Luận án Nghiên cứu tác dụng điều hòa Lipid máu của chế phẩm từ bột sấy phun đài hoa của cây bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L., Malvaceae) trên chuột nhắt

c TP. Hồ Chí Minh. Thẩm định quy trình định lượng [64]: Khảo sát tính tương thích hệ thống: Ổn định cột bằng pha động ít nhất 30 phút. Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn với ít nhất 6 lần tiêm mẫu liên tiếp. Khảo 58 sát các thông số: Diện tích đỉnh, thời gian lưu, hệ số kéo đuôi AS, độ phân giải RS và số đĩa lý thuyết N. Yêu cầu: Tất cả các thông số trên phải có RSD ≤ 2%. Tính đặc hiệu: Đảm bảo kết quả xác định hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác, tránh ảnh hưởng của các thành phần khác có trong mẫu. Với kỹ thuật HPLC sử dụng đầu dò PDA để kiểm tra độ tinh khiết của pic, tiến hành sắc ký lần lượt mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu trắng. Yêu cầu: Thời gian lưu của pic chất cần định lượng trong mẫu thử phải tương đương với thời gian lưu của pic chất chuẩn tương ứng trong mẫu chuẩn. Đối với mẫu thử thêm chuẩn, chiều cao và diện tích pic của chất khảo sát phải tăng lên so với trước khi thêm chuẩn. Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời gian lưu của chất khảo sát. Phổ UV–Vis tại thời gian lưu của pic chất khảo sát trong mẫu thử giống phổ UV–Vis tại thời gian lưu của pic chất chuẩn tương ứng trong mẫu chuẩn. Tính tuyến tính: Khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích đỉnh và nồng độ là một đường thẳng. Tiến hành sắc ký tối thiểu 5 mức nồng độ khác nhau, đo và xác định diện tích đỉnh ở từng nồng độ. Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ. Phương trình hồi quy: ŷ = ax + b Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số: Nếu t0 < t0,05: Hệ số b không có ý nghĩa thống kê. Nếu t0 > t0,05: Hệ số b có ý nghĩa thống kê. Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình: Nếu F < F0,05: Phương trình hồi quy không tương thích. Nếu F > F0,05: Phương trình hồi quy tương thích. Yêu cầu: Hệ số tương quan R2 ≥ 0,995. Độ lặp lại: Mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẻ xi với giá trị trung bình. Ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên. Tiến hành sắc ký tối thiểu 6 mẫu 59 thử ở nồng độ 100%. Tiến hành xử lý thống kê các số liệu, xác định độ lệch chuẩn tương đối. Yêu cầu: RSD phải đạt theo yêu cầu. Độ đúng: Mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy so với giá trị thực. Ảnh hưởng bởi sai số hệ thống. Sử dụng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử, với nồng độ của mẫu chuẩn thay đổi 80%, 100%, 120% so với mẫu thử. Tiến hành sắc ký ở mỗi nồng độ trên với 3 mẫu khác nhau, tính hàm lượng của mẫu chuẩn thêm vào ở từng nồng độ, % tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ thêm vào (delphinidin-3-O-sambubiosid và cyanidin-3-O-sambubiosid). Tỷ lệ phục hồi = µ: Hàm lượng chất chuẩn cho vào. : Hàm lượng xác định được. Yêu cầu: Tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ phải đạt theo yêu cầu. Đánh giá độ ổn định của cốm Bụp giấm (Theo hướng dẫn ASEAN về nghiên cứu độ ổn định của thuốc 6.0, 2013) Thuốc được đóng gói kín với bao bì là màng nhôm PVDC trong suốt quá trình bảo quản và thử nghiệm. Nội dung: Theo dõi độ ổn định của 3 lô ở quy mô thử nghiệm. Tần số thử nghiệm: Ở điều kiện bảo quản cấp tốc, thử nghiệm ở 3 thời điểm: Ban đầu (T0), 3 tháng và 6 tháng. Nếu có “biến đổi đáng kể” nào xảy ra trong vòng 3 đến 6 tháng khi thử nghiệm ở điều kiện lão hóa cấp tốc, thì tuổi thọ dự kiến được dựa trên các số liệu thu được khi bảo quản ở điều kiện dài hạn. “Biến đổi đáng kể” đối với một chế phẩm thuốc là khi hàm lượng không đạt giới hạn cho phép hoặc không đạt các chỉ tiêu về hình thức, tính chất vật lý và các thử nghiệm chức năng. Nếu “biến đổi đáng kể” xảy ra trong vòng 6 tháng đầu của thử nghiệm ở điều kiện bảo quản cấp tốc thì dừng thử nghiệm ở điều kiện này. Đánh giá và báo cáo: Mỗi một chỉ tiêu cần đánh giá riêng biệt và đánh giá tổng thể để dự kiến tuổi thọ. Tuổi thọ dự kiến của sản phẩm không được vượt quá tuổi thọ dự đoán tính theo từng chỉ tiêu đơn lẻ. Tiến hành lập báo cáo, kết luận về độ ổn định của sản phẩm. %100x X  X 60 Hình 2.2. Hướng dẫn dự đoán tuổi thọ của thuốc theo ASEAN (2013) (https://vnras.com) Y es Y es N o No to (1) Or (2) No to (1) or (2) or both Yes to both No to (1) Or (2) Yes to both Y es Không ch (1) hoặc (2) Không cho (1) hoặc (2) hoặc cho cả hai Lập bảng hoặc vẽ biểu đồ dữ liệu độ ổn định cho tất cả chỉ tiêu chất lượng tại tất cả điều kiện bảo quản và đánh giá mỗi chỉ tiêu một cách độc lập Có sự biến đổi có ý nghĩa sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện cấp tốc? Có sự biến đổi có ý nghĩa sau 3 tháng bảo quản ở điều kiện cấp tốc? Dữ liệu dài hạn cho thấy: (1) ít biến đổi hoặc không biến đổi theo thời gian và (2) ít dao động hoặc không dao động? Dữ liệu cấp tốc cho thấy: (1) ít biến đổi hoặc không biến đổi theo thời gian và (2) ít dao động hoặc không dao động? Không ngoại suy; tuổi thọ ngắn hơn và có thể yêu cầu thêm dữ liệu độ ổn định khi vận chuyển; thực hiện phân tích thống kê nếu dữ liệu dài hạn cho thấy sự dao động Không ngoại suy; tuổi thọ ngắn hơn; thực hiện phân tích thống kê nếu dữ liệu dài hạn cho thấy sự dao động Dự kiến bảo quản trong tủ lạnh? (1) Dữ liệu dài hạn có thể đem phân tích thống kê và (2) phân tích thống kê đã được thực hiện? Không Không cho (1) hoặc (2) hoặc cho cả hai Không 1) Dữ liệu dài hạn có thể đem phân tích thống kê và (2) phân tích thống kê đã được thực hiện? Nếu được củng cố bởi dữ liệu hỗ trợ có liên quan: Y = tới X + 3 tháng Nếu được củng cố bởi phân tích thống kê và dữ liệu hỗ trợ có liên quan: Y = tới 1,5X, nhưng không quá X + 6 tháng C ó Phân tích thống kê thông thường là không cần thiết Y = tới 2X, nhưng không quá X + 12 tháng; hoặc nếu bảo quản trong tủ lạnh, Y = tới 1,5X, nhưng không quá X + 6 tháng Nếu được củng cố bởi phân tích thống kê và dữ liệu hỗ trợ có liên quan: Y = tới 2X, nhưng không quá X + 12 tháng; hoặc nếu bảo quản trong tủ lạnh, Y = tới 1,5X, nhưng không quá X + 6 tháng Nếu được củng cố bởi dữ liệu hỗ trợ có liên quan: Y = tới 1,5X, nhưng không quá X + 6 tháng; hoặc nếu bảo quản trong tủ lạnh, Y = tới X + 3 tháng Y = Tuổi thọ đề xuất X = Khoảng thời gian của dữ liệu thực Có cho cả hai Có cho cả hai Không Không cho (1) hoặc (2) Có cho cả hai Có cho cả hai Có Có 61 Bảng 2.2. Các chỉ tiêu thử nghiệm trong theo dõi độ ổn định Các chỉ tiêu thử Thử nghiệm theo Giới hạn cho phép Cảm quan TCCS Thuốc có dạng hạt nhỏ xốp hay sợi ngắn xốp, khô, đồng đều về hình dạng và màu sắc, không có hiện tượng hút ẩm. Độ ẩm TCCS < 5 % Định lượng TCCS 90% - 110% so với hàm lượng ban đầu Bảng 2.3. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc Điều kiện bảo quản (Lão hóa cấp tốc) Khoảng thời gian thử (tháng) Ban đầu 3 6 40 oC ± 2 oC RH 75% ± 5% X X X Bảng 2.4. Theo dõi độ ổn định ở điều kiện thường Điều kiện bảo quản (Điều kiện dài hạn) Khoảng thời gian thử (tháng) Ban đầu 6 12 30 oC ± 2 oC X X X 2.3.3. Khảo sát tác dụng của cốm Bụp giấm trên một số gen điều hòa chuyển hóa lipid Khảo sát nồng độ gây độc tế bào của cốm Bụp giấm trên Hep G2 [12], [69] Mục tiêu: Xác định nồng độ cao nhất của cốm Bụp giấm (BG) không gây chết Hep G2 để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Phương pháp thực hiện là SRB (Sulforhodamin B) với chứng (+) là Camptothecin, chứng (-) là tế bào chỉ nuôi trong môi trường không có chất thử nghiệm, đối chứng là mẫu cảm ứng với dung môi pha mẫu ở nồng độ tương đương với mẫu. 62 Thử nghiệm SRB (Sulforhodamin B) là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu. Dòng tế bào Hep G2 do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy trong môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamin (2 mM), HEPES (20 mM), amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100 μg/ml), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37 0C, 5% CO2. Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế bào/giếng. Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung dịch trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch Sulforhodamin B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai bước sóng 492 nm và 620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Xử lý kết quả: Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD492 và OD620): -Tính giá trị OD = OD492 - OD620 (1) -Tính OD492 (hoặc OD620) = ODtb - ODblank (2) -Tính tỉ lệ (%) gây độc tế bào theo công thức: Với: 63 - ODtb: giá trị OD của giếng có chứa tế bào - ODblank: giá trị OD của giếng blank (không có tế bào) - ODTN: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2) - ODC: giá trị OD của mẫu chứng tính từ công thức (1) và (2) IC50 được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Prism với phương pháp hồi quy không tuyến tính đa thông số và R2 > 0.9. Mẫu cốm Bụp giấm (BG) được pha trong nước ở nồng độ 50 mg/ml, sau đó ly tâm bỏ cặn rồi lọc qua phin lọc 0,2 µm, nồng độ tính theo nồng độ của cao chiết (0,15 g BSP/gói 2 g). Mẫu Lipistad - atorvastatin (LP) được pha trong nước ở nồng độ 10 mg/ml, sau đó ly tâm bỏ cặn rồi lọc qua phin lọc 0,2 µm. Nồng độ tính theo nồng độ của cao chiết (20 mg atorvastatin/viên 0,31g). Đánh giá sự tác động của cốm Bụp giấm lên biểu hiện gen LDLR, SREBP2, HMGcoA Reductase, AMPK Bảng 2.5. Trình tự các nucleotid của các mồi (primer) TT Gen Mồi Trình tự Kích thước 1 LDLR Mồi xuôi GTCTTGGCACTGGAACTCGT 94 Mồi ngược CTGGAAATTGCGCTGGAC 2 SREBP-1 Mồi xuôi GCAAGGCCATCGACTACATT 188 Mồi ngược GGTCAGTGTGTCCTCCACCT 3 HMGcoA- reductase Mồi xuôi GGGAACCTCGGCCTAATGAA 156 Mồi ngược CACCACGCTCATGAGTTTCCA 64 4 SREBP-2 Mồi xuôi AGCAGTGGGACCATTCTGAC 236 Mồi ngược TTCCTCAGAACGCCAGACTT Tế bào Hep G2 được phủ lên đĩa nuôi cấy 100 mm với mật độ 1,7x106 tế bào/ đĩa. Sau 24 h nuôi, tế bào được cảm ứng với BG nồng độ 1000 µg/ml, LP 10 µg/ml, phối hợp BG + LP ở nồng độ 250/2,5 µg/ml và với đối chứng tế bào cảm ứng với nước nồng độ 2%. Sau 24 h và 48 h, tế bào được thu nhận. RNA tổng số được tách chiết bằng kít SV Total RNA Isolation System (Promega, Z3100) theo hướng dẫn của kít. RNA được chuyển thành cDNA bằng kít SensiFAST cDNA Synthesis Kit (Bioline, BIO-65054) theo hướng dẫn của kít. Phản ứng PCR được thiết lập như sau: Mồi 440 nM (PDH Bio), Master mix 1X(Solgent) Evagreen 0,25X (GAPDH, SREBP-2) hoặc 0,125X (LDLR) (Biotium), cDNA 1 µg. Chu trình nhiệt: 95 oC – 5 phút, lặp lại 45 chu kì của các bước 95 oC-30s, 57 oC-30s, 72 oC-30s, và 72 oC – 5 phút. Phân tích đường cong nóng chảy từ 65 oC – 95 oC, 10 giây/1 oC. Gen chứng nội là GAPDH. Số lần thay đổi biểu hiện tương đối được tính theo công thức 2-∆∆Ct. 2.3.4. Đánh giá tác dụng điều hòa rối loạn lipid máu và tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng Đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt tăng lipid máu nội sinh bằng tyloxapol Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước. Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL). Tiến hành tiêm phúc mô (i.p.) tyloxapol 500 mg/kg, 0,1 ml/10 g cho tất cả chuột [99]. Định lượng triglycerid máu sau 6 giờ tiêm tyloxapol, chọn những chuột có triglycerid máu tăng 3 - 5 lần so với ban đầu và chia ngẫu 65 nhiên thành 3 lô (n = 10): (1) Lô không điều trị (bệnh lý) uống nước cất, (2) lô chứng dương: Uống fenofibrat 50 mg/kg, (3) lô thử nghiệm uống cốm Bụp giấm liều tối ưu. Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, fenofibrat hoặc cốm BG vào 16 giờ chiều và 8 giờ sáng với thể tích 0,1 ml/10 g chuột (trong 24 giờ sau khi tiêm tyloxapol). Định lượng nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) bằng phương pháp đo quang sau 48 giờ tiêm tyloxapol. Tiến hành cân, kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trước và sau thí nghiệm. Thống kê, phân tích số liệu, đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của cốm BG trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu bằng tyloxapol. Phương pháp định lượng các thông số lipid máu: Máu chuột thử nghiệm được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc hiệu trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu. Đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt tăng lipid máu ngoại sinh bằng dung dịch giàu lipid Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước. Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL). Sau đó, được cho uống dung dịch giàu lipid (cholesterol 25 mg, acid cholic 1%, dầu thực vật vđ 10 ml) mỗi ngày với thể tích 0,1 ml/10g chuột trong 8 tuần. Lấy máu chuột xét nghiệm lại các thông số lipid, chọn những chuột bị rối loạn lipid máu (có triglycerid và/hoặc LDL tăng có ý nghĩa thống kê so với ban đầu) chia ngẫu nhiên thành 3 lô (n = 8): (1) lô không điều trị (bệnh lý) uống nước cất, (2) lô chứng dương uống atorvastatin 10 mg/kg, (3) lô thử nghiệm uống cốm Bụp giấm liều tối ưu. 66 Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, atorvastatin hoặc cốm BG vào 15 - 16 giờ chiều hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g chuột trong 1 tuần. Định lượng nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) bằng phương pháp đo quang sau 1 tuần điều trị. Tiến hành cân, kiểm tra trọng lượng chuột ở tất cả các lô tại thời điểm trước và sau thí nghiệm. Thống kê, phân tích số liệu, đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của cốm BG trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu bằng dung dịch giàu lipid. Phương pháp định lượng các thông số lipid máu: Máu chuột thử nghiệm được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc hiệu trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu. Đánh giá tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu của cốm Bụp giấm trên mô hình tăng lipid máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu lipid Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước. Dung dịch giàu lipid dùng để gây mô hình chứa cholesterol 25 mg, acid cholic 1%, dầu thực vật vừa đủ 10 ml. Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng và xét nghiệm các thông lipid máu ban đầu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL). Sau đó, chia ngẫu nhiên chuột thử nghiệm thành 4 lô (n = 8): (1) cho uống nước cất sáng, chiều (lô chứng), (2) cho uống dung dịch giàu lipid buổi sáng, nước cất buổi chiều (lô bệnh lý), (3) cho uống dung dịch giàu lipid buổi sáng, atorvastatin 10 mg/kg buổi chiều (lô đối chứng), (4) cho uống dung dịch giàu lipid buổi sáng, cốm BG liều tối ưu buổi chiều (lô thử nghiệm). Chuột thử nghiệm được cho uống nước cất, atorvastatin hoặc cốm BG vào 15 - 16 giờ chiều hàng ngày với thể tích 0,1 ml/10 g chuột trong 6 tuần. Định lượng nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) bằng phương pháp đo quang. Tiến hành cân, kiểm tra trọng lượng chuột ở tất 67 cả các lô tại thời điểm trước và sau thí nghiệm. Thống kê, phân tích số liệu, đánh giá tác dụng dự phòng rối loạn lipid máu của cốm BG trên chuột nhắt gây rối loạn lipid máu bằng dung dịch giàu lipid. Phương pháp định lượng các thông số lipid máu: Máu chuột thử nghiệm được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc hiệu trước khi đo quang xác định hàm lượng lipid máu. Đánh giá tác dụng dự phòng gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD) của cốm Bụp giấm [49], [66] Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) ở mức liều chứa lượng BSP được xác định là liều tối ưu có tác dụng ở thí nghiệm trước. Chất gây mô hình: Hỗn hợp giàu lipid được chuẩn bị gồm các thành phần sau: Cholesterol 25 mg, acid cholic 1%, dầu dừa 20 ml, NaCMC 1% được sử dụng làm chất nhũ hóa. Thuốc đối chiếu: Atorvastatin 10 mg/kg chuột. Chuột thử nghiệm sau khi nuôi ổn định 1 tuần được cân trọng lượng, loại khỏi thí nghiệm những chuột có cân nặng hoặc biểu hiện bất thường. Chia chuột ngẫu nhiên làm 4 lô (n = 7). Lô 1 cho uống nước cất sáng, chiều trong suốt thời gian thử nghiệm, chế độ ăn bình thường. Các lô chuột còn lại được cho uống dung dịch giàu lipid trong 4 tuần. Buổi chiều, lô 2 uống atorvastatin (Ator) 10 mg/kg, lô 3 uống cốm Bụp giấm (BG) liều tối ưu, lô 4 uống atorvastatin kết hợp với cốm Bụp giấm. Thể tích sử dụng ở tất cả các lô là 10 ml/kg chuột. Cuối thí nghiệm, xét nghiệm các thông số lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL), enzym gan (AST, ALT), glucose huyết tương, lấy mẫu gan soi vi thể xác định mức độ thoái hóa mỡ. Phương pháp định lượng các thông số sinh hóa máu: Máu chuột thử nghiệm được lấy từ tĩnh mạch đuôi, sau đó đem ly tâm lấy huyết tương ở 3000 vòng trong 15 phút, nhiệt độ phòng. Huyết tương được ủ với thuốc thử đặc 68 hiệu trước khi đo quang xác định sinh hóa máu. Chuột ở cuối thử nghiệm được gây mê bằng đá CO2, lấy mẫu gan bảo quản trong dung dịch formol 10%, cắt nhuộm soi vi thể. 2.3.5. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng Đánh giá độc tính cấp của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng [3], [4] Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt đực trắng chủng Swiss albino, 6 - 8 tuần tuổi, trọng lượng 18 - 22 g, đực và cái được cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, được nuôi ổn định 1 tuần trước thí nghiệm. Điều kiện thí nghiệm: Thuốc thử nghiệm cốm Bụp giấm được hòa vào trong nước cất. Dụng cụ thí nghiệm gồm kim đầu tù để cho uống, dụng cụ mổ, dụng cụ pha thuốc. Đường dùng thuốc là đường uống (p.o.). Thể tích dùng thuốc 20 ml/kg thể trọng. Dùng một lần thuốc duy nhất trong một ngày trong khoảng thời gian từ 8 - 9 giờ sáng. Phương pháp thử: Để thăm dò liều ban đầu, phải thực hiện qua 2 giai đoạn: (1) giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều là 6 chuột, 50% đực, 50% cái), (2) giai đoạn xác định (mỗi lô 10 - 20 chuột, 50% đực, 50% cái). Mỗi nhóm dùng một liều tính theo kg thể trọng, bắt đầu từ liều tối đa có thể cho chuột thử nghiệm uống và giảm dần. Theo dõi các lô thật chặt chẽ trong 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc. Sau đó nếu thấy cần thiết thì theo dõi trong suốt 2 tuần tiếp theo. Kết quả được đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hoặc bất ứng (sống hay chết) nhận thấy được ở mỗi chuột trong nhóm. Ghi nhận các biểu hiện độc và mức độ nghiêm trọng: Sự xuất hiện độc tính, tiến triển và phục hồi hoặc chết qua từng thời gian của từng nhóm. Các con vật chết trong thời gian quan sát (nếu có), phải mổ xác xem chết do nguyên nhân gì. Những con vật còn sống sau thời gian theo dõi cũng nên mổ để xem các phủ tạng và cơ quan trong cơ thể có những thay đổi bất thường gì không. Xét nghiệm đại thể ngay sau khi chết đối với chuột bị chết và làm xét nghiệm đại thể sau khi kết thúc 69 thử nghiệm đối với súc vật còn sống. Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Karber-Behrens. Đánh giá độc tính bán trường diễn của cốm Bụp giấm trên chuột nhắt trắng (Theo hướng dẫn: General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine – WHO). Thuốc nghiên cứu: Cốm Bụp giấm (BG) được pha trong nước cất. Chuột được nuôi ổn định 1 tuần trước khi tiến hành thử nghiệm, tiến hành xét nghiệm các thông số sinh hóa và huyết học ban đầu, những chuột có thông số xét nghiệm bất thường sẽ bị loại khỏi nghiên cứu. Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng đạt yêu cầu thành 4 lô, mỗi lô 20 con (10 đực, 10 cái), cho uống với thể tích 0,1 ml/10 g thể trọng vào lúc 8 – 9 giờ sáng, liên tục 12 tuần. Các lô thử nghiệm: (1) lô chứng uống nước cất, (2) lô thử 1 uống thuốc cốm liều tối ưu, (3) lô thử 2 uống thuốc cốm liều gấp đôi liều lô thử 1, (4) lô thử 3 uống thuốc cốm liều gấp 10 lần liều tối ưu. Các thông số đánh giá hàng tuần: Hành vi (tăng đi lại, giảm đi lại, nằm im, run rẩy, co giật); lông (mượt, rụng...), biểu hiện của các cơ quan; cân nặng, tính chất phân, nước tiểu. Mức độ ăn, uống được đánh giá tại thời điểm ban đầu, sau 6 tuần và sau 12 tuần bằng cách nhốt riêng mỗi chuột vào lồng chuyển hóa, cho chuột làm quen lồng trong ngày thứ nhất, cân lượng cám và lượng nước uống đã sử dụng trong 24 giờ tiếp theo. Sau 6 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu đuôi chuột và xét nghiệm đánh giá các thông số: Sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết học (số lượng hồng cầu - RBC, hematocrit - HCT, hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung bình - MCH, nồng độ hemoglobin trung bình - MCHC, thể tích trung bình của hồng cầu - MCV, số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu - PLT). 70 Sau 12 tuần thử nghiệm, tiến hành lấy máu đuôi chuột và xét nghiệm đánh giá các thông số: Sinh hóa (AST, ALT, cholesterol toàn phần, triglycerid máu, creatinin huyết, acid uric, glucose), huyết học (số lượng hồng cầu - RBC, hematocrit - HCT, hemoglobin - HGB, số lượng hemoglobin trung bình - MCH, nồng độ hemoglobin trung bình - MCHC, thể tích trung bình của hồng cầu - MCV, số lượng bạch cầu - WBC, số lượng tiểu cầu - PLT). Gây mê, mổ quan sát các cơ quan gan, thận, tim, lách, phổi, dạ dày, ruột. Xét nghiệm vi thể gan, thận (lấy ngẫu nhiên 50% số động vật). Cân trọng lượng gan, thận, lách chuột xác định: - Chỉ số trọng lượng gan = Trọng lượng gan / trọng lượng cơ thể chuột x 100%. - Chỉ số trọng lượng thận = Trọng lượng thận / trọng lượng cơ thể chuột x 100%. - Chỉ số trọng lượng lách = Trọng lượng lách / trọng lượng cơ thể chuột) x 100%. 2.4. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Dùng phép kiểm Mann Whitney một chiều một yếu tố so sánh sự khác biệt giữa các lô và Wilcoxon signed-rank so sánh sự khác biệt đầu - cuối trong cùng một lô, phần mềm STADA và Microsoft Excel 2017 để thống kê dữ liệu và vẽ đồ thị. 71 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ 3.1. Xác định liều có tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa của cây Bụp giấm Bảng 3.1. Nồng độ lipid máu của các lô thử nghiệm tại thời điểm ban đầu Lô (n = 6) Cholesterol TP (mg/dl) Triglycerid (mg/dl) HDL (mg/dl) LDL (mg/dl) Bệnh lý 81,81 ± 6,03 99,12 ± 5,96 44,88 ± 7,87 17,11 ± 5,40 Fibrat 50 mg/kg 81,76 ± 7,03 98,74 ± 10,61 44,91 ± 9,65 17,10 ± 4,29 BSP 15 mg/kg 81,07 ± 4,46 98,28 ± 10,09 44,39 ± 9,18 17,03 ± 6,49 BSP 30 mg/kg 82,53 ± 6,21 98,15 ± 18,51 44,27 ± 7,41 18,63 ± 5,71 BSP 45 mg/kg 82,22 ± 8,99 98,19 ± 16,02 44,33 ± 5,44 18,25 ± 8,91 BSP 60 mg/kg 83,63 ± 11,19 97,01 ± 13,82 44,43 ± 6,87 19,80 ± 12,26 BSP 75 mg/kg 82,11 ± 12,33 97,64 ± 12,52 44,06 ± 11,11 18,53 ± 6,21 BSP 90 mg/kg 82,40 ± 9,69 98,28 ± 16,28 44,13 ± 9,75 18,61 ± 5,46 Nồng độ lipid máu (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL, LDL) giữa các lô tại thời điểm ban đầu khi đưa vào thử nghiệm khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như vậy, chỉ số ban đầu của các chuột được đưa vào trong thử nghiệm là đồng đều và sẽ không ảnh hưởng đến kết quả được đánh giá sau khi điều trị. 72 Tất cả các chuột được đưa vào thí nghiệm đều có nồng độ triglycerid máu sau 6 giờ tiêm tyloxapol tăng gấp 3 - 5 lần, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) so với nồng độ triglycerid ban đầu. Nồng độ triglycerid máu giữa các lô sau 6 giờ tiêm tyloxapol khác biệt nhau không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Chỉ số triglycerid giữa các lô vào thời điểm trước khi dùng thuốc là đồng nhất. Việc này giúp hạn chế sai số do ảnh hưởng của mức độ gây bệnh ban đầu giữa các lô. Sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ: Ở lô bệnh lý không được điều trị, sau khi tiêm tyloxapol 48 giờ so với thời điểm ban đầu, cho