Bảng 3.11. Khả năng phát triển của các chủng nấm BR | trên môi trường N1 ở 25oC (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng nấm Đường kính khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy (mm) 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày 15 ngày BR1 7,8b 17,6a 25,1ab 33,6a 50,5c BR2* 7,6b 17,8a 25,0b 34,1a 50,5c BR3 7,8b 18,6a 25,5ab 34,5a 51,6bc BR4 7,6b 18,6a 25,1ab 35,0a 54,0abc BR5* 8,5ab 20,6a 29,3ab 38,8a 56,1abc BR6 8,0ab 20,8a 29,5ab 39,3a 59,5abc BR7* 10,0ab 22,8a 30,5ab 41,6a 58,8abc BR8* 10,5a 22,3a 30,5ab 41,6a 62,1ab BR9* 9,5ab 21,6a 29,6ab 42,3a 59,8abc BR10 9,6ab 21,5a 28,6ab 40,8a 59,1abc BR11 10,0ab 23,3a 32,8ab 45,0a 58,8abc BR12* 10,0ab 23,3a 33,0ab 47,0a 59,6abc BR13 9,0ab 21,8a 32,8ab 47,8a 62,5a BR14 10,0ab 23,5a 33,6ab 47,8a 61,1ab BR15 9,0ab 22,1a 31,0ab 45,0a 59,3abc BR16* 9,3ab 21,1a 31,8ab 45,8a 59,5abc CV % 5,7 7,3 16,0 19,0 10,2 Ghi chú: - Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 - * Các chủng thu được ở Tây Nguyên Chủng BR14 phát triển kém ở nhiệt độ 20oC tuy nhiên ở nhiệt độ 25oC chủng này lại phát triển khá tốt, đường kính khuẩn lạc sau 15 ngày nuôi cấy đạt 61,1mm. Các chủng BR khác cũng cho kích thước đường kính khuẩn lạc lớn ở ngưỡng nhiệt độ này, hầu hết các chủng đều có đường kính khuẩn lạc đạt xoay quanh 60mm. Kết quả nghiên cứu này tương đồng với các kết quả nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về ngưỡng nhiệt độ tối thích cho nấm côn trùng phát triển tốt nhất từ 25 – 280C (Inglis, 1993). 104 104 Bảng 3.12. Khả năng phát triển của các chủng nấm BR trên môi trường N1 ở 30oC (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng nấm Đường kính khuẩn lạc sau các ngày nuôi cấy (mm) 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày 15 ngày BR1 2,8bc 3,8h 4,6h 14,6c 19,8d BR2* 2,8bc 18,8ab 21,6c 14,6c 20,0d BR3 4,1abc 6,0g 8,1g 16,3c 22,1cd BR4 3,3abc 17,5bc 21,8bc 16,0c 22,1cd BR5* 6,0abc 13,1d 18,8d 23,1abc 30,6abcd BR6 6,0abc 3,3h 4,5h 23,3abc 30,8abcd BR7* 7,3ab 20,1a 23,1ab 30,0ab 39,1ab BR8* 7,8a 2,3h 4,0h 30,8ab 39,1ab BR9* 7,3ab 5,6g 9,0g 33,0a 42,6a BR10 7,3ab 9,6e 17,1e 33,3a 43,0a BR11 4,3abc 12,5d 18,5de 27,5abc 36,5abc BR12* 4,3abc 6,3g 8,5g 27,3abc 36,3abc BR13 3,5abc 11,8d 18,3de 23,0abc 31,1abcd BR14 4,0abc 8,5ef 13,5f 22,6abc 31,0abcd BR15 2,5c 15,8c 24,1a 17,5bc 25,3cbd BR16* 2,6bc 7,3fg 14,3f 17,8bc 25,6bcd CV % 5,5 12,9 6,5 3,1 9,1 Ghi chú: - Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 - * Các chủng thu được ở Tây Nguyên Ở nhiệt độ 30oC, các chủng BR phát triển kém hơn 3 mức nhiệt độ trên (15, 20, 250C), đường kính khuẩn lạc cao nhất chỉ đạt 43 mm ở chủng BR10, chủng có tốc độ phát triển chậm nhất là BR1 chỉ đạt 19,8mm sau 15 ngày nuôi cấy. Như vậy, từ các số liệu thí nghiệm ở các bảng 3.9 đến 3.12 cho thấy các chủng nấm thí nghiệm từ BR1- BR16 thích hợp phát triển ở mức nhiệt độ 20- 25oC, hầu hết các chủng nấm phát triển kém ở nhiệt độ 30oC. Khi so sánh đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm BR ở mức nhiệt độ thích hợp, chúng tôi nhận thấy các chủng có tốc độ phát triển nhanh, kích thước khuẩn 105 105 lạc lớn là BR10, BR12, BR13, BR15, BR16, đặc biệt là 2 chủng BR15 và BR16 (đạt kích thước trên 70mm sau 15 ngày nuôi cấy). Đây cũng là một trong các chỉ tiêu quan trọng khi tiến hành lựa chọn các chủng nấm để sử dụng làm vật liệu sản xuất chế phẩm. 3.2.4. Đánh giá và tuyển chọn độc lực các chủng nấm côn trùng - Đánh giá độc lực của các chủng nấm bằng enzyme ngoại bào Để tuyển chọn chủng nấm có hoạt lực sinh học cao, chúng tôi đã thí nghiệm khả năng phân giải enzyme ngoại bào của các chủng nấm với các cơ chất khác nhau, kết quả thu được thể hiện trong các bảng sau: Bảng 3.13. Khả năng phân giải một số cơ chất của Enzyme ngoại bào các chủng nấm BR sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường N1 (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng Đường kính vòng phân giải trên các cơ chất (mm) Chitine-T Chitine-C CMC Lipid Glucose BR1 4,0i 5,0g 4,3g 0,0j 3,3h BR2* 9,3efg 9,6def 7,0ef 6,3hi 7,0fg BR4 13,3d 13,8bc 9,0cd 12,3c 9,6de BR5* 15,3bc 16,0ab 10,6c 11,3cd 7,6ef BR6 7,0h 8,0ef 5,6fg 5,0i 5,0gh BR7* 10,0ef 9,0ef 8,0de 10,6cde 8,0ef BR8* 13,6cd 13,6bc 14,0e 11,0cde 15,3a BR9* 10,6e 10,6de 10,6c 8,0fgh 10,6cd BR10 8,6efgh 8,3ef 8,0de 6,3hi 8,6def BR11 15,6b 15,3ab 14,6ab 15,0b 12,3bc BR12* 8,3fgh 7,0fg 9,0cd 8,8fgh 9,0def BR13 17,6a 17,6a 16,0a 17,6a 13,3ab BR14 7,6gh 7,6efg 6,3ef 6,3hi 7,3f BR15 10,0ef 10,3de 10,3c 7,3gh 10,6cd BR16* 16,3a 12,0cd 9,3cd 9,6def 9,6de CV % 7,5 10,8 7,6 10,0 9,8 Ghi chú: - Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 - * Các chủng thu được ở Tây Nguyên 106 106 Kết quả đánh giá khả năng phân giải của enzyme ngoại bào, trên cơ chất chitine-T, chitine-C các chủng nấm BR có khả năng phân giải tốt. Cho đường kính vòng phân giải đạt lớn nhất trên 2 loại cơ chất này là chủng BR13 (đạt 17,6mm), đây cũng là chủng cho đường kính phân giải lớn trên các cơ chất còn lại. Các chủng BR5, BR16, BR11 cũng là các chủng có đường kính vòng phân giải lớn trên các cơ chất. Bảng 3.14. Khả năng phân giải một số cơ chất của Enzyme ngoại bào các chủng nấm MR sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường N1 (Viện BVTV, 2009 – 2011) Chủng Đường kính vòng phân giải trên các cơ chất (mm) Chitine-T Chitine-C CMC Lipid Glucose MR1* 11,0ab 12,0a 10,3ab 10,6a 10,6a MR2* 9,0cd 9,6abc 10,6a 4,6de 10,0a MR3 11,6a 11,0ab 10,0ab 10,3a 10,0a MR4* 10,6abc 10,3abc 8,6abc 8,3b 10,0a MR5 7,6d 8,0bc 8,0bc 6,3c 7,0bc MR6 7,5d 7,3c 6,8c 5,5cd 6,3c MR7* 9,3bcd 8,6abc 9,3ab 9,6a 9.3ab MR8* 10,6abc 9,0abc 10,3ab 4,0e 10,6a MR9* 9,6bc 9,3abc 9,6ab 7,6b 10,0a CV % 7,5 14,2 9,8 6,2 10,6 Ghi chú: - Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 - * Các chủng thu được ở Tây Nguyên Các chủng MR thí nghiệm về khả năng phân giải của enzyme ngoại bào cho thấy: Enzyme ngoại bào của tất cả các chủng đều có khả năng phân giải các loại cơ chất trên, tuy nhiên khả năng phân giải của chúng trên các cơ chất khác nhau là khác nhau. Chủng MR1, MR3, MR4 phân giải tốt các loại cơ chất, trong khi đó 1 số chủng như MR8, MR2 cho đường kính vòng phân giải 107 107 thấp hơn nhiều trên cơ chất lipid so với các cơ chất còn lại. Như vậy, các chủng MR1, MR3, MR4 là các chủng bước đầu được đánh giá khá tốt. Ngoài việc đánh giá hoạt lực của enzyme ngoại bào trong phân giải các cơ chất của từng chủng nấm riêng rẽ, chúng tôi tiến hành lựa chọn các chủng sinh hàm lượng enzyme ngoại bào lớn và hỗn hợp theo từng cặp chủng với nhau để tiến hành nuôi cấy, sau 7 ngày tiến hành thu enzyme để kiểm tra độc lực của chúng có được nhân lên khi hỗn hợp lại với nhau, kết quả thu được bảng 3.15. Bảng 3.15. Khả năng phân giải các cơ chất của enzyme ngoại bào khi nuôi cấy hỗn hợp một số chủng nấm sau 7 trên môi trường N1 (Viện BVTV, 2010) Công thức Đường kính vòng phân giải (mm) Chitine-T Chitine-C CMC Lipid Glucose BR5+MR4 15,3a 14,0b 9,6a 10,0a 9,0ab BR5+MR3 11,0b 11,6c 9,6a 6,0bc 10,0ab MR4+BR13 11,3b 11,6c 10,0a 8,6ab 8,6ab MR3+BR16 12,3b 11,3a 9,6a 9,3bc 9,3a MR1+BR16 9,3c 9,0b 10,0a 9,3bc 9,0a MR1+BR5 10,0c 9,0b 11,3a 4,3e 10,0a MR4+BR16 14,3a 11,3a 11,3a 11,0a 10,0a MR3+BR13 9,6c 9,6c 9,6c 7,3d 9,6b CV % 3,5 6,3 8,5 14,2 10,1 Ghi chú: Trong phạm vi cột, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 Kết quả thí nghiệm khi nuôi cấy hỗn hợp giữa các chủng cho thấy, các chủng sản sinh hàm lượng enzyme lớn nhất khi nuôi riêng rẽ để phối hợp nuôi cấy hỗn hợp nhằm tạo ra sản phẩm đa chủng thì kết quả hàm lượng sản sinh enzyme không tăng lên mà thậm chí còn giảm đi nhiều. Cụ thể, chủng BR5 khi nuôi cấy riêng rẽ cho đường kính vòng phân giải cơ chất Chitine-T la 15,3mm; Chitine – C là 16,0mm; tương ứng chủng MR4 là 10,6 và 10,3mm. 108 108 Khi hỗn hợp 2 chủng này lại thì khả năng phân giải cơ chất Chitine-T là 15,3 và Chitine-C là 14,0 mm. Các cặp chủng khác còn lại khả năng phân giải enzyme còn giảm nhiều hơn so với khi nuôi cấy đơn dòng. Tóm lại: Không thể hỗn hợp các chủng trong nuôi cấy để tạo ra chế phẩm đa dòng, kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các thí nghiệm của Jackson (2007). Một số hình ảnh về đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Hình 3.18. Thử phản ứng enzyme các chủng nấm Hình 3.19. Đường kính vòng phân giải enzyme của các chủng khác nhau - Độc lực của các chủng nấm trên rệp sáp Các chủng nấm sau khi đã được sơ tuyển bằng phản ứng enzyme ngoại bào trên các cơ chất khác nhau, chúng tôi tiến hành đánh giá độc lực trên cơ thể rệp sáp để tuyển chọn chủng tốt nhất cho sản xuất chế phẩm. + Đối với loài nấm Beaveria bassiana chúng tôi đã lựa chọn được 4 chủng để đánh giá độc lực đối với rệp sáp là BR5; BR11; BR13; BR16. + Đối với loài nấm Metarhizium anisopliae chúng tôi đã lựa chọn được 4 chủng để đánh giá độc lực trên rệp sáp là MR1; MR3; MR4 và MR8. Kết quả đánh giá được trình bày trong các bảng sau: 109 109 Bảng 3.16. Hiệu lực trừ rệp sáp bột tua ngắn (Planococcus kraunhiae) của các chủng BR trong phòng thí nghiệm (Viện BVTV, 7/2010) Chủng (loài) Nồng độ (bt/ml) Số rệp (con) Hiệu lực trừ rệp sáp sau các ngày phun (%) 1 3 5 7 10 14 BR5 (B.bassiana) 1,1x107 50 0 0 14,6b 38,6a 54,6a 74,6a 0,55x107 50 0 0 14,6b 29,3b 50,6ab 68,6b 0,275x107 50 0 0 20,6a 25,3b 48,6b 60,6c CV % 6,9 4,2 2,7 2,0 BR11 (B.bassiana) 1,1x107 50 0 0 2,6b 16,6a 14,6b 24,6a 0,55x107 50 0 0 8,6a 7,3b 27,3a 17,3b 0,275x107 50 0 0 7,3ab 8,0b 10,6b 16,6b CV % 2,4 10,8 7,5 6,8 BR13 (B.bassiana) 1,1x107 50 0 0 5,3a 14,6a 27,3a 35,3a 0,55x107 50 0 0 4,6a 10,6a 21,3b 27,3b 0,275x107 50 0 0 3,3a 10,6a 19,3b 27,3b CV % 15,0 9,6 5,0 3,8 BR16 (P. cicadae) 1,1x107 50 0 0 10,6a 24,6a 32,6a 49,6a 0,55x107 50 0 0 7,3a 18,6b 30,6a 38,6a 0,275x107 50 0 0 7,3a 20,6ab 28,6a 36,6a CV % 15,7 5,4 3,7 2,9 Ghi chú: Trong phạm vi cột của mỗi chủng nấm, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05 Hiệu lực trừ rệp sáp bột tua ngắn của các chủng BR sau khi đã sơ tuyển bằng phản ứng enzyme ngoại bào cho kết quả như sau: Chủng BR5 trong điều kiện phòng thí nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp bột tua ngắn đạt kết quả rất cao, ở công thức nồng độ 1,1x107 bào tử/ml sau 14 ngày phun hiệu lực lần 1 đạt 74,6% và ở nồng độ 0,55x107 bào tử/ml đạt 68,6% và khi thử ở nồng độ 0,275x107 thì hiệu lực phòng trừ cũng đã đạt 60,6%. Chủng BR11 trong điều kiện phòng thí nghiệm ở cả 3 công thức thử 110 110 nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp tương đối thấp, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 24,6% ở công thức nồng độ 1,1x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm và hiệu lực thấp nhất chỉ đạt 16,6% ở công thức 0,275x107 bào tử/ml. Chủng BR13 trong điều kiện phòng thí nghiệm ở cả 3 công thức thử nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp đạt mức thấp, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 35,3% ở công thức nồng độ 1,1x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm và đạt thấp nhất là 27,3% . Từ kết quả này cho thấy, mặc dù chủng BR13 cho kết quả sinh hàm lượng enzyme ngoại bào cao nhưng chủng này được phân lập từ nguồn sâu đo hại vải tại Bắc Giang (một thí nghiệm đánh giá hiệu lực khác của chủng này trên sâu đo hại vải cho kết quả tỷ lệ ký sinh đạt 100% trong điều kiện phòng thí nghiệm), khi đánh giá trên rệp sáp hiệu lực ký sinh thấp, điều đó thể hiện tính chuyên hóa trên từng ký chủ. Chính vì thế khi tiến hành lựa chọn các chủng làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phòng trừ dịch hại cho từng đối tượng cần có những đánh giá trực tiếp trên từng đối tượng đó. Chủng BR16 trong điều kiện phòng thí nghiệm ở cả 3 công thức thử nghiệm thử nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp đạt mức trung bình thấp, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 49,6% ở công thức nồng độ 1,1x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm và đạt thấp nhất ở công thức 0,275x107 bào tử/ml là 36,6%. Tóm lại: Qua kết quả đánh giá độc lực sơ tuyển bằng khả năng sinh enzyme ngoại bào các chủng Beauveria bassiana lựa chọn được 4 chủng có tiềm năng nhất là BR5; BR11; BR13 và BR16. Sau đó tiến hành đánh giá độc lực trực tiếp trên cơ thể rệp sáp tua ngắn chúng tôi đã lựa chọn được chủng BR5 có hiệu lực phòng trừ rệp sáp tua ngắn cao nhất. Tiếp tục đánh giá hiệu lực của các chủng nấm Metarhizium anisopliae trên 2 loài rệp sáp là rệp sáp bột tua ngắn và rệp sáp mềm xanh, kết quả đánh giá được trình bày trong 2 bảng sau. 111 111 Bảng 3.17. Hiệu lực trừ rệp sáp tua ngắn (Planococcus kraunhiae) của các chủng thuộc loài Metarhizium anisopliae trong phòng thí nghiệm (Viện BVTV, 8/2010) Chủng Nồng độ (bt/ml) TP (con) Hiệu lực trừ rệp sáp sau các ngày phun (%) 1 3 5 7 10 14 MR1 1,47x107 50 0 0 7,3a 10,6a 19,3ab 24,6a 0,74x107 50 0 0 5,0a 12,6a 20,6a 21,3a 0,37x107 50 0 0 5,0a 12,6a 15,3b 20,6a CV % 3,0 9,6 7,2 6,0 MR3 1,47x107 50 0 0 3,3b 12,6a 24,6a 32,6a 0,74x107 50 0 0 3,3b 12,6a 19,3b 26,6b 0,37x107 50 0 0 5,3a 10,6a 18,6b 27,3b CV % 2,3 9,6 3,1 4,6 MR4 1,47x107 50 0 4,6a 17,3ab 39,3a 54,6ab 71,3a 0,74x107 50 0 2,6a 18,6a 36,6a 56,6a 69,3a 0,37x107 50 0 0,6a 15,3b 32,6b 50,6b 62,6b CV % 13,3 3,8 2,9 2,1 1,9 MR8 1,47x107 50 0 0 4,6a 17,3a 34,6a 49,3a 0,74x107 50 0 0 5,3a 13,3a 26,6b 40,6b 0,37x107 50 0 0 4,6a 14,6a 20,6c 33,3c CV % 7,2 8,8 4,2 3,2 Ghi chú: Trong phạm vi cột của mỗi chủng nấm, các chữ a, b, c... chỉ sự sai khác ở độ tin cậy P<0,05. Chủng MR1 trong điều kiện phòng thí nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp bột tua ngắn đạt mức thấp, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 24,6% ở công thức nồng độ 1,47x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm và hiệu lực đạt thấp nhất là 20,6% ở công thức 0,37x107 bào tử/ml. Chủng MR3 ở cả 3 công thức thử nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp bột tua ngắn đạt mức thấp, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 32,6% ở công thức 1,47x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm. Chủng MR4 ở cả 3 công thức thử nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp đều đạt 112 112 mức cao, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 71,3% ở công thức nồng độ 1,47x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm và ở công thức 0,37x107 bào tử/ml thì hiệu lực này cũng đã đạt 62,6% sau 14 ngày thử nghiệm. Chủng MR8 ở cả 3 công thức thử nghiệm hiệu lực trừ rệp sáp đạt mức trung bình thấp, hiệu lực này chỉ đạt cao nhất 49,3% ở công thức nồng độ 1,47x107 bào tử/ml sau 14 ngày thử nghiệm. Bảng 3.18. Hiệu lực trừ rệp sáp mềm xanh (Coccus viridis) của các chủng thuộc loài Metarhizium anisopliae trong phòng thí nghiệm (Viện BVTV, 7/2010) Lần thí nghiệm Nồng độ (bt/ml) TP (con) Hiệu lực trừ rệp sáp sau các ngày phun (%) 1 3 5 7 10 14 MR1 1,47x107 50 0 0 6,7a 12,6a 18,6a 26,6a 0,74x107 50 0 0 6,7a 10,6a 18,0a 20,6b 0,37x107 50 0 0 6,7a 12,6a 18,6a 23,3ab CV % 4,3 9,1 3,6 5,6 MR3 1,47x107 50 0 0 5,3a 12,6b 27,3a 34,6a 0,74x107 50 0 0 4,6a 16,6a 20,6b 29,3b 0,37x107 50 0 0 7,3a 11,3b 21,3b 32,6ab CV % 8,2 4,9 5,7 4,1 MR4 1,47x107 50 0 5,3a 18,6a 37,3a 55,3a