Luận án Nghiên cứu tạo Gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân Gelatin da cá tra - Phạm Mỹ Dung

hợp được chuyển vào 2 ml môi trường LB và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào sau khi nuôi cấy được thu lại bằng ly tâm. Vector tách dòng có gắn đoạn gen cần tách pJET1.2: gelE được tách khỏi tế bào E. coli bằng kit PureLinkTM – Plasmid Extraction (Invitrogen). Vector đã gắn gen gelE được xử lý bởi hai enzym hạn SalI và HindIII và kiểm tra trên gel agarose 1% để xác định tính chính xác của đoạn gen gắn vào vector tách dòng. *Tách chiết plasmid 59 Một khuẩn lạc E. coli tái tổ hợp được chuyển vào 2 ml môi trường LB và nuôi lắc 200 v/p ở 37oC qua đêm. Tế bào sau khi nuôi cấy được thu lại bằng ly tâm. Vector tách dòng có gắn đoạn gen cần tách pJET1.2: gelE được tách khỏi tế bào E. coli bằng kit PureLinkTM – Plasmid Extraction (Invitrogen). Vector đã gắn gen gelE được xử lý bởi hai enzym hạn SalI và HindIII và kiểm tra trên gel agarose 1% để xác định tính chính xác của đoạn gen gắn vào vector tách dòng. * Điện di DNA trên gel agarose Gel agarose 1 % được chuẩn bị bằng cách cho 1 g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50oC rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã cài sẵn răng lược. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel từ 1 ÷ 2 mm. Lấy mẫu chứa khoảng 1 ÷ 2 µg DNA pha trong 16 µl đệm TE rồi trộn với 4 µl đệm màu 5X và tra vào các giếng trong gel. Dung dịch màu vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có tác dụng làm lắng DNA xuống đáy giếng khi chạy điện di. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, khoảng 25 ÷ 30 phút, DNA chạy từ cực âm đến cực dương, quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue khi chạy được khoảng 2/3 bản gel thì dừng điện di. Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại bước sóng 254 nm của máy soi gel. 2.4.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli Xử lý vector pJET1.2::gel đồng thời với hai enzym giới SalI và HindIII, tách và tinh sạch đoạn gen gelE có kích thước khoảng 1,5 bp. Cắt vector biểu hiện pET-22b(+) đồng thời với hai enzym giới hạn SalI và HindIII. Tinh sạch vector đã cắt. Gắn đoạn gen gelE đã tinh sạch vào vector pET-22b(+) bằng T4 ligase ở 14oC trong thời gian 12 giờ. Biến nạp toàn bộ 60 sản phẩm nhận được vào chủng E. coli DH5α. Nuôi và kiểm tra các thể biến nạp. Tách plasmid từ các vi khuẩn có mang gen, xử lý bằng enzym giới hạn để kiểm tra kích thước của đoạn gen được chèn trong vector biểu hiện pET- 22(b+). Vector biểu hiện pET-22b-gelE sau khi đã kiểm tra được biến nạp vào chủng E. coli BL21(DE3). Tách plasmid từ chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) mang vector pET-22b-gelE để kiểm tra tính chính xác của vector đã được biến nạp. Chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET-22b-gelE được sử dụng để biểu hiện enzym Gelatin tái tổ hợp. 2.4.2.6. Phương pháp kiểm tra protein tái tổ hợp *Điện di protein trên gel polyacryalmide SDS – PAGE ( Laemmli, 1970). Điện di protein được thực hiện trên gel polyacrylamide 12% theo phương pháp Laemmli (1970). Trộn 20 µl mẫu với 5 µl đệm mẫu (loading dye blue 2X gồm 0,1 M Tris HCl pH 6,8; 0,2 M DTT, 4% SDS, 20% glycerol; 0,2% bromophenol blue mecraptoethanol 0,25 ml) đun sôi trong 10 phút. Sau đó 25 µl mẫu được đưa vào các giếng với các thang chuẩn protein (Fermentas), tiến hành điện di với cường độ dòng điện 14 mA/2 giờ. Gel sau khi điện di được nhuộm qua đêm bằng dung dịch coomassie brilliant blue, tẩy màu (giải nhuộm) trong dung dịch ethanol: axít acetic: nước (4:1:5). Sau khi giải nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt. *Định lượng protein (Bradford, 1976) Lượng protein có trong mẫu cũng được định lượng theo phương pháp Bradford . Nguyên lý của phương pháp này dựa vào phản ứng giữa các phân tử protein có trong mẫu với brilliant blue G trong dung dịch Bradford tạo thành phức chất có khả năng hấp thụ tốt nhất trong khoảng bước sóng 465 ÷ 595 nm. Dựa vào độ hấp thụ đo được trong khoảng bước sóng trên và trên cơ sở đường chuẩn xây dựng từ protein chuẩn, nồng độ protein có trong mẫu được định lượng. 61 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein Protein trong mẫu thử được xác định như sau: Protein (mg/ml enzym) = 1,261 * (ΔA595 nm(TN) – ΔA595 nm (KC)) – 0,168 Trong đó : + ΔA595 nm(TN): Độ tăng mật độ quang ở bước sóng 595 nm của mẫu thí nghiệm. + ΔA595 nm(KC): Mật độ quang ở bước sóng 595 nm của mẫu kiểm chứng. 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL 2.4.3.1. Nuôi cấy E. coli tái tổ hợp Tế bào E. coli BL21(DE3)-[pET-22b-gelE] được nuôi lắc (200 vòng/phút) qua đêm trên môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin đến nồng độ cuối là 100 µg/ml, ở nhiệt độ thích hợp. Quá trình biểu hiện enzym tái tổ hợp GEL được cảm ứng bằng IPTG ở các nồng độ khác nhau, khi mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1. Thu tế bào theo thời gian cảm ứng bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút. 2.4.3.2. Thu nhận GEL từ E. coli tái tổ hợp Tế bào E. coli BL21(DE3) [pET -22b -gelE] thu được sau quá trình biểu hiện được ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, hòa sinh khối trong đệm phosphate pH 8,0; 50 mM và siêu âm phá vỡ tế bào. Tiếp đó, ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch protein hòa tan và thu protein không hòa tan. Phần xác tế bào sau đó được hòa lại trong 500µl dung dịch 62 PBS. Protein pha tan và xác tế bào còn lại được biến tính và kiểm tra bằng điện di protein trên gel polyacrylamide 12%. 2.4.3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện * Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET 22b -gelE] được nuôi cấy trong môi trường LB, nhiệt độ 37oC với các pH từ 5; 6; 7; và 8. Quá trình biểu hiện enzym tái tổ hợp GEL được cảm ứng bằng IPTG 0,1 mM khi mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1. Thu tế bào theo thời gian cảm ứng bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút và thu GEL theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.3.2. Dịch protein thô được điện di kiểm tra hoạt tính gelatinase và điện di kiểm tra trên SDS – PAGE theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.2.6. * Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET22b - gelE] được nuôi cấy trong môi trường LB, bổ sung ampicillin 100 g/ml; pH=7. Khi mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1, cảm ứng bằng IPTG nồng độ 0,1 mM và điều chỉnh nhiệt độ lên men ở các mức 25, 28, 34 và 37°C. Thu tế bào theo thời gian cảm ứng bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 15 phút và thu GEL theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.3.2. Dịch protein thô được điện di kiểm tra hoạt tính gelatinase và điện di kiểm tra trên SDS – PAGE theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.2.6. *Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến biểu hiện rGEL Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET 22b - gelE]được nuôi cấy trong môi trường LB, bổ sung ampicillin 100 g/ml; pH=7. Khi mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1, cảm ứng bằng IPTG thay đổi từ 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mM và hạ nhiệt độ xuống 34°C. Mẫu được đánh giá bằng kiểm tra hoạt tính và protein tái tổ hợp trên gel polyacrylamide sau 8 giờ cảm ứng. 63 * Xác định thời gian thu hồi rGEL Chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21(DE3) [pET 22b - gelE]được nuôi cấy trong môi trường LB, bổ sung ampicillin 100 g/ml; pH=7. Khi mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 ÷ 1, cảm ứng bằng 0,05 mM và hạ nhiệt độ xuống 34°C. Cách 1 giờ lấy mẫu kiểm tra hoạt tính gelatinase và đo giá trị OD600nm. 2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL 2.4.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL rGEL được thu hồi theo phương pháp trình bày trong mục 2.4.3.2. Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch bằng cột Probond™(Invitrogen). Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2 ml resin vào, resin lắng xuống nhờ trọng lượng và hút nhẹ dịch nổi ra. Cột Ni2+ được rửa 2x bằng nước khử ion và đệm gắn cột (250 mM NaH2PO4, 2,5M NaCl và 10 mM imidazol, pH 8). Sau đó 8ml dịch protein (dịch nổi) cần tinh sạch được đưa lên cột, đặt lên một máy lắc nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng trong dịch protein trong 30÷60 phút để gelatinase gắn vào hạt resin. Tiếp theo, các hạt resin được để lắng và loại bỏ dịch trong cột. Cột được rửa 3 lần với đệm rửa (250 mM NaH2PO4, 2,5 M NaCl và 20 mM imidazol, pH 8). Protein gắn cột được thôi ra bằng dung dịch thôi (250 mM NaH2PO4, 2,5M NaCl và 250 mM imidazol, pH 8) với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein được xác định trong mỗi phân đoạn. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide như trình bày trong mục 2.4.2.6. 2.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt của rGEL Gelatinase tái tổ hợp sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở các nhiệt độ 20, 30, 37, 40, 45, 50°C trong 30 phút. Ảnh hưởng của nhiệt độ được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh hoạt tính của mẫu thí nghiệm với hoạt tính tại nhiệt độ tối ưu. Độ bền nhiệt của gelatinase 64 được theo dõi trong 6 giờ ở điều kiện xử lý nhiệt là 37oC; 40°C và 45oC cứ mỗi 30 phút, hoạt tính enzym được đánh giá một lần. 2.4.4.3. Ảnh hưởng của pH và độ bền pH của rGEL Ảnh hưởng của pH và độ bền pH đến hoạt tính của gelatinase: Gelatinase sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở pH thay đổi từ 5÷12. Ảnh hưởng của pH được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh hoạt tính của pH thí nghiệm và tại pH tối ưu. rGEL được giữ trong đệm pH 5; pH7; pH7,5 và pH8,5 trong thời gian 0,5÷ 6 (bước nhảy 0,5 giờ) và thử hoạt tính. Độ bền pH được xác định bằng hoạt độ còn lại của enzym so với thời điểm ban đầu trong thời gian 6 giờ. 2.4.4.4. Ảnh hưởng của ion kim loại rGEL sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở 50°C trong dung dịch các ion Co2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, ethylenediamine tetraacetid axít (EDTA) và β-mercaptoetanol ở nồng độ 5 mM. Ảnh hưởng của các ion kim loại và chất tẩy rửa được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh tỷ lệ hoạt độ của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng âm không bổ sung các ion. 2.4.4.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa rGEL sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở 50°C trong dung dịch có chứa các chất tẩy như Tween 20, Triton X-100, SDS ở các nồng độ 0,3; 0,5; 1%. Ảnh hưởng của các hóa chất tẩy rửa được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh hoạt tính của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng âm không bổ sung các ion. 2.4.4.6. Động học của rGEL với cơ chất gelatin Động học của phản ứng enzym rGEL được xác định qua hằng số Michaelis- Menten: Km và vận tốc phản ứng tối đa Vmax. Km lớn, ái lực giữa enzym và cơ chất thấp và ngược lại, ở những điều kiện hoàn toàn xác định về nhiệt độ, pH, Km của một enzym đối với một cơ chất là hằng số. Nếu enzym 65 có thể xúc tác với các cơ chất khác nhau thì Km có thể khác nhau tùy thuộc vào loại cơ chất. Xác định Km dựa vào phương trình Lineawever – Burk: ) Trong đó: V0: vận tốc ban đầu; Vmax: vận tốc cực đại; Km: hằng số Michaelis. 2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra 2.4.5.1. Phương pháp nghiên cứu thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL *Phương pháp xử lý mẫu da cá Tra Nhằm tránh gây biến đổi những tính chất của da cá, ngay sau khi chế biến phi lê, da cá thu được cần cắt nhỏ đến 0,2 ÷ 0,5cm/mẫu, tiếp theo da cá sẽ được đem đi làm đông và trữ đông ở nhiệt độ -20 ± 2oC. Chính vì vậy, trong quá trình nghiên cứu, việc đầu tiên phải làm đối với nguyên liệu là da cá tra đó là công đoạn “rã đông, rửa sạch”. Để tăng hiệu quả của quá trình, da cá sau khi được chuyển từ nhà máy chế biến về phòng thí nghiệm dưới dạng đông lạnh sẽ được đem đi tan giá, kết hợp với rửa sạch bằng nước ấm ở nhiệt độ 50ºC ÷ 60ºC, sau đó được để cho khô ráo trước khi tiến hành xử lý ở bước tiếp theo. *Phương pháp trích ly gelatin Sau khi xử lý da sạch (30 g) trong 60 phút với NaOH 0,1M, chúng được ráo nước và rửa 3 lần bằng nước máy. Sau đó, các mẫu được xử lý trong 60 phút với axit lactic 25mM. Các mẫu được xả và xả 3 lần bằng nước máy. Quá trình chuẩn bị ở trên được thực hiện tại 4°C. Cuối cùng, các mẫu được trộn với nước cất (tỷ lệ da / nước: 1/8 w/v) và gelatin được chiết ở nhiệt độ 45oC trong 10 giờ (Jongjareonrak và cộng sự, 2010; Nguyễn Đỗ Quỳnh và cộng sự, 2015). Sau khi trích ly thu đươc một dung dịch sệt, tiến hành lọc bằng vải có 4 lớp để loại bỏ lớp màng da. Đem dung dịch đó lọc qua máy lọc chân không với chất trợ lọc celite để loại bỏ bớt tạp chất và mỡ. Cô đặc dung dịch ở nhiệt độ tương ứng trong thời gian 5 – 6 giờ để bay bớt hơi nước tạo 66 điều kiện thuận lợi cho công đoạn sấy. Dịch lọc được đổ ra khay sấy ở nhiệt độ 60 ÷ 700C, sản phẩm được sấy và nghiền mịn, sau đó được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. *Phương pháp khảo sát điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL Khảo sát tỷ lệ nước Trong các nghiên cứu trước đã xác định được điều kiện thích hợp cho hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp là: nhiệt độ 50oC, pH =7,0; 100 g cơ chất được thủy phân với nồng độ enzym 75U trong 24 giờ, với các tỷ lệ nước khảo sát như sau: 0%, 30%; 50%, 70%, 100%. Sản phẩm sau thủy phân sẽ được tiến hành đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Với tỷ lệ nước tối ưu đã xác định và điều kiện thủy phân như trên. Các nhiệt độ được khảo sát bao gồm: 40; 45; 50; 55 và 60oC. Sản phẩm sau thủy phân sẽ được tiến hành đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Khảo sát với các nồng độ enzym Với các điều kiện tỷ lệ nước và nồng độ muối đã xác định và điều kiện thủy phân như trên, tiến hành thay đổi nồng độ enzym với các hoạt độ khảo sát như sau: không có enzyme; 25 U; 50 U; 75 U; 100 U và 125 U. Sản phẩm sau thuỷ phân sẽ được tiến hành đo các chỉ số đạm để tính hiệu suất thủy phân và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan. Từ đó, chọn ra hoạt độ enzym tối ưu để tiến hành các khảo sát tiếp theo. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian Với các điều kiện đã xác định ở các thí nghiệm trên, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân 2; 6; 8; 12 và 24 giờ. Dịch sau thủy phân sẽ được tiến hành đo các chỉ tiêu đạm để tính hiệu suất thủy phân. * Phương pháp xác định mức độ thủy phân Hiệu suất thủy phân (DH- Degree of hydrolysis) được xác định theo phương pháp của Hoyle and Merritt (1994). 20 ml protein thủy phân được bổ 67 sung 20ml trichloroacetic axít (TCA) để tạo dung dịch đạm chứa 10% TCA. Giữ hỗn hợp trong 30 phút cho quá trình kết tủa rồi ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi được phân tích theo phương pháp Kjeldahl (AOAC, 2000). Mức độ thủy phân được tính theo công thức: * Phương pháp định lượng axit amin trong sản phẩm thủy phân Phương pháp định lượng axít amin bằng ninhydrin 0,1 ml dịch lọc được cho vào ống nghiệm, bổ sung 1 ml pyridine 20% và 1 ml ninhydrin 2%, ủ mẫu tại nhiệt độ 70 ÷ 75oC trong 7-10 phút, sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng. Sau 30 phút, xác định độ hấp thụ của mẫu bằng đo quang phổ ở bước sóng A570 nm và dựa vào đường chuẩn glutamic để xác định hàm lượng axít amin có trong mẫu thử. 2.4.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen *Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu một nhân tố ngẫu nhiên hoàn toàn. Trong đó, sử dụng 21 giai lưới để thí nghiệm, mỗi giai có diện tích 1m2, các giai được đặt trong cùng một ao nước lợ có diện tích 2000m2, độ sâu mực nước 1 ± 1,2m (Hình 2.2b). Cá có kích thước 7 cm được ương nuôi trong 35 ngày. Mật độ 40 con/m2. Hình 2.2a. Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) Hình 2.2b. Hệ thống giai ương thí nghiệm 68 Hình 2.3. Thức ăn công nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng thức ăn Thành phần dinh dưỡng thức ăn Hàm lượng Độ ẩm 11% Protein thô tối thiểu 46% Protein tiêu hóa tối thiểu 36% Béo thô tối thiểu 10% Tro tối đa 15% Xơ thô tối đa 1% Canxi tối đa 2,5% Photpho tổng số tối đa 1,5% Lysine tổng số tối thiểu 1,7% Methyonine + Cystine tổng số tối thiểu 0,83% Thí nghiệm được tiến hành với 7 công thức thức ăn và 3 lần lặp. ở các công thức thí nghiệm cụ thể như sau: + CT1: Thức ăn công nghiệp + 0% chế phẩm axit amin (Đối chứng) + CT2: Thức ăn công nghiệp + 0,2% chế phẩm axit amin + CT3: Thức ăn công nghiệp + 0,4% chế phẩm axit amin. + CT4: Thức ăn công nghiệp + 0,6% chế phẩm axit amin. + CT5: Thức ăn công nghiệp + 0,8% chế phẩm axit amin. + CT6: Thức ăn công nghiệp + 1,0% chế phẩm axit amin + CT7: Thức ăn công nghiệp + 1,2% chế phẩm axit amin Điều kiện phi thí nghiệm: nhiệt độ nước: 25÷30oC; pH: 7,5÷8,3; độ mặn: 20÷32 ppt; DO: 4÷8 mg/l. * Phương pháp bổ sung chế phẩm vào thức ăn công nghiệp: thức ăn dạng viên khô, chế phẩm dạng ướt nên được phun trộn đều vào lượng thức ăn cho cá theo từng lần cho ăn. Chế độ cho ăn: vào lúc 6 và 16 giờ. Khẩu phần cho cá ăn: 5% khối lượng thân cá. 69 * Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng của thức ăn thí nghiệm sau khi bổ sung chế phẩm axit amin. - Vật chất khô: Xác định theo phương pháp TCVN 4326 - 2001. - Protein thô: Xác định theo phương pháp TCVN 4328 - 2007. - Lipid thô: Xác định theo phương pháp TCVN 4331 - 2007. - Khoáng tổng số: Xác định theo phương pháp TCVN 4327-2007 - Acid amin: Xác định theo phương pháp AOAC 2007 (994.12). Các mẫu thức ăn được phân tích thành phần dinh dưỡng và thành phần axit amin, các chỉ số được thể hiện ở bảng 2.2, bảng 2.3. Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm Côn g thức Mức bổ sung bột axit amin (%) Protein thô (%, DM) Lipit thô (%, DM) Xơ thô tối đa (%) Can xi tối đa (%) Tro tối đa (%) Lysine tổng số tối thiểu (%) Methyo nine + Cystine tổng số tối thiểu (%) 1 0 46 10 1 2,5 15 1,6 0,83 2 0,2 46,2 10 1 2,5 15 1,64 0,84 3 0,4 46,4 10 1 2,5 15 1,68 0,84 4 0,6 46,5 10 1 2,5 15 1,72 0,85 5 0,8 46,6 10 1 2,5 15 1,76 0,86 6 1,0 46,8 10 1 2,5 15 1,8 0,86 7 1,2 47,0 10 1 2,5 15 1,84 0,87 Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm Axit amin (% ) Thức ăn thí nghiệm + bổ sung axit amin (%) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Aspartic 4,05 4,15 3,91 4,02 3,95 4,13 4,13 Glutamic 8,13 8,41 8,01 7,81 8,09 8.38 8,38 Serine 1,96 1,99 1,9 2,0 1.89 2.1 2,07 70 Histidine 1,32 1,28 1,21 0,96 1,05 1,14 1,08 Glycine 2,81 2,77 2,55 2,52 2,19 2,22 2,22 Threonine 1,50 1,41 1,30 1,36 1,27 1,36 1,36 Alanine 2,42 2,40 2,18 2,17 1,87 1,94 1,94 Arginine 2,59 2,62 2,45 2.53 2,25 2,46 2,46 Tyrosine 1,45 1,40 1,61 1.64 1,38 1,35 1,35 Valine 1,60 1,65 1,54 1,53 1,42 1,52 1,52 Methionine 0,83 0,84 0,84 0,85 0,86 0,86 0,87 Lysine 1,6 1,64 1,68 1,72 1,76 1,8 1,84 Phenylalanine 1,49 1,55 1,49 1,60 1,40 1,62 1,62 Isoleucine 1,17 1,18 1,18 1,19 1,03 1,14 1,14 Leucine 2,66 2,49 2,39 2,46 2,24 2,43 2,43 Proline 1,01 1,07 0,94 0,94 0,98 1,11 1,11 Phương pháp xác định tăng trưởng của cá Mú thí nghiệm: định kỳ 7 ngày kiểm tra một lần về khối lượng, chiều dài thân cá, từ đó xác định: -Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG) : Wt– W0 ADG = (g/ngày) t Trong đó: - W0: khối lượng ban đầu - Wt: khối lượng tại thời điểm t thí nghiệm - t: ngày thí nghiệm -Tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR) LnWt – LnW0 SGR = x 100 (%/ngày) t Trong đó: - W0: khối lượng cá ban đầu - Wt: khối lượng cá tại thời điểm kết thúc thí nghiệm - t: ngày thí nghiệm Cuối đợt thí nghiệm đánh giá hệ số sử dụng thức ăn (FCR): FCR= Tổng lượng thức ăn đã sử dụng/ Khối lượng tăng trưởng của cá nuôi 71 Xác định hệ số phân đàn (CV): Đánh giá tại thời điểm thả cá và thời điểm kết thúc thí nghiệm. CV (%) = Độ lệch chuẩn/ giá trị trung bình x 100 -Xác định tỷ lệ sống của cá Mú ương: số cá thả ở các giai ương ban đầu đều bằng nhau, sau khi kết thúc thí nghiệm thu đếm số cá còn lại ở mỗi giai để biết được hiệu quả ương nuôi. 2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Toàn bộ số liệu được thu thập trong quá trình thí nghiệm và được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell 2007, SPSS 16.0. Dùng phép kiểm định Duncan, LSD0,05. 72 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu công bố về phân lập và tách dòng gen gelE mã hóa gelatinase từ các chủng VSV trong tự nhiên, đặc biệt là từ các chủng vi khuẩn gây bệnh trên người, côn trùng và động vật như Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens và Serratia marcescens. (Shanmugasundaram và cộng sự, 2012). Tổng hợp các kết quả cho thấy vi khuẩn có nguồn gốc từ cá bị bệnh hoặc từ nguồn gelatin đang bị phân hủy thường thể hiện hoạt tính gelatinase (GEL) cao và ái lực mạnh đối với cơ chất gelatin từ da cá. Vì vậy, từ Bộ sưu tập giống gồm 216 chủng vi sinh vật sinh enzym thủy phân gelatin phân lập từ các mẫu mẫu cá nước ngọt bị bệnh lở loét, xuất huyết, đốm đỏ, tuột nhớt, tuột vẩy tại các hồ nuôi cá ở Hà Nội tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, đã sàng lọc được 11 chủng sinh gelatinase cao để tìm nguồn gen mã hóa gelatinase. Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. STT Ký hiệu chủng Đường kính vòng phân giải gelatin (D-d, mm) Hoạt tính gelatinase (U/ml) 1 MD1 20,50 ± 0,01 0,34±0,12 2 MD2 26,51 ± 0,03 0,40±0,10 3 MD3 24,60 ±0,11 0,40±0,16 4 MD4 28,21 ± 0,16 0,64±0,11 5 MD5 23,02 ±0,13 0,43±0,15 6 MD6 21,01 ±0,21 0,38±0,10 73 7 MD7 25,00 ±0,12 0,41±0,16 8 MD8 25,02 ±0,15 0,39±0,12 9 MD9 22,02 ±0,05 0,30±0,12 10 MD10 25,01 ±0,15 0,33±0,10 11 MD11 23,00 ±0,02 0,31±0,18 Ghi chú: D: Đường kính vòng phân giải (mm), d: Đường kính lỗ thạch (mm) Hình 3.1. Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng của chủng MD4; (a) Hình ảnh môi trường thạch gelatin 7,5g/L bị hóa lỏng sau khi cấy chủng MD4 và ở 30oC trong 48 giờ; (b) Hình ảnh môi trường thạch gelatin 7,5 g/L đối chứng. Hình 3.2. Vòng phân giải cơ chất gelatin của chủng vi khuẩn. A: Vòng phân giải gelatine của chủng (A): MD2; (B):MD10; (C, D): MD4 Kết quả cho thấy, 11 chủng có khả năng phân hủy gelatin tốt nhất, với đường kính vòng vô khuẩn từ 21,01 mm đến 28,21 mm, hoạt tính gelatinase dao động từ 0,31 U/ml đến 0,64 U/ml. Trong số 11 chủng trên, chủng MD4 cho hoạt tính cao nhất, đạt 0,64 U/ml (Bảng 3.1) và có khả năng hóa lỏng b a A B D C 74 thạch gelatin 7,5 g/L (Hình 3.1) được lựa chọn là chủng cung cấp nguồn gen mã hóa gelatinase cho các nghiên cứu tiếp theo. Trên thế giới, rất nhiều tác giả đã sàng lọc và khai thác các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp gelatinase từ nhiều nguồn khác nhau. Shanmugasundaram và cộng sự (2012) đã sàng lọc được Bacillus spp. có hoạt tính gelatinase noại bào đạt tới 2,1U/ml từ mẫu bùn lắng tại bờ biển Porto Novo. Mahmoud cũng sàng lọc 21 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy gelatin từ các nguồn lây nhiễm trong dây chuyền sản xuất gelatin, trong đó 27 chủng (chiếm 17,5%) có hoạt tính thủy phân gelatin mạnh (đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 2cm) (Mahmoud và cộng sự, 2017). Từ 30 mẫu thu thập từ da cá, thùng chứa, sàn nhà và dụng cụ chế biến cá ở bến tàu ở Songkla, các tác giả đã phân lập được 115 chủng vi khuẩn, trong đó 25 chủng thủy phân gelatin từ da cá với hoạt tính đạt 5,16 đến 41 U/mg protein). Còn từ các mẫu đất và nước biển tại Brasil, nhóm nghiên cứu Kumar và cộng sự (2012) đã phân lập được 33 chủng có khả năng phân hủy gelatin da cá. Các kết quả trên chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn mang mã gen mã hóa gelatinase thường có khả năng sinh trưởng và phát triển trong môi trường chứa cơ chất gelatine (da cá, cơ chất sản xuất gelatin), đó cũng là nguyên nhân vì sao trong nghiên cứu này chúng tôi chọn cá bệnh là nguồn phân lập nguồn gen mã hóa gelatinase. 3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn MD4 * Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn MD4 Ở nhiệt độ 30oC sau 24 giờ khuẩn lạc vi khuẩn MD4 có khuẩn lạc không đều, bề mặt bóng, mặt cắt hình lồi nhọn, mép khuẩn lạc dạng rễ hình răng cưa, cấu trúc dạng sợi, bề mặt nhớt (hình 3.3a). Khi nhuộm Gram thấy chủng vi khuẩn MD4 bắt màu xanh tím, soi trên kính hiển vi với vật kính x100 thấy hình dạng