Luận án Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo Plumbagin trong nuôi cấy in vitro

ễ (g TLT/bình) Sáng 2,66a Tối 2,78a LSD0,01: 0,129 CV: 1,266 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). 3.3.3. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lên sự sinh trưởng của rễ tơ Thành phần môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển của rễ tơ nuôi cấy [85]. Kết quả khảo sát cho thấy, rễ tơ phát triển tốt trên cả 3 loại môi trường, mặc dù môi trường MS cho chỉ số trọng lượng rễ cao nhất nhưng không có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 loại môi trường còn lại (Bảng 3.9, Hình 3.19). Kết quả cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (2009) [225] khi nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà được tạo ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes MTCC 532 nuôi trên 3 môi trường MS, SH và B5, trong đó môi trường MS là tốt nhất (6,3 g TLT; 0,99 gTLK). Việc gia tăng hàm lượng ammonium trong môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng tăng trưởng trong khi tăng hàm lượng nitrat có tác động đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp và tích lũy hoạt chất alkaloid. Ngoài ra, sinh khối và tích lũy alkaloid cao nhất khi giảm hàm lượng nitrogen, kết quả này được ghi nhận khi nuôi cấy rễ tơ cây Nhân sâm, 90 yếu tố khoáng có vai trò quan trọng trong sự điều hòa tăng trưởng và thu nhận sinh khối [229]. Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và cs (2009) [274] thì rễ tơ cây Angelica gigas phát triển tốt nhất trong môi trường SH so với MS và B5; trong môi trường ON rễ tơ cây Neem tăng trưởng tốt hơn so với trong môi trường MS và B5 [206]. Điều này cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của rễ tơ, nhưng còn phụ thuộc vào đặc điểm loài của thực vật. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Môi trường Trọng lượng rễ (g TLT) MS 2,84a B5 2,60a N 2,52a LSD0,01 0,35 CV 4,36 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). Hình 3.19. Ảnh hưởng của loại môi trường đến sinh trưởng rễ tơ cây BHX nuôi cấy. 91 3.3.4. Ảnh hưởng của lượng rễ ban đầu đến tăng trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Tỷ lệ giữa lượng mẫu nuôi cấy ban đầu và thể tích môi trường nuôi có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rễ tơ, kết quả cho thấy, lượng mẫu ban đầu 1 g (TLT/60 ml môi trường) cho chỉ số tăng trưởng cao nhất; có sự thay đổi về chỉ số sinh trưởng của rễ ở các nghiệm thức có lượng mẫu nuôi ban đầu là 2, 3, 4 (gTLT/60 ml) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.10, Hình 3.20). ). Ở cùng điều kiện nuôi cấy nhưng lượng mẫu khác nhau cho chỉ số sinh trưởng khác nhau, điều này có thể do cạnh tranh về thành phần dinh dưỡng trong môi trường; sự thiếu hụt lượng oxy hòa tan trong môi trường [183], khả năng phát triển rễ tơ cây Thanh hao hoa vàng tối ưu khi lượng oxy trao đổi trong môi trường bằng hoặc cao hơn lượng oxy rễ hấp thu. Hình 3.20. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ tơ BHX nuôi cấy. 92 Bảng 3.10. Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy. Nghiệm thức Trọng lượng ban đầu (g TLT) Trọng lượng sau 4 tuần nuôi cấy (gTLT) Chỉ số sinh trưởng 1 1,05 2,13 1,03a 2 2,02 2,98 0,48b 3 3,02 3,99 0,42b 4 4,00 5,68 0,32b LSD 0,01 0,25 CV 16,33 Các số trung bình trong cùng chỉ tiêu khảo sát với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,01. z: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD). 3.3.5. Xác định đường cong tăng trưởng Nuôi cấy 1 g rễ trên môi trường MS ở trạng thái lỏng (0 g/L agar; lắc ở tốc độ 80 vòng/phút) trong điều kiện tối, nhiệt độ 25oC ±2oC trong 6 tuần, khảo sát sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) và hàm lượng Plumbagin trong các mẫu thu được sau mỗi tuần nuôi cấy (Bảng 3.11, Hình3.21). 93 Hình 3.21. Đường cong tăng trưởng của rễ tơ cây Bạch hoa xà. - Trọng lượng tăng chậm trong tuần đầu nuôi cấy, sau đó rễ phát triển mạnh đến tuần thứ 5 và sau đó chậm lại và gần như không phát triển thêm nữa. Thời gian đầu rễ ở trạng thái thích nghi và hồi sinh, sau đó rễ phát triển mạnh. Sau giai đoạn phát triển này, hàm lượng các chất dinh dưỡng giảm, đồng thời có sự tích lũy các chất chuyển hóa trong môi trường. Zhang và cs (2013) [281] khi nuôi cấy rễ bất định cây Psammosilene tunicoides cũng đã ghi nhận được hiện tượng này. - Hàm lượng plumbagin trong sinh khối rễ tơ tăng chậm trong giai đoạn đầu (tuần 1 và 2), sau đó tăng nhanh từ tuần thứ 3, 4 và 5. Mặc dù ở tuần thứ 6 hàm lượng Plumbagin cũng còn tăng nhưng đã chậm lại, ghi nhận này cũng phù hợp với báo cáo của Zhang và cs (2013) [281] ở rễ bất định cây Psammosilene tunicoides nuôi cấy. Như vậy, ở giai đoạn đầu môi trường dinh dưỡng thuận lợi cho sự phát triển nên tích lũy sinh khối, sau đó khi các chất dinh dưỡng trong môi trường suy giảm quá trình trao đổi chất thứ cấp xảy ra mạnh trong rễ. 94 Bảng 3.11. Sự thay đổi trọng lượng rễ và hàm lượng Plumbagin theo thời gian. Thời gian (tuần) Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plumbagin (µg/g TLK) 0 1,030 153,808 1 1,085 88,28 2 1,340 94,701 3 1,863 137,16 4 2,828 193,144 5 2,955 201,416 6 2,960 208,605 Tùy theo loài thực vật mà thời gian cho giai đoạn sinh trưởng và tích lũy hoạt chất của rễ tơ có thay đổi, như ở cây Fagopyrum tataricum giai đoạn phát triển chậm trong 9 ngày đầu, giai đoạn phát triển nhanh từ ngày thứ 12-24, tương ứng với hàm lượng flavonoid trong rễ ở hàm lượng thấp trong 15 ngày đầu sau đó tăng nhanh từ ngày 16-30 [284]; ở cây Gentiana scabra: 2 tuần đầu rễ tơ phát triển chậm, tuần thứ 3-5 rễ tơ phát triển nhanh, sau đó phát triển chậm; hàm lượng gentiopicroside tăng nhanh ở tuần thứ 3 -5, sau đó giảm [101]. 3.3.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy 7 yếu tố được khảo sát về mức độ ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh trưởng của rễ tơ BHX nuôi cấy. Dựa vào mức ảnh hưởng của chúng để sàng lọc các yếu tố có ảnh hưởng chính đến các thông số cần quan tâm. 95 Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Các nghiệm thức được thiết lập theo thiết kế Plackett-Burman, kết quả được ghi nhận ở Bảng 3.12. Dựa trên thông số thực tế, ma trận Plackett-Burman thu được trọng lượng tươi 4,02-4,78 g, trọng lượng khô 0,36-0,56 g và hàm lượng Plumbagin 0,169- 1,154 mg trong 60 ml môi trường nuôi cấy (Bảng 3.12). Giá trị ảnh hưởng của từng yếu tố lên trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin được tính toán bằng phần mềm Design expert® 7.0.0 (Bảng 3.13). 4 yếu tố có giá trị ảnh hưởng lớn (mang giá trị dương) ở các thông số trọng lượng tươi, trọng lượng khô và hàm lượng Plumbagin (p < 0,05) của rễ tơ BHX nuôi cấy được chọn là: nước dừa, chitosan, salicylic acid và pepton. Kết quả cho thấy nước dừa có tác động mạnh nhất đến tăng trưởng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của rễ, còn pepton và chitosan có ảnh hưởng mạnh đến sự tích lũy Plumbagin. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy. Nghiệm thức Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Hàm lượng Plumbagin (mg) Thí nghiệm Mô hình Thí nghiệm Mô hình Thí nghiệm Mô hình 1 4,82 4,78 0,54 0,56 1,184 1,154 2 4,22 4,02 0,403 0,36 0,899 0,731 3 4,41 4,78 0,415 0,47 0,956 0,591 4 3,37 4,02 0,253 0,36 0,945 1,154 5 4,25 4,02 0,427 0,45 0,008 0,169 96 6 3,61 4,02 0,439 0,36 0,380 0,591 7 5,14 4,78 0,557 0,45 0,221 0,169 8 5,28 4,78 0,559 0,56 0,860 0,731 9 4,4 4,78 0,423 0,47 0,351 0,731 10 5,32 4,02 0,563 0,45 1,42 1,154 11 4,62 4,78 0,585 0,56 0,353 0,591 12 3,34 4,02 0,346 0,45 0,361 0,169 Bảng 3.13. Mức tác động của một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy. Yếu tố Giá trị khảo sát Mức tác động Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng Plumbagin Nước dừa (%) 10 30 0,76 0,108 -0,014 Peptone (mg/L) 100 500 0,34 -0,00467 0,563 Dịch trích nấm men (mg/L) 100 1000 0,277 0,020 0,005 Chitosan(mg/L) 100 300 -0,08 0,013 0,422 Casein(mg/L) 100 500 0,01 0,003 -0,119 SA (mg/L) 10 100 0,067 0,009 0,107 Đường (g/L) 10 50 -0,413 -0,088 -0,072 97 Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tích lũy Plumbagin Sau khi sàng lọc các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy Plumbagin, kế hoạch hóa thực nghiệm được thực hiện theo đáp ứng bề mặt (RSM-DOD), xử lý bằng Design expert® 7.0.0. Giá trị hàm đáp ứng theo thực nghiệm và tiên đoán theo mô hình được trình bày trong Bảng 3.14. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của 4 yếu tố lên sự sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy N T Hàm lượng Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Hàm lượng Plumbagin (mg) Nước dừa Chitosan SA Peptone Thí nghiệm Mô hình Thí nghiệm Mô hình Thí nghiệm Mô hình 1 23 175 42 249 2,92 3,00 0,38 0,38 10,59 9,93 2 10 100 100 500 2,95 2,79 0,35 0,34 10,59 10,28 3 30 264 100 100 2,94 2,87 0,37 0,37 10,57 11,38 4 20 300 42 100 2,90 3,01 0,38 0,36 7,61 8,79 5 10 100 43 292 3,10 3,24 0,36 0,35 10,92 10,29 6 10 278 53 290 4,97 4,89 0,51 0,50 5,06 5,74 7 10 300 10 500 2,69 2,75 0,43 0,44 6,71 7,46 8 30 100 84 100 2,52 2,74 0,34 0,35 7,97 6,91 9 30 100 100 426 2,66 2,58 0,38 0,35 14,70 14,56 10 20 300 42 100 3,10 3,12 0,29 0,31 9,35 8,29 11 30 196 43 500 2,57 2,53 0,34 0,35 12,46 12,10 12 10 300 100 100 3,1 2,94 0,45 0,43 10,35 10,42 13 20 100 10 500 2,99 2,96 0,34 0,39 13,68 11,86 14 30 100 100 426 3,32 3,04 0,38 0,37 9,92 10,77 15 30 196 43 500 2,24 2,25 0,28 0,27 8,33 7,61 98 16 30 300 100 500 3,66 3,81 0,47 0,47 10,03 11,06 17 17 100 11 100 3,29 3,31 0,39 0,36 6,86 7,72 18 10 203 10 100 2,98 2,97 0,36 0,38 6,78 7,39 19 30 300 10 310 2,85 2,94 0,40 0,40 9,19 7,60 20 30 100 10 100 2,92 2,84 0,38 0,39 8,66 10,3 21 30 300 10 310 2,83 2,94 0,43 0,43 11,59 10,42 22 10 300 92 500 2,58 2,79 0,34 0,34 10,67 10,73 23 10 100 100 500 3,32 3,01 0,34 0,36 8,27 8,19 24 18 222 100 344 2,90 3,04 0,35 0,37 11,14 10,38 25 14 100 100 100 3,06 2,96 0,44 0,39 10,60 11,91 Phân tích phương sai (ANOVA) phương trình hồi quy được dùng như là một mô hình để tiên đoán cho từng hàm mục tiêu thu được. Thông quá giá trị phân tích, ảnh hưởng và mức tương quan ảnh hưởng giữa các yếu tố (nước dừa, chitosan, salicylic acid và pepton) đến khả năng sinh trưởng và tích lũy Plumbagin thể hiện ở Bảng 3.15 và các Hình 3.22, 3.23, 3.24. Hình 3.22. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng khô 99 Hình 3.23. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến trọng lượng tươi Hình 3.24. Đáp ứng bề mặt giữa nước dừa và chitosan đến hàm lượng Plumbagin. 100 Bảng 3.15. Phân tích phương sai và phương trình hồi quy theo mô hình D- Optimal. Thông số Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng Plumbagin R2 (R- Squared) 0,927 0,864 0,994 C.V% 7,852 6,988 10,510 Phương trình tuyến tính tương quan giữa các yếu tố Y1 = 3,278– 0,352x1- 0,536x2-0,144x3 + 0,426x1x2 + 0,439x1x3 – 0,983x1x4-0,526x2x3+ 0,240x3x4+ 0,386x1 2 – 1,310x2 2-0,714x3 2 +1,265x4 2- 0,813x1x2x3+0,266x1x2x4 + 1,156x1x3x4+0,669x1 2x2 Y2 = 0,35– 0,031x2 +0,036x1x3- 0,044x1x4 – 0,038x2x3 + 0,025x3x4 – 0,068x3 2+ 0,1x4 2- 0,029x1x2x3+ 0,023x1x2x4+ 0,048x1x3x4+ 0,065x1 2x2 Y3 = 7,03+1,31x1- 0,75x3- 0,97x1x2 + 1,21x1x3 + 0,95x2x3– 1,41x2x4 – 0,90x3x4 +2,22x2 2 + 1,48x3 2– 2,00x1x3x4- 0,73x1 2x2 x1, x2, x3, x4 lầnlượt tương ứng: nước dừa, chitosan, salicylic acid và peptone. Từ kết quả nhận được, mô hình đáp ứng bề mặt (D-Optimal) đã dự đoán được điểm tối ưu cho sự sinh trưởng và tích lũy Plumbagin là nước dừa: 14,33%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L, với kết quả nhận được tương ứng: trọng lượng tươi 4,968 g/ 60 ml MT, trọng lượng khô: 0,451 g/ 60 ml MT và hàm lượng Plumbagin:11,135 mg/ 60 ml MT. Từ những ghi nhận có được cho thấy, có nhiều yếu tố tác động đến sinh trưởng và tích lũy 101 Plumbagin ở rễ tơ cây Bạch hoa xà. Kết quả này góp phần khẳng định vai trò của một số yếu tố trong quá trình sinh trưởng và tích lũy hoạt chất trong nuôi cấy mô thực vật của Naha´lka và cs (1998) [159], Putalun và cs (2010) [185] và Thaweesak và cs (2011) [242]. 3.4. Khảo sát khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô gan của Plumbagin Ảnh hưởng của plumbagin lên sự tăng sinh của tế bào HepG2 Plumbagin đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự tăng sinh của nhiều loại tế bào ung thư như tế bào ung thư phổi [87], ung thư biểu bì [97],thông qua chết theo chương trình do cảm ứng và do đó làm thay đổi mật độ của tế bào. Trong nghiên cứu này, tế bào HepG2 được Plumbagin ở các nồng độ khác nhau cảm ứng. Sau ba ngày nuôi cấy, mật độ tế bào HepG2 giảm dần khi nồng độ Plumbagin gây cảm ứng tăng dần. Mật độ trung bình tế bào HepG2 ở nồng độ 2,5 µM Plumbagin là 115,33x104 tế bào/ml. Ở nồng độ này, mật độ tế bào HepG2 tăng so với mật độ tế bào ban đầu (100x104 tế bào/ml) sau 3 ngày cảm ứng. Điều đó chứng tỏ nồng độ Plumbagin 2,5 µM chưa đủ sức gây chết tế bào HepG2. Mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm khi nồng độ Plumbagin ở 5 µM (58x104 tế bào/ml), 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) và giảm mạnh ở nồng độ 20 µM (23,33x104 tế bào/ml) (Bảng 3.16). Hình 3.25 mô tả hình thái của tế bào HepG2 khi bị Plumbagin ở các nồng độ khác nhau gây cảm ứng. Ở nhóm đối chứng, quần thể tế bào HepG2 phát triển bình thường với mật độ cao, ở nồng độ 2,5 µM Plumbagin bắt đầu ức chế sự tăng sinh của tế bào HepG2. Ở nồng độ Plumbagin 5 µM và 10 µM, mật độ tế bào thưa dần và ở nồng độ 20 µM, mật độ tế bào giảm mạnh nhất (Hình 3.25) 102 Bảng 3.16. Tế bào HepG2 sau 3 ngày cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ khác nhau. Nồng độ Plumbagin (µM) Đối chứng 2,5 5 10 20 Mật độ tế bào (x104) 137,67 ±1,76a 115,33±1,45b 58,00±1,00c 57,33±1,20c 23,33±0,88d a,b,c,d: Khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤0,05) Hình 3.25. Hình thái tế bào HepG2. A: Đối chứng. B, C, D, E: HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ 2,5, 5, 10, 20 µM. Để xác định những biến đổi của nhân trong quá trình apoptosis, phương pháp nhuộm đơn với thuốc nhuộm Acridine Orange được áp dụng trong việc đánh giá hình thái của nhân [231]. Kết quả nhuộm nhân cho thấy nhóm tế bào đối chứng có hình thái nhân bình thường - đều, màng nhân liên tục và không thấy nhân bị phân mảnh (Hình 3.26A). Trong khi đó ở các nhóm tế bào được xử 103 lý Plumbagin đều xuất hiện sự phân mảnh của nhân. Nhân tế bào HepG2 được cảm ứng Plumbagin bị phân mảnh và phân tán trong tế bào chất. Quá trình phân mảnh của nhân tế bào HepG2 diễn ra càng mạnh khi nồng độ Plumbagin cảm ứng càng tăng (Hình 3.26). Hình 3.26. Sự phân mảnh nhân tế bào HepG2. A: HepG2 không xử lý Plumbagin - nhân nguyên vẹn, không phân mảnh. B, C, D, E: HepG2 xử lý Plumbagin ở nồng độ tương ứng - 2,5, 5, 10, 20 µM. Quá trình phân mảnh của tế bào HepG2 diễn ra càng mạnh khi nồng độ Plumbagin xử lý càng cao (mũi tên trắng). Phương pháp điện di tế bào đơn được sử dụng để đánh giá mức độ đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 khi được cảm ứng bởi Plumbagin. Phương pháp này được đánh giá qua hai thông số là phần trăm DNA trong đuôi comet và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet. Phần trăm DNA trong đuôi comet thể hiện lượng DNA đứt gãy và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet thể hiện mức độ đứt gãy của DNA nhân tế bào. Kết quả cho thấy, khi nồng độ càng cao, lượng DNA đứt gãy trong nhân tế bào HepG2 càng lớn (Bảng 3.17). Nồng độ Plumbagin 20 µM gây đứt gãy DNA mạnh nhất. Ở nồng độ Plumbagin 5 µM và 104 10 µM lượng DNA trong tế bào HepG2 bị đứt gãy như nhau. Kết quả đánh giá tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet cho thấy, khi nồng độ Plumbagin cảm ứng tăng thì tỉ lệ này càng tăng ở tế bào HepG2 (Bảng 3.17). Tỉ lệ này cao nhất ở tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin nồng độ 20 µM. Trong khi đó ở nồng độ 5 µM và 10 µM, tỉ lệ này là tương đương nhau. Kết quả này cho thấy khi nồng độ Plumbagin cảm ứng càng tăng, thì quá trình phân mảnh DNA thành các đoạn nhỏ diễn ra càng mạnh. Kết quả này phù hợp với kết quả đánh giá sự phân mảnh của nhân tế bào HepG2 khi được cảm ứng bởi Plumbagin (Hình 3.27). Đây là những đặc điểm quan trọng liên quan tới sự chết theo chương trình của tế bào HepG2. Bảng 3.17. Tỉ lệ đứt gãy DNA trong đuôi và tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet. Nồng độ Plumbagin (µM) Đối chứng 2,5 5 10 20 Phần trăm DNA trong đuôi comet 12,46±0,72a 32,96±1,47b 46,99±3,64c 48,66±3,12c 65,32±2,56d Tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet 0,19±0,01a 0,41±0,03b 0,55±0,03c 0,63±0,02c 0,76±0,04d 105 Hình 3.27. Sự đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin A, B, C, D, E: Ảnh huỳnh quang của tế bào HepG2 được nhuộm với Acridine Orange. A1, B1, C1, D1, E1: Ảnh comet của tế bào HepG2 trong phân tích DNA đứt gãy. Phương pháp RT-PCR được áp dụng để đánh giá sự biểu hiện một số gene liên quan đến quá trình apoptosis là gene bax và bcl-2 [276]. Họ protein Bcl-2 gồm các protein BAX và protein BCL-2 được mã hóa bởi các gene họ bcl-2. Sự cân bằng giữa các protein tiền apoptosis và protein kháng apoptosis quyết định tế bào sẽ sống hay chết. Các thành viên trong họ Bcl-2 có chức năng như là các điểm kiểm soát quyết định các trạng thái của tế bào [248]. Kết quả phân tích sự biểu hiện của gene kháng apoptosis bcl-2 và gene tiền apoptosis bax ở mức phiên mã cho thấy sản phẩm phiên mã mRNA của gene bax biểu hiện tăng theo nồng độ xử lý Plumbagin trong khi đó sự biểu hiện mRNA của gene bcl-2 gần như không thay đổi ở các nồng độ Plumbagin (Hình 3.28). Ở nhóm đối chứng, sự biểu hiện của gene bcl-2 và gene bax được cân bằng, điều đó giúp tế bào không đi vào quá trình apoptosis. Trong khi đó ở các nhóm tế bào được cảm ứng Plumbagin ở các nồng độ khác nhau, sự cân bằng trong quá trình biểu hiện của gene bcl-2 và gene bax bị thay đổi theo khuynh hướng tăng sự biểu hiện của gene bax ở mức phiên mã khi tăng nồng độ Plumbagin. Sự thay đổi trên dẫn tới cảm ứng các tế bào này đi vào quá trình apoptosis và biểu hiện một số đặc điểm của quá trình apoptosis. 106 Kết quả phân tích RT-PCR trên phù hợp với các kết quả đánh giá mức độ phân mảnh của tế bào chất, sự cô đặc nhiễm sắc chất và sự phân mảnh của nhân. Hình 3.28. Sự biểu hiện của gene Bcl-2 và Bax ở mức phiên mã của tế bào HepG2 được cảm ứng bởi Plumbagin ở các nồng độ khác nhau. Quá trình giảm biểu hiện các sản phẩm phiên mã của gene kháng apoptosis bcl-2 và tăng biểu hiện của gene tiền apoptosis bax diễn ra tương ứng với việc một số đặc điểm biến đổi hình thái của quá trình apoptosis như sự phân mảnh tế bào chất, sự cô đặc nhiễm sắc chất và sự phân mảnh của nhân diễn ra càng mạnh. 107 Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Chồi in vitro cây Bạch hoa xà phát triển tối ưu ở điều kiện môi trường MS bổ sung 1,5 mg/L BA và 0,1 mg/L IBA; sự phát triển cây hoàn chỉnh từ chồi ở môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA; Lá là nguồn nguyên liệu cho khả năng tạo rễ bất định cao với môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA. - Tạo được 4 dòng rễ tơ mang gen rolB, trong đó chỉ có 1 dòng mang cả 2 gen rolB và rolC. Qua mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM và 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao nhất (0,025%). - Elicitor và dinh dưỡng là các yếu tố cần thiết cho quá trình sinh trưởng và tích lũy hoạt chất ở rễ tơ cây Bạch hoa xà (nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L và peptone 500 g/L thu được kết quả trọng lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g và hàm lượng Plumbagin: 13,135 mg). - Plumbagin cảm ứng sự biểu hiện các đặc điểm hình thái cũng như thay đổi sự cân bằng trong biểu hiện một số gene liên quan tới quá trình chết của tế bào HepG2, thông qua mật độ trung bình của tế bào HepG2 giảm ở nồng độ Plumbagin 5 µM (58x104 tế bào/ml) và 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) và giảm mạnh ở nồng độ 20 µM (23,33x104 tế bào/ml); sự phân mảnh của nhân và sự biểu hiện của gene liên quan đến quá trình apoptosis là gene bax và bcl-2. 108 4.2 Đề nghị - Khảo sát một số yếu tố tác động đến quá trình chuyển gen (chủng vi khuẩn, nhiệt độ, pH, các chất phenol,..) nhằm tăng hiệu quả chuyển gen. - Nghiên cứu một số elicitor khác (ion kim loại, vi sinh vật,..) đến khả năng sinh trưởng và tích lũy Plumbagin ở rễ tơ cây Bạch hoa xà. - Kiểm tra độc tính của Plumbagin để có cơ sở khoa học cho việc ứng dụng hoạt chất này vào thực tế. 109 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Xác định được điều kiện khử trùng, môi trường tạo chồi, tạo cây và ra rễ của cây Bạch hoa xà in vitro. Tạo rễ tơ cây bạch hoa xà trong điều kiện in vitro nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 11325. - Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh trưởng và tích lũy hợp chất Plumbagin trong rễ tơ. 110 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 1. Bùi Đình Thạch, Nguyễn Minh Hiếu, Nguyễn Phương Uyên, Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ. (2012): Tạo nguyên liệu in vitro và bước đầu khảo sát khả năng tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà- Plumbago zeylanica L., Tạp chí sinh học, 34(3SE): 161-169. 2. Bùi Đình Thạch, Hoàng Nghĩa Sơn, Đoàn Chính Chung, Đỗ Minh Sĩ, Lê Thành Long, Nguyễn Hữu Hổ, Ngô Kế Sương. (2014): Plumbagin cảm ứng một số đặc điểm apoptosis của tế bào HepG2, Tạp chí sinh học, 36(2): 247-252. 3. Bui Dinh Thach, Le Nguyen Tu Linh, Nguyen Thi Thuy Van, Trinh Thi Ben, Nguyen Pham Ai Uyen, Ngo Ke Suong & Nguyen Huu Ho (2014): Investigation on the accumulation of plumbagin in Plumbago zeylanica L. hairy roots, European Journal of Advanced Research in Biological and Life Sciences, 2(2): 14-21. DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 1. Đỗ Tất Lợi (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam: tr. 89 – 90. NXB Y học. 2. Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi Văn Lệ. (2010), Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Bèo đất Drosera burmanni Vahl. Cho mục tiêu thu nhận quinone. Tạp chí phát triển KH&CN, 13 (T2): 53-61. 3. Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2007). Nhân giống in vitro cây bắt ruồi Drosera burmanni Vahl để thu nhận hợp chất quinone có hoạt tính sinh học. Tạp chí phát triển KH&CN, 10: 59- 66. Tài liệu nước ngoài 4. Abbasi B.H., Tian C.L., Murch S.J., Saxena P.K., Liu C.Z. (2007), Light- enhanced caffeic acid derivatives biosynthesis in hairy root cultures of Echinacea purpurea. Plant Cell Rep 26:1367– 1372. 5. Abdul K.M., Ramchender R.P. (1995), Modulatory effect of plumbagin (5- hydroxy-2-methyl-1,4- naphthoquinone) on macrophage functions in BALB/c mice. I. Potentiation of macrophage bactericidal activity. Immunopharmacology; 30:231–236. 6. Abebe D., Ayehu A. (1993), Medicinal plants and enigmatic health practices of northern Ethiopia. BSPE, Addis Ababa. Ethiopia. pp. 419-431. 7. Aditi G., Anjali G., Singh J. (1999), New naphtoquinones from Plumbago zeylanica. Pharm. Biol. 37: 321 - 323. 8. Aggarwal B.B. (2004), Nuclear factor-kappaB: the enemy within, Cancer Cell; 6: 203-208. 9. Ahmad A., Banerjee S., Wang Z., Kong D. and Sarkar H.F. (2008), Plumbagin-induced apoptosis of human breast cancer cells is mediated by inactivation of NF-kappaB and Bcl-2. J. Cell Biochem; 105:1461–1471. 10. Ahmad A., Farhan A.S., Singh S., Hadi S.M. (2000). DNA breakage by resveratrol and Cu(II): Reaction mechanism and bacteriophage inactivation. Cancer Lett; 154:29–37. 11. Ahmad A., Syed F.A., Singh S., Hadi S.M. (2005), Prooxidant activity of resveratrol in the presence of copper ions: Mutagenicity in plasmid DNA. Toxicol Lett; 159:1–12. 12. Alexander P.D., Alloway B.J., Dourado A.M. (2006), Genotypic variations in the accumulation of Cd, Cu, Pb and Zn exhibited by six common grown vegetables. Environmental Pollution, 144: 736–745. 13. Aoki S. (2004), Resurrection of an ancestral gene: functional and evolutionary analyses of the Ng rol genes transferred from Agrobacterium to Nicotiana. J Plant Res; 117:329-37. 14. Aoki S., Syono K. (1999), Synergistic function of rolB, rolC, ORF13 and ORF14 of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes in hairy root induction in Nicotiana tabacum. Plant Cell Physiol; 40:252-256. 15. Aziz M.H., Dreckschmidt N.E., Verma A.K. (2008), Plumbagin, a medicinal plant-derived naphthoquinone, is a