Luận án Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm a/h5n1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

ích thƣớc khoảng 2350 bp; sản phẩm phản ứng nhân gen PA chỉ có 1/3 mẫu nhân bản đƣợc phân đoạn gen khoảng 2250 bp. Bên cạnh đó, phân đoạn gen NP có 2/3 mẫu nhân bản thành công gen kích thƣớc khoảng 1500 bp. Hai phân đoạn gen có kích thƣớc nhỏ nhất trong genome virus cúm - phân đoạn M và NS - cho tỷ lệ thành công khi thực hiện RT-PCR cao nhất: 3/3 mẫu đều có sự nhân bản thành công một băng vạch sáng kích thƣớc khoảng 1050 bp (phân đoạn M) và 900 bp (phân đoạn NS). So sánh kích thƣớc của từng phân đoạn gen đƣợc nhân bản trong 6 phản ứng RT-PCR với kích thƣớc 6 phân đoạn gen khung của chủng PR8 trên ngân hàng NCBI nhận đƣợc kết quả: Các kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc của 6 gen khung của chủng PR8 (gen PB2 và PB1 có kích thƣớc 2341 nucleotide; gen PA - 2233 nucleotide; gen NP - 1565 nucleotide; gen M - 1027 nucleotide, và gen NS - 890 nucleotide). Kết quả nhận đƣợc khẳng định: Các mẫu vRNA tổng số với chất lƣợng tốt, không bị đứt gãy đã cho phép chuyển hóa trình tự nucleotide của các phân đoạn vRNA thành cDNA, đặc biệt với các phân đoạn gen có kích thƣớc khá lớn (trên 2 kb) nhƣ PB2, PB1 và PA; mồi Uni12 và chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR thích hợp cho nhân bản sáu gen khung của virus cúm A. 3.1.2.2. Dòng hóa sản phẩm RT-PCR vào plasmid pBT Yêu cầu của thí nghiệm tách dòng plasmid mang 6 phân đoạn cDNA khung của virus PR8 là các phân đoạn gen đích phải đảm bảo có trình tự nulcleotide với kích thƣớc đủ, không bị đột biến. Sản phẩm phản ứng RT-PCR hai bƣớc đã nhân bản đƣợc sáu phân đoạn gen khung có kích thƣớc đúng theo tính toán lý thuyết, tuy nhiên, tính đầy đủ và không bị biến đổi của các trình tự cần phải đƣợc kiểm tra, trên cơ sở đó chọn lọc sáu phân đoạn cDNA đáp ứng yêu cầu cung cấp nguồn gen khung cho tái tại chủng virus ứng viên. Để thực hiện mục tiêu dòng hóa và xác định trình tự nucleotide các gen quan tâm, luận án sử dụng plasmid pBT có đặc điểm: Mang gen kháng ampicillin và gen lacZ, giúp quá trình chọn lọc đƣợc chính xác và dễ dàng; có kích thƣớc nhỏ nên thuận lợi cho tách dòng và xác định trình tự gen đích. 68 Các băng vạch - sản phẩm phản ứng RT-PCR tƣơng ứng với sáu gen khung - trên bản điện di đƣợc cắt, thôi gel và tinh sạch gen. Các mẫu chứa sản phẩm RT- PCR đã kiểm tra đảm bảo chất lƣợng về nồng độ và độ tinh sạch (Phụ lục 02) đƣợc ghép nối vào plasmid pBT, biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α và cấy trải trên môi trƣờng LB bổ sung kháng sinh chọn lọc, X-gal và IPTG. Các khuẩn lạc trắng, mọc riêng rẽ (có khả năng mang plasmid tái tổ hợp) đƣợc thu nhận và kiểm tra nhanh sự có mặt của plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng conoly-PCR. Trong số các phƣơng pháp xác định kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn nhƣ: Tách DNA plasmid và cắt bằng enzyme, tách DNA plasmid và nhân bản gen đích bằng PCR ..., phƣơng pháp conoly-PCR có ƣu điểm là nhanh thu đƣợc kết quả, các thao tác thực nghiệm đơn giản, ít tốn kém và kết quả khá chính xác. Phản ứng conoly-PCR đƣợc tiến hành với 2 loại mồi là mồi đặc hiệu gen (cho phép nhân bản toàn bộ trình tự nucleotide của phân đoạn gen đích) và mồi pUC18 bắt cặp trên plasmid pBT (nhân bản toàn bộ gen đích và một phần trình tự nucleotide của plasmid pBT ở hai đầu gen đích). Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR trên gel agarose 1,5% (Hình 3.3) cho kết quả: Các dòng khuẩn tạo khuẩn lạc trắng mọc trên môi trƣờng chọn lọc (tƣơng ứng với sáu phân đoạn gen) khi đƣợc lựa chọn kiểm tra đều cho kết quả dƣơng tính với plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai. Cụ thể, trên đĩa cấy trải tế bào E. coli DH5α biến nạp plasmid pBT-PB2, lựa chọn ngẫu nhiên 4 dòng (clon) khuẩn lạc trắng, to, tròn, mọc riêng rẽ, ký hiệu cl1, cl2, cl3 và cl4 để conoly-PCR. Kết quả của phản ứng nhân gen PB2 bằng mồi đặc hiệu gen của cả 4 dòng khuẩn đều xuất hiện 1 băng vạch sáng rõ, kích thƣớc khoảng 2350 bp và phù hợp với kích thƣớc tính toán theo lý thuyết của gen PB2: Bằng tổng kích thƣớc của gen PB2 ở chủng PR8 (2341 bp) và 29 bp đƣợc gắn thêm ở hai đầu 5’ của hai mồi đặc hiệu gen. Bên cạnh đó, khi nhân gen PB2 bằng mồi đặc hiệu plasmid (pUC18) cho băng vạch duy nhất có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc sản phẩm PCR khi nhân với mồi đặc hiệu gen khoảng 150 bp - phù hợp với lý thuyết: Xác định trình tự gen bằng mồi đặc hiệu plasmid pUC18 cho kích thƣớc băng vạch đích bằng kích thƣớc gen cộng thêm 164 bp. 69 A B C D E F Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang sáu phân đoạn gen khung, sử dụng cặp mồi đặc hiệu của từng phân đoạn gen và cặp mồi bắt cặp trên plasmid Chi chú: M1 - Marker HighRanger 1kb DNA Ladder; M - Marker 1kb (Fermentas) A. Phân đoạn PB2 có4 dòng khuẩn lạc biến nạpplasmid pBT-PB2 (cl1, cl2, cl3, cl4) B. Phân đoạn PB1 có4 dòng khuẩn dƣơng tính với pBT-PB1 (cl1, cl2, cl3, cl4) C. Phân đoạn PA chọn lọc đƣợc2 dòng khuẩn dƣơng tính với pBT-PA (cl1, cl2) D. Phân đoạn NP có 3 dòng khuẩn lạc dƣơng tính với pBT-NP (cl1, cl2, cl3) E. Phân đoạn M có 3 dòng khuẩn dƣơng tính với plasmid pBT-M (cl1, cl2, cl3) F. Phân đoạn NS chọn lọc đƣợc 2 dòng khuẩn dƣơng tính với plasmid pBT-NS (cl1, cl2) Kết quả tƣơng tự cũng nhận đƣợc khi kiểm tra sản phẩm conoly-PCR của các dòng khuẩn lạc biến nạp các plasmid pBT đã đƣợc gắn các phân đoạn gen khung PB1, PA, NP, M và NS. Sản phẩm conoly-PCR của các dòng khuẩn cũng đều xuất hiện một băng vạch đặc hiệu có kích thƣớc phù hợp với kích thƣớc tính theo lý thuyết khi nhân với mồi đặc hiệu của từng gen và mồi đặc hiệu plasmid. Cụ thể, khi nhân gen đích với mồi đặc hiệu của từng phân đoạn gen, sản phẩm conoly-PCR của các phân đoạn gen có kích thƣớc trong khoảng: Gen PB2 - 2350 bp; gen PA - 2250bp; gen NP - 1600 bp; gen M - 1050 bp; gen NS - 900 bp. Bên cạnh đó, các 70 phân đoạn gen đích PB1, PA, NP, M và NS đều có sản phẩm PCR khi nhân gen với mồi đặc hiệu plasmid là băng vạch duy nhất có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc băng vạch trong phản ứng nhân gen với mồi đặc hiệu gen khoảng 150 bp. 3.1.2.3. Chọn dòng sáu phân đoạn gen khung có kích thước đủ và trình tự nucleotide không bị đột biến DNA plasmid của các dòng khuẩn dƣơng tính với phản ứng conoly-PCR đƣợc tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự nucleotide gen đích (theo cả chiều xuôi và chiều ngƣợc) với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid. Kết quả về trình tự nucleotide đƣợc so sánh để xác định trình tự đầy đủ và đúng của từng gen. Trên cơ sở về trình tự nucleotide của từng gen đã nhận đƣợc, tiến hành so sánh với trình tự nucleotide của phân đoạn gen tƣơng ứng ở virus PR8 trong ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI. Kết quả về trình tự nucleotide đƣợc chuyển sang trình tự amino acid và so sánh có hay không sự sai khác về trình tự amino acid của từng gen trong plasmid đã tách dòng với trình tự amino acid đầy đủ đảm bảo thực hiện chức năng của các gen từ chủng PR8. Kết quả so sánh về trình tự nucleotide và amino acid để làm cơ sở cho chọn dòng plasmid trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy: Tƣơng ứng với mỗi phân đoạn gen khung, đều chọn lọc đƣợc 1 - 3 dòng khuẩn mang cDNA có trình tự nucleotide mã hóa trình tự amino acid khộng thay đổi (giống 100%) so với trình tự của các gen khung của virus PR8 trong NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore). Số lƣợng các dòng khuẩn chuyển nạp plasmid tái tổ hợp mang gen quan tâm có trình tự nucleotide không thay đổi so với trình tự gen tƣơng ứng của chủng PR8 nhƣ sau: Gen PB2 - 2 dòng; gen PB1 - 3 dòng; gen PA - 1 dòng; gen NP - 2 dòng; gen M - 2 dòng và gen NS - 2 dòng. Bên cạnh các dòng mang gen đích có trình tự nucleotide không thay đổi so với virus PR8, có một số dòng có trình tự nucleotide xuất hiện đột biến nhỏ liên quan đến 1 bp trên gen, có thể dẫn đến sự thay đổi 1 amino acid của protein do gen mã hóa hoặc không thay đổi về trình tự amino acid (trƣờng hợp thay đổi nucleotide nhƣng bộ ba nucleotide thay đổi vẫn mã hóa cùng một amino acid). Sự biến đổi này có khả năng xuất phát từ các đột biến điểm xảy ra trong hệ 71 genome của quần thể virus NIBRG-14 trong dịch niệu trứng, và là kết quả của sai sót xảy ra trong sao chép genome của phức hợp polymerase - RdRp - của virus cúm A (loại virus điển hình về khả năng tiến hóa nhanh, dễ biến đổi di truyền và xuất hiện đột biến điểm trong quá trình sao chép genome do polymerase khi hoạt động có tần số xuất hiện đột biến cao). Bảng 3.1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen khung đã phân lập với các gen tƣơng ứng của chủng PR8 Gen Ký hiệu dòng khuẩn lạc Kích thƣớc gen (nucleotide) Vị trí thay đổi so với trình tự gen tƣơng ứng của chủng PR8 Vị trí nucleotide thay đổi Vị trí amino acid thay đổi PB2 cl1 2341+29 T1855C F619L cl2 KTĐ KTĐ cl3 KTĐ KTĐ cl4 A1574G E525G PB1 cl1 2341+29 KTĐ KTĐ cl2 T290C L97S cl3 KTĐ KTĐ cl4 KTĐ KTĐ PA cl1 2233+29 G861A, T1879C W627R cl2 KTĐ KTĐ NP cl1 1565+29 G567A KTĐ cl2 KTĐ KTĐ cl3 KTĐ KTĐ M cl1 1027+29 KTĐ KTĐ cl2 C395T T132I cl3 KTĐ KTĐ NS cl1 890+29 KTĐ KTĐ cl2 KTĐ KTĐ KTĐ: Không thay đổi; 29: Các nucleotide thiết kế thêm ở hai đầu của mồi nhân gen trong phản ứng PCR (chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn BsmBI/BsaI) Để tạo bộ plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung có trình tự nucleotide đầy đủ và không thay đổi so với các trình tự gen khung của virus PR8, lựa chọn tƣơng ứng với mỗi gen khung một dòng DNA plasmid có trình tự nucleotide của gen đích giống 100% so với phân đoạn gen khung tƣơng ứng của 72 virus PR8 để dòng hóa vào plasmid pHW2000. 3.1.3. Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 Sáu plasmid pBT tái tổ hợp mang riêng rẽ sáu phân đoạn gen khung (không bị đột biến, nguồn gốc từ chủng PR8) đã đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn để thu nhận sáu phân đoạn gen khung. Song song với phản ứng cắt plasmid pBT, tiến hành cắt mở vòng plasmid pHW2000 bằng BsmBI. Trong bƣớc tiếp theo, sáu phân đoạn gen khung đƣợc gắn riêng rẽ vào plasmid pHW2000 trong sáu phản ứng ghép nối với sự xúc tác của T4 ligase. Các thao tác thí nghiệm trong giai đoạn này đƣợc sơ đồ hóa trong Hình 3.4. Hình 3.4. Dòng hóa các phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus PR8 vào plasmid pHW2000 Sáu phân đoạn cDNA mã hóa các protein tạo bộ khung virus cúm A trong plasmid pBT đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp cắt plasmid pBT tái tổ hợp bằng enzyme (BsmBI/BsaI). Vị trí cắt của enzyme đã đƣợc thiết kế ở hai đầu gen (trên mồi đặc hiệu để nhân gen trong phản ứng RT- PCR). Sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose để thu nhận gen và ghép nối vào plasmid pHW2000 đã đƣợc cắt mở vòng bằng BsmBI 73 3.1.3.1. Dòng hóa sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 Sản phẩm cắt của sáu phản ứng cắt sáu plasmid pBT tái tổ hợp bằng enzyme đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2%. Kết quả thể hiện ở Hình 3.5. . Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen khung bằng enzyme giới hạn Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas); M1: Marker High Ranger 1kb DNA Ladder A. Gen PB2 (PB2-K: Plasmid pBT-PB2 không cắt; PB2-C: Sản phẩm cắt pBT-PB2) B. Gen PB1 (PB1-K: Plasmid pBT-PB1 không cắt; PB1-C: Sản phẩm cắt pBT-PB1) C. Gen PA (PA-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-PA; PA-K: Plasmid pBT-PA không cắt) D. Gen NP (NP-K: Plasmid không cắt với enzyme; NP-C: Sản phẩm cắt pBT-NP) E. Gen M (M-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-M; M-K: Plasmid pBT-M không cắt) F. Gen NS (NS-K: Plasmid pBT-NS không cắt; NS-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-NS) Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pBT tái tổ hợp mang cDNA của phân đoạn PB2 tạo 2 băng rõ nét (Hình 3.5A): Băng thứ nhất (định vị phía trên bản gel) có kích thƣớc khoảng 2,7 kb - đúng với kích thƣớc lý thuyết của plasmid pBT, băng thứ hai kích thƣớc khoảng 2,35 kb tƣơng ứng với kích thƣớc gen PB2. Sản phẩm cắt các plasmid pBT-PA (Hình 3.5C), pBT-NP (Hình 3.5D), pBT-M (Hình 3.5E) và pBT-NS (Hình 3.5F) cũng tạo 2 băng vạch phân bố rõ ràng trên bản 74 gel: Băng thứ nhất cũng với kích thƣớc 2,7 kb - tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pBT; băng thứ hai phù hợp với kích thƣớc lý thuyết của từng phân đoạn gen - đối chiếu với marker, các băng tƣơng ứng với từng gen có kích thƣớc trong khoảng: Gen PA: 2,25 kb; gen NP: 1,6 kb; gen M: 1,05 kb, và gen NS: 0,9 kb. Plasmid pBT- PB1 cắt bằng BsmBI (Hình 3.5B) tạo 4 băng vạch phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản điện di với kích thƣớc khoảng: 2,7 kb, 2,35 kb, 1,75 kb và 0,6 kb. Sự xuất hiện 4 băng vạch trong sản phẩm cắt pBT-PB1 là do trình tự gen PB1 nguồn gốc từ virus PR8 chứa 1 vị trí nhận biết của BsmBI ở nucleotide vị trí 583 trên gen. Bên cạnh đó, khi thực hiện RT-PCR gen PB1 từ vRNA sử dụng cặp mồi Bm-PB1-F và Bm-PB1-R đều chứa vị trí nhận biết của BsmBI. Do vậy, BsmBI sẽ cắt gen PB1 trong plasmid pBT-PB1 thành 3 băng: 1 băng tƣơng ứng với kích thƣớc đầy đủ của gen PB1, và 2 băng có tổng kích thƣớc bằng kích thƣớc gen PB1 là khoảng 1,75 kb và 0,6 kb. Nhƣ vậy, các băng vạch có kích thƣớc 2,7 kb, 2,35 kb, 1,75 kb và 0,6 kb tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của plasmid pBT, gen PB1 trình tự đầy đủ, và gen PB1 bị cắt thành 2 trình tự kích thƣớc là khoảng 1,75 kb và 0,6 kb. Kết quả nhận đƣợc cho thấy: Các sản phẩm cắt tƣơng ứng với từng gen đều chứa phân đoạn gen có kích thƣớc phù hợp với kích thƣớc của từng gen đích tƣơng ứng đã đƣợc xác định bằng đọc trình tự gen đích trong plasmid pBT tái tổ hợp (Bảng 3.1). Các băng vạch có kích thƣớc đúng với kích thƣớc lý thuyết của từng gen trên bản điện di đƣợc cắt và thu nhận bằng phƣơng pháp thôi gel, tinh sạch gen. Nồng độ và độ tinh sạch của từng gen đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo mật độ quang trên máy Nanodrop. Các mẫu chứa trình tự đầy đủ và đảm bảo chất lƣợng về nồng độ và độ tinh sạch của từng gen đƣợc ghép nối riêng rẽ vào plasmid pHW2000 đã đƣợc cắt mở vòng bằng BsmBI. Sản phẩm sau ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH5α và cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc bổ sung ampicillin. Sau 16h nuôi cấy, lựa chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc to tròn, mọc tách biệt để chọn dòng nhanh bằng phƣơng pháp conoly-PCR với kết quả trình bày ở Hình 3.6. Các dòng khuẩn lạc của thí nghiệm biến nạp plasmid mang phân đoạn gen 75 PB2, PB1, PA và NP đƣợc lựa chọn kiểm tra đều dƣơng tính với plasmid tái tổ hợp. Phân đoạn gen M và NS có 4/5 dòng khuẩn dƣơng tính với pHW2000 tái tổ hợp. Sản phẩm phản ứng conoly-PCR (nhân từng phân đoạn gen khung bằng mồi đặc hiệu gen) dƣơng tính với plasmid tái tổ hợp khi điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% đều xuất hiện một băng đặc hiệu duy nhất tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của từng phân đoạn gen: Gen PB2: ~ 2350 bp, gen PB1: ~ 2350 bp, gen PA: ~ 2250 bp, gen NP: ~ 1600 bp, gen M: ~ 1050 bp, và gen NS: ~ 900 bp. A B C D E F Hình 3.6. Chọn dòng khuẩn dƣơng tính với plasmid pHW2000 tái tổ hợp bằng phƣơng pháp conoly-PCR M. Marker 1kb (Fermentas); chọn dòng vi khuẩn mang plasmid pHW2000-PB2 (A), pHW2000-PB1 (B), pHW2000-PA (C), pHW2000-NP (D), pHW2000-M (E) và pHW2000-NS (F) Kết quả chọn dòng cho thấy không phải tất cả các dòng vi khuẩn mọc tạo khuẩn lạc trên môi trƣờng bổ sung kháng sinh chọn lọc đều mang plasmid tái tổ hợp, và có các dòng khuẩn không chứa plasmid nhƣng kháng kháng sinh nên vẫn mọc tạo khuẩn lạc. Theo Czudai-Matwich và đtg (2013), Wessels và đtg (2015): Plasmid pHW2000 đƣợc thiết kế với kích thƣớc nhỏ gọn để nâng cao hiệu quả 76 chuyển nhiễm vào tế bào động vật, do vậy các marker chọn lọc có chức năng nhƣ gen LacP/Z không đƣợc chèn vào plasmid, và hiệu quả chọn lọc dòng dƣơng tính với plasmid tái tổ hợp vẫn đảm bảo nhƣng có thể không đạt tỷ lệ 100%. Tất cả các dòng vi khuẩn dƣơng tính với plasmid tái tổ hợp đƣợc lƣu giữ dòng trong glycerol ở - 80ºC. Bên cạnh đó, tƣơng ứng với mỗi phân đoạn gen, lựa chọn 1 dòng khuẩn dƣơng tính với phản ứng conoly-PCR để nhân dòng, khuếch đại, tách chiết và tinh sạch plasmid pHW2000 tái tổ hợp. Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của 6 mẫu DNA plasmid bằng phƣơng pháp đo mật độ quang trên máy Nanodrop cho thấy: Sáu mẫu DNA plasmid tách chiết từ sáu dòng vi khuẩn mang riêng rẽ sáu phân đoạn gen khung có nồng độ DNA plasmid đạt khoảng 550 - 1100 ng/µl, độ tinh sạch thể hiện ở chỉ số A260/A280 là 1,82 - 1,93. Các mẫu DNA plasmid này đƣợc sử dụng làm vật liệu để kiểm tra sự có mặt của sáu phân đoạn gen khung bằng các phƣơng pháp: PCR, cắt bằng enzyme giới hạn, xác định trình tự gen đích trong plasmid tái tổ hợp. 3.1.3.2. Xác định sự có mặt của sáu phân đoạn gen khung trong plasmid pHW2000 tái tổ hợp Kiểm tra sự có mặt của sáu phân đoạn gen khung trong sáu mẫu plasmid pHW2000 tái tổ hợp chỉ bằng phƣơng pháp conoly-PCR là chƣa đủ để khẳng định chắc chắn về sự có mặt của các phân đoạn gen đích trong các plasmid, do phản ứng conoly-PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả (các phân đoạn gen khung chƣa gắn vào plasmid có thể đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng conoly-PCR, hoặc plasmid biến nạp vào vi khuẩn E. coli có thể là plasmid không mang gen đích mà chỉ là plasmid tự đóng vòng...). Do vậy, để khẳng định chắn chắn sáu phân đoạn gen khung đã đƣợc chèn riêng rẽ vào đúng vị trí trên plasmid pHW2000, các thí nghiệm kiểm tra tiếp theo đƣợc thực hiện, gồm: (i) Xác định sự có mặt của từng phân đoạn gen đích trong plasmid pHW2000 bằng PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu cho nhân bản từng phân đoạn gen và mồi bắt cặp trên plasmid; (ii) cắt plasmid tái tổ hợp với cặp enzyme NheI và SmaI. Sản phẩm phản ứng PCR nhân gen đích bằng hai cặp mồi (đặc hiệu gen, đặc 77 hiệu plasmid) đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose (Hình 3.7) chứng tỏ 6 phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M và NSđã đƣợc biến nạp thành công và gắn đúng vị trí trên 6 plasmid pHW2000 (mỗi plasmid mang một phân đoạn cDNA tƣơng ứng của virus cúm). Sản phẩm sáu phản ứng PCR nhân gen sử dụng mồi bắt cặp trên gen chỉ xuất hiện một băng vạch có kích thƣớc đúng bằng kích thƣớc theo tính toán lý thuyết của từng gen (gen PB2: ~ 2350 bp, gen PB1: ~ 2350 bp, gen PA: ~ 2250 bp, gen NP: ~ 1600 bp, gen M: ~ 1050 bp và gen NS: ~ 900 bp). Sáu phản ứng nhân gen bằng mồi đặc hiệu plasmid đều có kích thƣớc lớn hơn khoảng 0,2kb so với sản phẩm phản ứng PCR nhân các phân đoạn gen tƣơng ứng bằng mồi đặc hiệu gen. Hình 3.7. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung với mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000 M: Marker 1kb (Fermentas); (-): Đối chứng âm; 1, 2: Phân đoạn M; 3, 4: Phân đoạn NP; 5,6: Phân đoạn NS; 7,8: Phân đoạn PA; 9, 10: Phân đoạn PB1; 11, 12: Phân đoạn PB2 Trong số các phƣơng pháp kiểm tra sự có mặt của gen đích trong plasmid tái tổ hợp, phƣơng pháp cắt bằng enzyme giới hạn có độ chính xác cao và nhanh nhận đƣợc kết quả. Thông thƣờng, phản ứng cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp hay sử dụng loại enzyme cắt tạo đầu dính trên gen đích và plasmid. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp enzyme đã sử dụng để tách dòng gen không cắt tại vị trí nhận biết mà cắt sau vị trí nhận biết nhƣ BsmBI - CGTCTC(1/5), thì sau khi gen đích gắn vào plasmid sẽ không còn chứa vị trí nhận biết trong trình tự gen. Do vậy, thí nghiệm cắt kiểm tra plasmid pHW2000 tái tổ hợp đƣợc thực hiện với cặp enzyme NheI và SmaI - vị trí cắt ở hai đầu gen đích và nằm trên plasmid. 78 Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose (Hình 3.8) cho kết quả: Cắt plasmid mang phân đoạn gen PB2, PA, NP, M, và NS bằng cặp enzyme NheI và SmaI tạo sản phẩm gồm hai băng vạch: Băng thứ nhất có kích thƣớc lớn tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pHW2000, băng thứ hai kích thƣớc nhỏ hơn tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của từng phân đoạn gen. Trong khi đó, sản phẩm cắt plasmid mang phân đoạn gen PB1 văng ra 3 băng: Băng trên cùng có kích thƣớc lớn tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pHW2000, hai băng sau có kích thƣớc sấp xỉ bằng nhau và liền kề nhau ở vị trí nucleotide kích thƣớc khoảng 1200 bp và 1150 bp. Kết quả này là hợp lý và theo đúng tính toán lý thuyết, vì trình tự nucleotide của phân đoạn gen PB1 có điểm cắt của NheI ở vị trí nucleotide 1141, và phân đoạn gen PB1 dƣới hoạt động của NheI bị cắt tạo hai băng kích thƣớc khoảng 1200 bp và 1150 bp (hai băng vạch định vị ở vị trí rất gần nhau trên bản điện di. Hình 3.8. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt sáu plasmid pHW2000 tái tổ hợp mang sáu phân đoạn gen khung bằng cặp enzyme NheI và SmaI M1: Marker High Ranger 1kb DNA Ladder; sản phẩm cắt các plasmid với cặp enzyme NheI, SmaI, và plasmid tái tổ hợp không cắt bằng enzyme: pHW2000-M (1, 2), pHW-NP (3, 4), pHW2000-NS (5, 6), pHW2000-PA (7, 8); pHW2000-PB1 (9, 10) và pHW2000-PB2 (11, 12). Yêu cầu trong thí nghiệm tách dòng bộ plasmid khung là gen đích dòng hóa vào plasmid phải có trình tự nucleotide đầy đủ và chính xác 100% so với trình tự gen tƣơng ứng của chủng virus gốc A/PR/8/34. Nguyên tắc này nhằm đảm bảo giữ nguyên các đặc tính ƣu việt của bộ gen khung từ chủng virus đƣợc WHO khuyến cáo nên sử dụng làm chủng virus nền cung cấp các gen khung cho tái tạo chủng 79 virus ứng viên vaccine. Kết quả xác định trình tự các phân đoạn gen chỉ ra: Sáu phân đoạn gen đích đã tách dòng vào plasmid có trình tự nucleotide đạt độ tƣơng đồng 100% so với trình tự tƣơng ứng của từng phân đoạn đã tách dòng vào plasmid pBT và của chủng PR8 công bố trên Ngân hàng NCBI. Các kết quả nhận đƣợc đều chứng minh luận án đã tách dòng thành công 6 phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M, và NS nguồn gốc từ virus NIBRG-14 vào 6 plasmid pHW2000. Bộ khung plasmid pHW2000 tái tổ hợp đã chuẩn bị là nguồn vật liệu kết hợp với plasmid mang phân đoạn HA (H5) và NA (N1) để biến nạp vào tế bào 293T, phục vụ mục tiêu tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1. 3.2. THIẾT KẾ VÀ TÁCH DÒNG GEN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 CLADE 1.1 VÀ CLADE 2.3.2.1c VÀO PLASMID pHW2000 3.2.1. Thiết kế gen kháng nguyên HA Định vị trên bề mặt hạt virus cúm A, gen H5 (HA) đóng vai trò quan trọng trong quyết định tính kháng nguyên và độc lực của virus (gen H5 của virus độc lực cao chứa một số amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và nằm trƣớc điểm nhận biết của protease). Do vậy, yêu cầu trong thí nghiệm thiết kế phân đoạn gen HA: (i) Mã hóa các amino acid giữ nguyên tính kháng nguyên qui định bởi gen H5 của virus A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c; (ii) protein do gen H5 mã hóa phải đƣợc loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và đảm bảo virus không bị lại độc - không xuất hiện độc tính trở lại; (iii) thích hợp cho tách dòng vào plasmid pHW2000. Trình tự nucleotide của hai phân đoạn gen H5 clade 1.1 và H5 clade 2.3.2.1c đã đƣợc thiết kế, tổng hợp nhân tạo và lƣu giữ trong plasmid trình bày ở Hình 3.9. Trình tự nucleotide của hai gen H5 có kích thƣớc: Gen H5 clade 1.1 - 1825 bp, gen H5 clade 2.3.2.1c - 1822 bp. Hai gen H5 đều có đặc điểm: 2 đoạn nucleotide ở 2 đầu không mã hóa, là vị trí gắn mồi đặc hiệu chứa điểm nhận biết của enzyme BsmBI; ở giữa là vùng mã hóa amino acid tạo protein HA: Ở clade 1.1 - 1698 bp (1695 bp mã hóa 565 amino acid và 3 bp là bộ ba kết thúc), ở clade 2.3.2.1c - 1695 bp (1692 bp mã hóa 564 amino acid và 3 bp tƣơng ứng với bộ ba kết thúc). 80 A B Hình 3.9. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc A. Trình tự nucleotide; B. Trình tự amino acid 81 Với 2 trình tự gen H5 đã thiết kế, khi khuếch đại gen bằng phản ứng PCR sẽ tạo sản phẩm có kích thƣớc 1799 bp (1698 bp + 101 bp) tƣơng ứng với gen HA clade 1.1 và 1796 bp (1695 bp + 101 bp) tƣơng ứng với gen HA clade 2.3.2.1c. Đặc biệt, trình tự amino acid của protein H5 đƣợc mã hóa bởi gen HA clade 1.1 và 2.3.2.1c đã thiết kế đều đã loại bỏ vùng độc (loại bớt các amino acid kiềm ở vị trí nhận biết của protease) và đã đƣợc tránh hiện tƣợng lại độc. Cụ thể, trình tự amino acid H5 clade 1.1 đã thiết kế, vị trí 338-344 là QREGT-RG, trong khi ở chủng gốc A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1), vị trí 338-347 là QREGRRKK- RG (chứa 4 amino acid kiềm –RRKK- ở vị trí nhận biết của protease). Nhƣ vậy, so với chủng gốc, trình tự gen H5 clade 1.1 đã thiết kế làm gen ứng viên sản xuất vaccine đã đƣợc loại vùng độc: Loại 2 arginine (R), 1 lysine (K) và thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); và tránh lại độc: Hai arginine (R) ở hai đầu ngay sát vùng độc đƣợc thay đổi mã bộ ba (AGA thành CGA - cũng mã hóa cho arginine nhƣng sẽ đảm bảo chủng virus không từ dạng độc lực thấp chuyển thành dạng độc lực cao). Trình tự amino acid mã hóa bởi gen HA clade 2.3.2.1c loại vùng độc đã thiết kế, vị trí 338-343 là QRET-RG, trong khi ở chủng gốc A/duck/Viet Nam/HT-02/2014(H5N1), vị trí 338-346 là QRERRRK-RG (chứa 4 amino acid kiềm –RRRK- ở vị trí vùng độc) (Hoàng Thị Thu Hằng et al., 2008). So với chủng virus gốc, gen ứng viên vaccine HA clade 2.3.2.1c đã đƣợc loại vùng độc: Loại 3 arginine (