MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN . i
LỜI CẢM ƠN. ii
TÓM TẮT .iii
ABSTRACT .iv
MỤC LỤC. v
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.vi
DANH MỤC BẢNG.vii
DANH MỤC HÌNH.viii
MỞ ĐẦU . 1
CHƯƠNG 1. 4
TỔNG QUAN . 4
1.1. Cây Bạch hoa xà. 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại. 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái . 4
1.1.3. Thành phần hóa học . 5
1.1.4. Công dụng của dịch trích ly từ rễ cây BHX . 6
1.2. Plumbagin . 7
1.2.1. Cấu trúc và đặc tính hóa học . 7v
1.2.2. Sinh tổng hợp Plumbagin ở thực vật . 7
1.2.3. Hoạt tính của Plumbagin . 8
1.2.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa. 8
1.2.3.2. Hoạt tính kháng viêm. 9
1.2.3.3. Hoạt tính kháng ung thư.10
1.2.3.4. Hoạt tính kháng khuẩn .12
1.2.3.5. Hoạt tính kháng nấm .13
1.2.4. Độc tính của plumbagin .13
1.2.5. Tình hình nghiên cứu thu nhận hoạt chất Plumbagin từ thực vật.16
1.3. Chuyển hóa thứ cấp từ thực vật .20
1.3.1. Hợp chất thứ cấp từ thực vật .20
1.3.2. Con đường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp.21
1.3.3. Dược tính của các hợp chất thứ cấp từ thực vật.24
1.4. Sự cần thiết nuôi cấy rễ tơ thu nhận hợp chất thứ cấp .25
1.4.1. Sự hình thành rễ tơ ở thực vật .27
1.4.2. Chuyển gen tạo rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes .28
1.4.2.1. Ri-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes .28
1.4.2.2. Sự chuyển nạp gen từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào tế
bào thực vật.29
1.4.2.3. Sự biểu hiện của các gen vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
trong mô thực vật.32
1.4.2.4. Tạo rễ tơ ở thực vật bằng Agrobacterium rhizogenes.39
1.5. Nuôi cấy rễ tơ ở thực vật .40
1.5.1. Ảnh hưởng của dòng rễ tơ .41v
1.5.2. Nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy .41
1.5.3. Ảnh hưởng của elicitor.43
1.5.4. Nuôi cấy rễ tơ để thu nhận các hoạt chất thứ cấp .44
CHƯƠNG 2.48
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.48
2.1. Vật liệu .48
2.1.1. Nguyên vật liệu .48
2.1.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy.49
2.2. Phương pháp thực nghiệm .49
2.2.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro cây Bạch hoa xà dùng cho
chuyển gen.49
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu . 49
2.2.1.2. Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ. 50
2.2.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro . 52
2.2.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định từ lá và đoạn thân cây Bạch
hoa xà in vitro. 52
2.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ .54
2.2.2.1. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ.54
2.2.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của gen rol trong T-DNA của vi khuẩn
hợp nhất được vào bộ gen tế bào rễ tơ bằng phương pháp PCR. 56
2.2.3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy hoạt
chất plumbagin trong nuôi cây rễ tơ cây Bạch hoa xà .58
2.2.3.1. Ảnh hưởng trạng thái môi trường.58v
2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng sinh trưởng
của rễ tơ .59
2.2.3.3. Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ .59
2.2.3.4. Ảnh hưởng khối lượng ban đầu .60
2.2.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng.60
2.2.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng của rễ tơ .61
2.2.4. Định tính và định lượng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ .62
2.2.4.1. Ly trích và chuẩn bị mẫu cho phân tích HPLC .62
2.2.4.2. Định tính Plumbagin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) .63
2.2.4.3. Định lượng Plumbagin bằng HPLC .63
2.2.5. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của
Plumbagin .64
2.2.6. Xử lý số liệu.67
CHƯƠNG 3.68
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .68
3.1. Tạo và chọn nguồn vật liệu in vitro.68
3.1.1. Xác định điều kiện khử trùng mẫu .68
3.1.2. Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ.70
3.1.3. Phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi in vitro.73
3.1.4. Khảo sát khả năng tạo rễ bất định của lá và đoạn thân cây Bạch hoa
xà in vitro.75
3.2. Chuyển gen tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà .79
3.2.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự hình thành rễ tơ .79v
3.2.2. Xác định hoạt chất Plumbagin tích lũy trong rễ tơ.85
3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp Plumbagin .87
3.3.1. Trạng thái môi trường .87
.
3.3.2. Điều kiện chiếu sáng.88
3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ
tơ.89
3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi
cấy .91
3.3.5.Xác định đường cong tăng trưởng.92
3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy.94
3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin
.101
CHƯƠNG 4.107
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.107
4.1. Kết luận .107
4.2. Đề nghị.108
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .109
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .110
TÀI LIỆU THAM KHẢO .
PHỤ LỤC
258 trang |
Chia sẻ: lavie11 | Lượt xem: 638 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in vitro, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ễ (g TLT/bình)
Sáng 2,66a
Tối 2,78a
LSD0,01: 0,129
CV: 1,266
Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì
khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.
z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các
nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).
3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ
tơ
Thành phần môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển của rễ tơ
nuôi cấy [85]. Kết quả khảo sát cho thấy, rễ tơ phát triển tốt trên cả 3 loại môi
trường, mặc dù môi trường MS cho chỉ số trọng lượng rễ cao nhất nhưng không
có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 loại môi trường còn lại (Bảng 3.9, Hình
3.19). Kết quả cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (2009) [225]
khi nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà được tạo ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes MTCC 532 nuôi trên 3 môi trường MS, SH và B5, trong đó môi
trường MS là tốt nhất (6,3 g TLT; 0,99 gTLK). Việc gia tăng hàm lượng
ammonium trong môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng tăng trưởng trong khi
tăng hàm lượng nitrat có tác động đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp và tích
lũy hoạt chất alkaloid. Ngoài ra, sinh khối và tích lũy alkaloid cao nhất khi giảm
hàm lượng nitrogen, kết quả này được ghi nhận khi nuôi cấy rễ tơ cây Nhân sâm,
90
yếu tố khoáng có vai trò quan trọng trong sự điều hòa tăng trưởng và thu nhận
sinh khối [229]. Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và cs (2009) [274] thì rễ tơ cây
Angelica gigas phát triển tốt nhất trong môi trường SH so với MS và B5; trong
môi trường ON rễ tơ cây Neem tăng trưởng tốt hơn so với trong môi trường MS
và B5 [206]. Điều này cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng
lớn đến sự sinh trưởng của rễ tơ, nhưng còn phụ thuộc vào đặc điểm loài của
thực vật.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy
Môi trường Trọng lượng rễ (g TLT)
MS 2,84a
B5 2,60a
N 2,52a
LSD0,01 0,35
CV 4,36
Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì
khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.
z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các
nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).
Hình 3.19. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ cây BHX
nuôi cấy.
91
3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi
cấy
Tỷ lệ giữa lượng mẫu nuôi cấy ban đầu và thể tích môi trường nuôi có ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng của rễ tơ, kết quả cho thấy, lượng mẫu ban đầu 1 g
(TLT/60 ml môi trường) cho chỉ số tăng trưởng cao nhất; có sự thay đổi về chỉ
số sinh trưởng của rễ ở các nghiệm thức có lượng mẫu nuôi ban đầu là 2, 3, 4
(gTLT/60 ml) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.10,
Hình 3.20). ). Ở cùng điều kiện nuôi cấy nhưng lượng mẫu khác nhau cho chỉ số
sinh trưởng khác nhau, điều này có thể do cạnh tranh về thành phần dinh dưỡng
trong môi trường; sự thiếu hụt lượng oxy hòa tan trong môi trường [183], khả
năng phát triển rễ tơ cây Thanh hao hoa vàng tối ưu khi lượng oxy trao đổi trong
môi trường bằng hoặc cao hơn lượng oxy rễ hấp thu.
Hình 3.20. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ tơ
BHX nuôi cấy.
92
Bảng 3.10. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ tơ
BHX nuôi cấy.
Nghiệm thức Trọng lượng
ban đầu (g
TLT)
Trọng lượng sau 4
tuần nuôi cấy
(gTLT)
Chỉ số sinh
trưởng
1 1,05 2,13 1,03a
2 2,02 2,98 0,48b
3 3,02 3,99 0,42b
4 4,00 5,68 0,32b
LSD 0,01 0,25
CV 16,33
Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì
khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01.
z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các
nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD).
3.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng
Nuôi cấy 1 g rễ trên môi trường MS ở trạng thái lỏng (0 g/L agar; lắc ở tốc
độ 80 vòng/phút) trong điều kiện tối, nhiệt độ 25oC ±2oC trong 6 tuần, khảo sát
sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) và hàm lượng Plumbagin trong các mẫu thu
được sau mỗi tuần nuôi cấy (Bảng 3.11, Hình3.21).
93
Hình 3.21. Đường cong tăng trưởng của rễ tơ cây Bạch hoa xà.
- Trọng lượng tăng chậm trong tuần đầu nuôi cấy, sau đó rễ phát triển
mạnh đến tuần thứ 5 và sau đó chậm lại và gần như không phát triển thêm nữa.
Thời gian đầu rễ ở trạng thái thích nghi và hồi sinh, sau đó rễ phát triển mạnh.
Sau giai đoạn phát triển này, hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm, đồng thời có
sự tích lũy các chất chuyển hóa trong môi trường. Zhang và cs (2013) [281] khi
nuôi cấy rễ bất định cây Psammosilene tunicoides cũng đã ghi nhận được hiện
tượng này.
- Hàm lượng plumbagin trong sinh khối rễ tơ tăng chậm trong giai đoạn
đầu (tuần 1 và 2), sau đó tăng nhanh từ tuần thứ 3, 4 và 5. Mặc dù ở tuần thứ 6
hàm lượng Plumbagin cũng còn tăng nhưng đã chậm lại, ghi nhận này cũng phù
hợp với báo cáo của Zhang và cs (2013) [281] ở rễ bất định cây Psammosilene
tunicoides nuôi cấy. Như vậy, ở giai đoạn đầu môi trường dinh dưỡng thuận lợi
cho sự phát triển nên tích lũy sinh khối, sau đó khi các chất dinh dưỡng trong
môi trường suy giảm quá trình trao đổi chất thứ cấp xảy ra mạnh trong rễ.
94
Bảng 3.11. Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời
gian.
Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plumbagin (µg/g
TLK)
0 1,030 153,808
1 1,085 88,28
2 1,340 94,701
3 1,863 137,16
4 2,828 193,144
5 2,955 201,416
6 2,960 208,605
Tùy theo loài thực vật mà thời gian cho giai đoạn sinh trưởng và tích lũy
hoạt chất của rễ tơ có thay đổi, như ở cây Fagopyrum tataricum giai đoạn phát
triển chậm trong 9 ngày đầu, giai đoạn phát triển nhanh từ ngày thứ 12-24, tương
ứng với hàm lượng flavonoid trong rễ ở hàm lượng thấp trong 15 ngày đầu sau
đó tăng nhanh từ ngày 16-30 [284]; ở cây Gentiana scabra: 2 tuần đầu rễ tơ phát
triển chậm, tuần thứ 3-5 rễ tơ phát triển nhanh, sau đó phát triển chậm; hàm
lượng gentiopicroside tăng nhanh ở tuần thứ 3 -5, sau đó giảm [101].
3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy
7 yếu tố được khảo sát về mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh
trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy. Dựa vào mức ảnh hưởng của chúng để sàng lọc
các yếu tố có ảnh hưởng chính đến các thông số cần quan tâm.
95
Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi
cấy
Các nghiệm thức được thiết lập theo thiết kế Plackett-Burman, kết quả
được ghi nhận ở Bảng 3.12.
Dựa trên thông số thực tế, ma trận Plackett-Burman thu được trọng lượng
tươi 4,02-4,78 g, trọng lượng khô 0,36-0,56 g và hàm lượng Plumbagin 0,169-
1,154 mg trong 60 ml môi trường nuôi cấy (Bảng 3.12). Giá trị ảnh hưởng của
từng yếu tố lên trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin được
tính toán bằng phần mềm Design expert® 7.0.0 (Bảng 3.13). 4 yếu tố có giá trị
ảnh hưởng lớn (mang giá trị dương) ở các thông số trọng lượng tươi, trọng lượng
khô và hàm lượng Plumbagin (p < 0,05) của rễ tơ BHX nuôi cấy được chọn là:
nước dừa, chitosan, salicylic acid và pepton. Kết quả cho thấy nước dừa có tác
động mạnh nhất đến tăng trưởng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của rễ, còn
pepton và chitosan có ảnh hưởng mạnh đến sự tích lũy Plumbagin.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.
Nghiệm
thức
Trọng lượng tươi
(g)
Trọng lượng khô
(g)
Hàm lượng Plumbagin
(mg)
Thí
nghiệm
Mô
hình
Thí
nghiệm
Mô
hình
Thí
nghiệm
Mô hình
1 4,82 4,78 0,54 0,56 1,184 1,154
2 4,22 4,02 0,403 0,36 0,899 0,731
3 4,41 4,78 0,415 0,47 0,956 0,591
4 3,37 4,02 0,253 0,36 0,945 1,154
5 4,25 4,02 0,427 0,45 0,008 0,169
96
6 3,61 4,02 0,439 0,36 0,380 0,591
7 5,14 4,78 0,557 0,45 0,221 0,169
8 5,28 4,78 0,559 0,56 0,860 0,731
9 4,4 4,78 0,423 0,47 0,351 0,731
10 5,32 4,02 0,563 0,45 1,42 1,154
11 4,62 4,78 0,585 0,56 0,353 0,591
12 3,34 4,02 0,346 0,45 0,361 0,169
Bảng 3.13. Mức tác động của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh
trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy.
Yếu tố Giá trị khảo sát Mức tác động
Trọng
lượng tươi
Trọng
lượng khô
Hàm lượng
Plumbagin
Nước dừa (%) 10 30 0,76 0,108 -0,014
Peptone (mg/L) 100 500 0,34 -0,00467 0,563
Dịch trích nấm
men (mg/L) 100 1000 0,277 0,020 0,005
Chitosan(mg/L) 100 300 -0,08 0,013 0,422
Casein(mg/L) 100 500 0,01 0,003 -0,119
SA (mg/L) 10 100 0,067 0,009 0,107
Đường (g/L) 10 50 -0,413 -0,088 -0,072
97
Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy
Plumbagin
Sau khi sàng lọc các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và
tích lũy Plumbagin, kế hoạch hóa thực nghiệm được thực hiện theo đáp ứng bề
mặt (RSM-DOD), xử lý bằng Design expert® 7.0.0. Giá trị hàm đáp ứng theo
thực nghiệm và tiên đoán theo mô hình được trình bày trong Bảng 3.14.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của 4 yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy
N
T
Hàm lượng Trọng lượng
tươi (g)
Trọng lượng
khô (g)
Hàm lượng
Plumbagin (mg)
Nước
dừa
Chitosan SA Peptone Thí
nghiệm
Mô
hình
Thí
nghiệm
Mô
hình
Thí
nghiệm
Mô
hình
1 23 175 42 249 2,92 3,00 0,38 0,38 10,59 9,93
2 10 100 100 500 2,95 2,79 0,35 0,34 10,59 10,28
3 30 264 100 100 2,94 2,87 0,37 0,37 10,57 11,38
4 20 300 42 100 2,90 3,01 0,38 0,36 7,61 8,79
5 10 100 43 292 3,10 3,24 0,36 0,35 10,92 10,29
6 10 278 53 290 4,97 4,89 0,51 0,50 5,06 5,74
7 10 300 10 500 2,69 2,75 0,43 0,44 6,71 7,46
8 30 100 84 100 2,52 2,74 0,34 0,35 7,97 6,91
9 30 100 100 426 2,66 2,58 0,38 0,35 14,70 14,56
10 20 300 42 100 3,10 3,12 0,29 0,31 9,35 8,29
11 30 196 43 500 2,57 2,53 0,34 0,35 12,46 12,10
12 10 300 100 100 3,1 2,94 0,45 0,43 10,35 10,42
13 20 100 10 500 2,99 2,96 0,34 0,39 13,68 11,86
14 30 100 100 426 3,32 3,04 0,38 0,37 9,92 10,77
15 30 196 43 500 2,24 2,25 0,28 0,27 8,33 7,61
98
16 30 300 100 500 3,66 3,81 0,47 0,47 10,03 11,06
17 17 100 11 100 3,29 3,31 0,39 0,36 6,86 7,72
18 10 203 10 100 2,98 2,97 0,36 0,38 6,78 7,39
19 30 300 10 310 2,85 2,94 0,40 0,40 9,19 7,60
20 30 100 10 100 2,92 2,84 0,38 0,39 8,66 10,3
21 30 300 10 310 2,83 2,94 0,43 0,43 11,59 10,42
22 10 300 92 500 2,58 2,79 0,34 0,34 10,67 10,73
23 10 100 100 500 3,32 3,01 0,34 0,36 8,27 8,19
24 18 222 100 344 2,90 3,04 0,35 0,37 11,14 10,38
25 14 100 100 100 3,06 2,96 0,44 0,39 10,60 11,91
Phân tích phương sai (ANOVA) phương trình hồi quy được dùng như là
một mô hình để tiên đoán cho từng hàm mục tiêu thu được. Thông quá giá trị
phân tích, ảnh hưởng và mức tương quan ảnh hưởng giữa các yếu tố (nước dừa,
chitosan, salicylic acid và pepton) đến khả năng sinh trưởng và tích lũy
Plumbagin thể hiện ở Bảng 3.15 và các Hình 3.22, 3.23, 3.24.
Hình 3.22. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng
khô
99
Hình 3.23. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng
tươi
Hình 3.24. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến hàm lượng
Plumbagin.
100
Bảng 3.15. Phân tích phương sai và phương trình hồi quy theo mô hình D-
Optimal.
Thông số Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng
Plumbagin
R2 (R-
Squared)
0,927 0,864 0,994
C.V% 7,852 6,988 10,510
Phương
trình tuyến
tính tương
quan giữa
các yếu tố
Y1 = 3,278– 0,352x1-
0,536x2-0,144x3 +
0,426x1x2 + 0,439x1x3 –
0,983x1x4-0,526x2x3+
0,240x3x4+ 0,386x1
2 –
1,310x2
2-0,714x3
2
+1,265x4
2-
0,813x1x2x3+0,266x1x2x4
+
1,156x1x3x4+0,669x1
2x2
Y2 = 0,35– 0,031x2
+0,036x1x3-
0,044x1x4 –
0,038x2x3 +
0,025x3x4 –
0,068x3
2+ 0,1x4
2-
0,029x1x2x3+
0,023x1x2x4+
0,048x1x3x4+
0,065x1
2x2
Y3 =
7,03+1,31x1-
0,75x3- 0,97x1x2
+ 1,21x1x3 +
0,95x2x3–
1,41x2x4 –
0,90x3x4
+2,22x2
2 +
1,48x3
2–
2,00x1x3x4-
0,73x1
2x2
x1, x2, x3, x4 lầnlượt tương ứng: nước dừa, chitosan, salicylic acid và peptone.
Từ kết quả nhận được, mô hình đáp ứng bề mặt (D-Optimal) đã dự đoán
được điểm tối ưu cho sự sinh trưởng và tích lũy Plumbagin là nước dừa: 14,33%,
chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L, với kết quả
nhận được tương ứng: trọng lượng tươi 4,968 g/ 60 ml MT, trọng lượng khô:
0,451 g/ 60 ml MT và hàm lượng Plumbagin:11,135 mg/ 60 ml MT. Từ những
ghi nhận có được cho thấy, có nhiều yếu tố tác động đến sinh trưởng và tích lũy
101
Plumbagin ở rễ tơ cây Bạch hoa xà. Kết quả này góp phần khẳng định vai trò của
một số yếu tố trong quá trình sinh trưởng và tích lũy hoạt chất trong nuôi cấy mô
thực vật của Naha´lka và cs (1998) [159], Putalun và cs (2010) [185] và
Thaweesak và cs (2011) [242].
3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin
Ảnh hưởng của plumbagin lên sự tăng sinh của tế bào HepG2
Plumbagin đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự tăng sinh của
nhiều loại tế bào ung thư như tế bào ung thư phổi [87], ung thư biểu bì
[97],thông qua chết theo chương trình do cảm ứng và do đó làm thay đổi mật
độ của tế bào. Trong nghiên cứu này, tế bào HepG2 được Plumbagin ở các nồng
độ khác nhau cảm ứng. Sau ba ngày nuôi cấy, mật độ tế bào HepG2 giảm dần
khi nồng độ Plumbagin gây cảm ứng tăng dần. Mật độ trung bình tế bào HepG2
ở nồng độ 2,5 µM Plumbagin là 115,33x104 tế bào/ml. Ở nồng độ này, mật độ tế
bào HepG2 tăng so với mật độ tế bào ban đầu (100x104 tế bào/ml) sau 3 ngày
cảm ứng. Điều đó chứng tỏ nồng độ Plumbagin 2,5 µM chưa đủ sức gây chết tế
bào HepG2. Mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm khi nồng độ Plumbagin ở
5 µM (58x104 tế bào/ml), 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) và giảm mạnh ở nồng độ
20 µM (23,33x104 tế bào/ml) (Bảng 3.16). Hình 3.25 mô tả hình thái của tế bào
HepG2 khi bị Plumbagin ở các nồng độ khác nhau gây cảm ứng. Ở nhóm đối
chứng, quần thể tế bào HepG2 phát triển bình thường với mật độ cao, ở nồng độ
2,5 µM Plumbagin bắt đầu ức chế sự tăng sinh của tế bào HepG2. Ở nồng độ
Plumbagin 5 µM và 10 µM, mật độ tế bào thưa dần và ở nồng độ 20 µM, mật độ
tế bào giảm mạnh nhất (Hình 3.25)
102
Bảng 3.16. Tế bào HepG2 sau 3 ngày cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ khác
nhau.
Nồng độ Plumbagin (µM)
Đối chứng 2,5 5 10 20
Mật độ tế
bào
(x104)
137,67
±1,76a
115,33±1,45b 58,00±1,00c 57,33±1,20c 23,33±0,88d
a,b,c,d: Khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤0,05)
Hình 3.25. Hình thái tế bào HepG2. A: Đối chứng. B, C, D, E: HepG2 được cảm
ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ 2,5, 5, 10, 20 µM.
Để xác định những biến đổi của nhân trong quá trình apoptosis, phương
pháp nhuộm đơn với thuốc nhuộm Acridine Orange được áp dụng trong việc
đánh giá hình thái của nhân [231]. Kết quả nhuộm nhân cho thấy nhóm tế bào
đối chứng có hình thái nhân bình thường - đều, màng nhân liên tục và không
thấy nhân bị phân mảnh (Hình 3.26A). Trong khi đó ở các nhóm tế bào được xử
103
lý Plumbagin đều xuất hiện sự phân mảnh của nhân. Nhân tế bào HepG2 được
cảm ứng Plumbagin bị phân mảnh và phân tán trong tế bào chất. Quá trình phân
mảnh của nhân tế bào HepG2 diễn ra càng mạnh khi nồng độ Plumbagin cảm
ứng càng tăng (Hình 3.26).
Hình 3.26. Sự phân mảnh nhân tế bào HepG2.
A: HepG2 không xử lý Plumbagin - nhân nguyên vẹn, không phân mảnh.
B, C, D, E: HepG2 xử lý Plumbagin ở nồng độ tương ứng - 2,5, 5, 10, 20 µM.
Quá trình phân mảnh của tế bào HepG2 diễn ra càng mạnh khi nồng độ
Plumbagin xử lý càng cao (mũi tên trắng).
Phương pháp điện di tế bào đơn được sử dụng để đánh giá mức độ đứt gãy
DNA nhân tế bào HepG2 khi được cảm ứng bởi Plumbagin. Phương pháp này
được đánh giá qua hai thông số là phần trăm DNA trong đuôi comet và tỉ lệ
chiều dài đuôi comet/chiều dài comet. Phần trăm DNA trong đuôi comet thể hiện
lượng DNA đứt gãy và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet thể hiện mức
độ đứt gãy của DNA nhân tế bào. Kết quả cho thấy, khi nồng độ càng cao, lượng
DNA đứt gãy trong nhân tế bào HepG2 càng lớn (Bảng 3.17). Nồng độ
Plumbagin 20 µM gây đứt gãy DNA mạnh nhất. Ở nồng độ Plumbagin 5 µM và
104
10 µM lượng DNA trong tế bào HepG2 bị đứt gãy như nhau. Kết quả đánh giá tỉ
lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet cho thấy, khi nồng độ Plumbagin cảm
ứng tăng thì tỉ lệ này càng tăng ở tế bào HepG2 (Bảng 3.17). Tỉ lệ này cao nhất ở
tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin nồng độ 20 µM. Trong khi đó ở
nồng độ 5 µM và 10 µM, tỉ lệ này là tương đương nhau. Kết quả này cho thấy
khi nồng độ Plumbagin cảm ứng càng tăng, thì quá trình phân mảnh DNA thành
các đoạn nhỏ diễn ra càng mạnh. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá sự
phân mảnh của nhân tế bào HepG2 khi được cảm ứng bởi Plumbagin (Hình
3.27). Đây là những đặc điểm quan trọng liên quan tới sự chết theo chương trình
của tế bào HepG2.
Bảng 3.17. Tỉ lệ đứt gãy DNA trong đuôi và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài
comet.
Nồng độ Plumbagin (µM)
Đối chứng 2,5 5 10 20
Phần trăm
DNA trong
đuôi comet
12,46±0,72a 32,96±1,47b 46,99±3,64c 48,66±3,12c 65,32±2,56d
Tỉ lệ chiều
dài đuôi
comet/chiều
dài comet
0,19±0,01a 0,41±0,03b 0,55±0,03c 0,63±0,02c 0,76±0,04d
105
Hình 3.27. Sự đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin
A, B, C, D, E: Ảnh huỳnh quang của tế bào HepG2 được nhuộm với Acridine
Orange. A1, B1, C1, D1, E1: Ảnh comet của tế bào HepG2 trong phân tích DNA
đứt gãy.
Phương pháp RT-PCR được áp dụng để đánh giá sự biểu hiện một số gene
liên quan đến quá trình apoptosis là gene bax và bcl-2 [276]. Họ protein Bcl-2
gồm các protein BAX và protein BCL-2 được mã hóa bởi các gene họ bcl-2. Sự
cân bằng giữa các protein tiền apoptosis và protein kháng apoptosis quyết định tế
bào sẽ sống hay chết. Các thành viên trong họ Bcl-2 có chức năng như là các
điểm kiểm soát quyết định các trạng thái của tế bào [248].
Kết quả phân tích sự biểu hiện của gene kháng apoptosis bcl-2 và gene
tiền apoptosis bax ở mức phiên mã cho thấy sản phẩm phiên mã mRNA của gene
bax biểu hiện tăng theo nồng độ xử lý Plumbagin trong khi đó sự biểu hiện
mRNA của gene bcl-2 gần như không thay đổi ở các nồng độ Plumbagin (Hình
3.28). Ở nhóm đối chứng, sự biểu hiện của gene bcl-2 và gene bax được cân
bằng, điều đó giúp tế bào không đi vào quá trình apoptosis. Trong khi đó ở các
nhóm tế bào được cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ khác nhau, sự cân bằng
trong quá trình biểu hiện của gene bcl-2 và gene bax bị thay đổi theo khuynh
hướng tăng sự biểu hiện của gene bax ở mức phiên mã khi tăng nồng độ
Plumbagin. Sự thay đổi trên dẫn tới cảm ứng các tế bào này đi vào quá trình
apoptosis và biểu hiện một số đặc điểm của quá trình apoptosis.
106
Kết quả phân tích RT-PCR trên phù hợp với các kết quả đánh giá mức độ
phân mảnh của tế bào chất, sự cô đặc nhiễm sắc chất và sự phân mảnh của nhân.
Hình 3.28. Sự biểu hiện của gene Bcl-2 và Bax ở mức phiên mã của tế bào
HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ khác nhau.
Quá trình giảm biểu hiện các sản phẩm phiên mã của gene kháng
apoptosis bcl-2 và tăng biểu hiện của gene tiền apoptosis bax diễn ra tương ứng
với việc một số đặc điểm biến đổi hình thái của quá trình apoptosis như sự phân
mảnh tế bào chất, sự cô đặc nhiễm sắc chất và sự phân mảnh của nhân diễn ra
càng mạnh.
107
Chương 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
- Chồi in vitro cây Bạch hoa xà phát triển tối ưu ở điều kiện môi trường MS
bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA; sự phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi ở
môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA; Lá là nguồn nguyên liệu cho khả năng
tạo rễ bất định cao với môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA.
- Tạo được 4 dòng rễ tơ mang gen rolB, trong đó chỉ có 1 dòng mang cả 2
gen rolB và rolC. Qua mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM
và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325
cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%).
- Elicitor và dinh dưỡng là các yếu tố cần thiết cho quá trình sinh trưởng và
tích lũy hoạt chất ở rễ tơ cây Bạch hoa xà (nước dừa: 14,30%, chitosan 100
mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả trọng
lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135
mg).
- Plumbagin cảm ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi
sự cân bằng trong biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào
HepG2, thông qua mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm ở nồng độ
Plumbagin 5 µM (58x104 tế bào/ml) và 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) và giảm
mạnh ở nồng độ 20 µM (23,33x104 tế bào/ml); sự phân mảnh của nhân và sự
biểu hiện của gene liên quan đến quá trình apoptosis là gene bax và bcl-2.
108
4.2 Đề nghị
- Khảo sát một số yếu tố tác động đến quá trình chuyển gen (chủng vi
khuẩn, nhiệt độ, pH, các chất phenol,..) nhằm tăng hiệu quả chuyển gen.
- Nghiên cứu một số elicitor khác (ion kim loại, vi sinh vật,..) đến khả năng
sinh trưởng và tích lũy Plumbagin ở rễ tơ cây Bạch hoa xà.
- Kiểm tra độc tính của Plumbagin để có cơ sở khoa học cho việc ứng dụng
hoạt chất này vào thực tế.
109
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Xác định được điều kiện khử trùng, môi trường tạo chồi, tạo cây và ra rễ
của cây Bạch hoa xà in vitro. Tạo rễ tơ cây bạch hoa xà trong điều kiện in
vitro nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 11325.
- Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh trưởng và tích lũy
hợp chất Plumbagin trong rễ tơ.
110
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
1. Bùi Đình Thạch, Nguyễn Minh Hiếu, Nguyễn Phương Uyên, Ngô Kế
Sương, Nguyễn Hữu Hổ. (2012): Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu
khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà- Plumbago zeylanica L., Tạp
chí sinh học, 34(3SE): 161-169.
2. Bùi Đình Thạch, Hoàng Nghĩa Sơn, Đoàn Chính Chung, Đỗ Minh Sĩ, Lê
Thành Long, Nguyễn Hữu Hổ, Ngô Kế Sương. (2014): Plumbagin cảm
ứng một số đặc điểm apoptosis của tế bào HepG2, Tạp chí sinh học,
36(2): 247-252.
3. Bui Dinh Thach, Le Nguyen Tu Linh, Nguyen Thi Thuy Van, Trinh Thi
Ben, Nguyen Pham Ai Uyen, Ngo Ke Suong & Nguyen Huu Ho (2014):
Investigation on the accumulation of plumbagin in Plumbago zeylanica L.
hairy roots, European Journal of Advanced Research in Biological and
Life Sciences, 2(2): 14-21.
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu trong nước
1. Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam: tr. 89 – 90.
NXB Y học.
2. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi
Văn Lệ. (2010), Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Bèo đất
Drosera burmanni Vahl. Cho mục tiêu thu nhận quinone. Tạp chí phát triển
KH&CN, 13 (T2): 53-61.
3. Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2007). Nhân giống in vitro cây bắt
ruồi Drosera burmanni Vahl để thu nhận hợp chất quinone có hoạt tính sinh
học. Tạp chí phát triển KH&CN, 10: 59- 66.
Tài liệu nước ngoài
4. Abbasi B.H., Tian C.L., Murch S.J., Saxena P.K., Liu C.Z. (2007), Light-
enhanced caffeic acid derivatives biosynthesis in hairy root cultures of
Echinacea purpurea. Plant Cell Rep 26:1367– 1372.
5. Abdul K.M., Ramchender R.P. (1995), Modulatory effect of plumbagin (5-
hydroxy-2-methyl-1,4- naphthoquinone) on macrophage functions in
BALB/c mice. I. Potentiation of macrophage bactericidal activity.
Immunopharmacology; 30:231–236.
6. Abebe D., Ayehu A. (1993), Medicinal plants and enigmatic health
practices of northern Ethiopia. BSPE, Addis Ababa. Ethiopia. pp. 419-431.
7. Aditi G., Anjali G., Singh J. (1999), New naphtoquinones from Plumbago
zeylanica. Pharm. Biol. 37: 321 - 323.
8. Aggarwal B.B. (2004), Nuclear factor-kappaB: the enemy within, Cancer
Cell; 6: 203-208.
9. Ahmad A., Banerjee S., Wang Z., Kong D. and Sarkar H.F. (2008),
Plumbagin-induced apoptosis of human breast cancer cells is mediated by
inactivation of NF-kappaB and Bcl-2. J. Cell Biochem; 105:1461–1471.
10. Ahmad A., Farhan A.S., Singh S., Hadi S.M. (2000). DNA breakage by
resveratrol and Cu(II): Reaction mechanism and bacteriophage inactivation.
Cancer Lett; 154:29–37.
11. Ahmad A., Syed F.A., Singh S., Hadi S.M. (2005), Prooxidant activity of
resveratrol in the presence of copper ions: Mutagenicity in plasmid DNA.
Toxicol Lett; 159:1–12.
12. Alexander P.D., Alloway B.J., Dourado A.M. (2006), Genotypic variations
in the accumulation of Cd, Cu, Pb and Zn exhibited by six common grown
vegetables. Environmental Pollution, 144: 736–745.
13. Aoki S. (2004), Resurrection of an ancestral gene: functional and
evolutionary analyses of the Ng rol genes transferred from Agrobacterium
to Nicotiana. J Plant Res; 117:329-37.
14. Aoki S., Syono K. (1999), Synergistic function of rolB, rolC, ORF13 and
ORF14 of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes in hairy root induction in
Nicotiana tabacum. Plant Cell Physiol; 40:252-256.
15. Aziz M.H., Dreckschmidt N.E., Verma A.K. (2008), Plumbagin, a
medicinal plant-derived naphthoquinone, is a
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- tv_nghien_cuu_tao_re_to_cay_bach_hoa_xa_plumbago_zeylanica_l_va_khao_sat_kha_nang_tao_plumbagin_tron.pdf