MỤC LỤC
MỤC LỤC. iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . viii
DANH MỤC BẢNG.x
DANH MỤC HÌNH . xii
DANH MỤC PHỤ LỤC .xv
MỞ ĐẦU.1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA).3
1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona) .3
1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona .3
1.1.2.1. Các hợp chất diterpenoid ent-kaurane .4
1.1.2.2. Các hợp chất acetogenin .7
1.1.2.3. Các hợp chất alkaloid.19
1.1.2.4. Các hợp chất amide.23
1.1.2.5. Các hợp chất peptide vòng.24
1.1.2.6. Các hợp chất khác .25
1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Annona.27
1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .27
1.1.3.2. Hoạt tính kháng viêm.30
1.1.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.30
1.1.3.4. Hoạt tính kháng virus và ký sinh trùng.31
1.1.3.5. Hoạt tính chống oxy hóa .32
1.1.3.6. Hoạt tính khác .32
1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI NA BIỂN .34
1.2.1. Đặc điểm thực vật.34iv
1.2.2. Công dụng.35
1.2.3. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) trên thế giới.35
1.2.4. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) ở Việt Nam .36
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.38
2.1. MẪU THỰC VẬT .38
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT.39
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC).39
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế.39
2.2.3. Sắc ký cột (CC).39
2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC.39
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) .39
2.3.2. Độ quay cực ([α]D) .40
2.3.3. Phổ khối lượng (MS).40
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR).40
2.3.5. Phổ lưỡng sắc tròn (CD).40
2.3.6. Phương pháp xác định đường.40
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC.41
2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.41
2.4.1.1. Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào.41
2.4.1.2. Phân tích hình thái của các tế bào chết theo chương trình sử dụng
chất nhuộm Hoechst 33342.43
2.4.1.3. Western Blot .43
2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm .44
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.45
3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI NA BIỂN.45
3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT .48v
3.2.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới).48
3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) .48
3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) .49
3.2.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) .49
3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV.49
3.2.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane .50
3.2.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane .50
3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al.50
3.2.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid .50
3.2.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E.50
3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B .51
3.2.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid.51
3.2.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside (mới).51
3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside.51
3.2.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I .52
3.2.16. Hợp chất 16: Blumenol A.52
3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1.52
3.2.18. Hợp chất 18: Icariside D2 .52
3.2.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside.52
3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside.53
3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid.53
3.2.22. Hợp chất 22: Squamocin M.53vi
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.54
4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT.54
4.1.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới).54
4.1.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) .60
4.1.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) .65
4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) .70
4.1.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV.76
4.1.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane .78
4.1.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane .80
4.1.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al.82
4.1.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid .84
4.1.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E.85
4.1.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B .87
4.1.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid.89
4.1.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside (mới).91
4.1.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside.97
4.1.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I .99
4.1.16. Hợp chất 16: Blumenol A.101
4.1.17. Hợp chất 17: Icariside B1.102
4.1.18. Hợp chất 18: Icariside D2 .103
4.1.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside.105
4.1.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside.106vii
4.1.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid.107
4.1.22. Hợp chất 22: Squamocin M.108
4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC .112
4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn .112
4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất .112
4.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất.115
KẾT LUẬN.118
KIẾN NGHỊ .120
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .121
TÀI LIỆU THAM KHẢO.122
PHỤ LỤC. I
341 trang |
Chia sẻ: lavie11 | Lượt xem: 575 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na biển (annona glabra l.) (Số trang: 27; Định dạng: pdf), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
romethane với
lượng tối thiểu, tẩm với silica gel (1/2,5, m/m), trộn đều, cất loại dung môi đến khô,
nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải
gradient n-hexane/ethyl acetate (100/1 → 1/100, v/v) thu được 4 phân đoạn AG2.1-
AG2.4.
Phân đoạn AG2.2 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha
thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (4/1, v/v) thu được 3 phân
46
đoạn nhỏ hơn, AG2.2.1- AG2.2.3. Phân đoạn AG2.2.1 được đưa lên cột pha đảo với
hệ dung môi rửa giải bằng acetone/nước (3,0/1,0, v/v) thu được các hợp chất 6 (51,0
mg), 7 (321,0 mg) và 11 (217,0 mg). Phân đoạn AG2.2.2 được đưa lên cột pha đảo
với hệ dung môi rửa giải bằng acetone/nước (4/1, v/v) thu được các hợp chất 22
(400 mg).
Phân đoạn AG2.4 tiếp tục được phân tách thành 3 phân đoạn AG2.4.1-
AG2.4.3 bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-
hexane/acetone (2/1, v/v). Phân đoạn AG2.4.1 được tinh chế bằng cột kí silica gel
pha đảo với hệ dung môi acetone/nước (5/1, v/v) thu được hợp chất 8 (7,0 mg) và 9
(10,0 mg). Hợp chất 12 (9,0 mg) và 19 (7,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân
đoạn AG2.4.2 bằng cột sắc ký silica gel pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải
acetone/nước (3/1, v/v).
Dịch nước được cô quay loại bỏ ethyl acetate sau đó đưa lên cột Diaion HP-
20, loại bỏ đường bằng nước sau đó tăng dần nồng độ methanol trong nước (25, 50,
75 và 100% methanol) thu được 4 phân đoạn, AG4.1− AG4.4.
Phân đoạn AG4.1 được đưa lên cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18 với hệ
dung môi rửa giải acetone /nước (1/2, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn, AG4.1.1-
AG4.1.3. Phân đoạn AG4.1.1 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha
thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (15/1, v/v) thu được
hợp chất 10 (10,0 mg) và hợp chất 13 (5,0 mg). Hợp chất 16 (6,0 mg) và 18 (5,0
mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn AG4.1.2 bằng cột sắc ký silica gel pha
thường sử dụng hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (15/1, v/v). Hợp
chất 14 (8,0 mg), 20 (6,0 mg) và 21 (7,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn
AG4.1.3 bằng cột sắc ký silica gel pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải
acetone/nước (3/1, v/v).
Phân đoạn AG4.3 được phân tách bằng cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung
môi dichloromethane/methanol (6/1, v/v) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn AG4.3.1−
AG4.3.3. Phân đoạn AG4.3.1 được đưa lên cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18 với
hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1/1,5, v/v) thu được hợp chất 1 (5,0 mg) và 4
(3,0 mg). Phân đoạn AG4.3.2 được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi
47
dichloromethane/ethyl acetate (10/1, v/v) thu được 2 phân đoạn AG4.3.2.1 và
AG4.3.2.2. Ba hợp chất 2 (4,0 mg), 3 (3,0 mg) và 5 (6,0 mg) thu từ phân đoạn
AG4.3.2.1 bởi cột silica gel pha đảo với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v). Hai
hợp chất 15 (5,0 mg) và 17 (5,0 mg) thu từ phân đoạn AG4.3.2.2 bởi cột silica gel
pha đảo với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v).
Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A. glabra)
48
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước
3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT
3.2.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới)
Chất bột vô định hình, màu trắng.
Độ quay cực [ ]25Dα : –64,9 (c 0,1, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 298-299oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.1.
HR-ESI-MS: m/z 375,2159 [M+Na]+.
Tính toán lý thuyết [C20H32O5Na]+: 375,2142.
Công thức phân tử C20H32O5, M = 352.
3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-
glucopyranoside ester (mới)
Chất bột vô định hình, màu trắng.
49
Độ quay cực [ ]25Dα : –40,7 (c 0,1, MeOH);
Nhiệt độ nóng chảy: 185-186oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.2.
HR-ESI-MS: m/z 521,2732 [M+Na]+.
Tính toán lý thuyết [C26H42O9Na]+: 521,2721.
Công thức phân tử C26H42O9, M = 498.
3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-
glucopyranoside ester (mới)
Chất bột vô định hình, màu trắng.
Độ quay cực [ ]25Dα : –38,5 (c 0,1, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 280-281oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.3.
HR-ESI-MS: m/z 519,2550 [M+Na]+.
Tính toán lý thuyết [C26H40O9Na]+: 519,2565.
Công thức phân tử C26H40O9, M = 496.
3.2.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-
glucopyranoside ester (mới)
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]25Dα : – 40 (c 0,1, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 191-192oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.4.
HR-ESI-MS: m/z 681,3095.
Tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+: 681,3093.
Công thức phân tử C32H50O14, M = 658.
3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : +56 (c 0,1, MeOH)
Nhiệt độ nóng chảy: 192-193oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.5.
Công thức phân tử C26H42O9, M = 498.
50
3.2.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane
Tinh thể hình kim, không màu.
Độ quay cực [ ]31Dα : -25 (c 0,1, CHCl3)
Nhiệt độ nóng chảy: 153-154oC.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.6.
Công thức phân tử C20H34O2, M = 306.
3.2.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane
Tinh thể hình kim, không màu.
Độ quay cực [ ]31Dα : -32 (c 0,1, CHCl3)
Nhiệt độ nóng chảy: 151-152oC.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.7.
ESI-MS: m/z 329,2 [M+Na]+.
Công thức phân tử C20H34O2, M = 306.
3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al
Tinh thể hình kim, không màu.
Độ quay cực [ ]31Dα : – 45 (c 0,1, CHCl3).
Nhiệt độ nóng chảy: 186-187oC.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.8.
ESI-MS: m/z 319,2 [M-H]-.
Công thức phân tử C20H32O3, M = 320.
3.2.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid
Tinh thể hình kim, không màu.
Độ quay cực [ ]31Dα : – 57 (c 0,01, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 296-297oC.
1H-NMR (500 MHz, C5D5N) và 13C-NMR (125 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.9.
ESI-MS: m/z 335,2 [M-H]-.
Công thức phân tử C20H32O4, M = 336.
3.2.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : – 70 (c 0,07, MeOH).
51
Nhiệt độ nóng chảy: 203-204oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.10.
ESI-MS: m/z 319 [M-H]−
Công thức phân tử C20H32O3, M = 320.
3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : – 40 (c 0,1, CHCl3).
Nhiệt độ nóng chảy: 166-167oC.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.11.
ESI-MS: m/z 361 [M-H]-.
Công thức phân tử C22H34O4, M = 362.
3.2.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : -61 (c 0,1, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 278-279oC.
1H-NMR (500 MHz, C5D5N) và 13C-NMR (125 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.12.
Công thức phân tử C19H30O3, ,M = 306.
3.2.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-
D-glucopyranoside (mới)
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]25Dα : −25,0 (c 0,1, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 229-230oC.
CD (c = 1,5 ×10-5, MeOH), [θ] (λmax, nm) –52481 (237).
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.13.
HR-ESI-MS: m/z 629,2431[M+Na]+.
Tính toán lý thuyết: [C27H42O15Na]+ 629,2416.
Công thức phân tử C27H42O15, M = 606.
3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-D-
glucopyranoside
Chất bột, màu trắng.
52
Nhiệt độ nóng chảy: 199-200oC.
Độ quay cực [ ]31Dα : -110 (c 1,0, MeOH).
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.14.
Công thức phân tử C21H32O10, M = 444.
3.2.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I
Dạng dầu màu vàng nhạt.
Độ quay cực [ ]31Dα : + 35 (c 0,1, MeOH).
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.15.
Công thức phân tử C13H20O4, M = 240.
3.2.16. Hợp chất 16: Blumenol A
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : +25 (c 0,3, CHCl3)
Nhiệt độ nóng chảy: 112-113oC.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.16.
Công thức phân tử C13H20O3, M = 224.
3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : -42 (c 0,05, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 183-184oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.17.
Công thức phân tử C19H30O8, M = 386.
3.2.18. Hợp chất 18: Icariside D2
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : -52 (c 0,1, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 151-152oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.18.
Công thức phân tử C14H20O7, M = 300.
3.2.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside
Chất bột, màu trắng.
53
Độ quay cực [ ]31Dα : -32 (c 0,05, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 178-179oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.19.
Công thức phân tử C18H26O11, M = 418.
3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside
Chất bột, màu trắng.
Độ quay cực [ ]31Dα : -26 (c 0,4, MeOH).
Nhiệt độ nóng chảy: 195-196oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.20.
Công thức phân tử C14H20O8, M = 316.
3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid
Chất bột, màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 190-191oC.
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): xem Bảng 4.21.
Công thức phân tử C7H6O4, M = 154.
3.2.22. Hợp chất 22: Squamocin M
Dạng sáp, màu trắng.
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): xem Bảng 4.22.
Công thức phân tử C37H66O6, M = 606.
54
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
4.1.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới)
COOH
1
3
4
5
810
11 13
18
15
16 17
20
H
OH
1
H
19
H
OH
OH
COOH
H
H
H
OH
OH
1a
COOH
H
H
H
OH
OH
9
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 1 và hợp chất tham khảo
Hợp chất 1 thu được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của 1
được xác định là C20H32O5 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-
MS xuất hiện pic ion tại m/z 375,2159 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức
[C20H32O5Na]+: 375,2142).
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của 2 nhóm methyl bậc ba dưới
dạng singlet tại δH 1,00 (3H, s) và 1,18 (3H, s), 1 nhóm oxymethine tại δH 3,63 (1H, br
s), 1 nhóm oxymethylene tại δH 3,62 (1H, d, J = 11,5 Hz) và 3,72 (1H, d, J = 11,5 Hz).
Trên phổ 13C-NMR và DEPT của 1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử
cacbon trong đó có 1 cacbon cacboxylic, 4 cacbon không có hydro, 4 nhóm
methine, 9 nhóm methylene và 2 nhóm methyl. Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý
đây là một diterpenoid khung ent-kaurane. So sánh số liệu 13C-NMR của 1 với hợp
chất có khung ent-kaurane tương tự, 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9)
[138] gợi ý 1 có cùng cấu trúc khung ent-kaurane.
Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,18) với C-3 (δC 34,23)/C-4 (δC
44,25)/C-5 (δC 48,09)/C-19 (δC 182,00) khẳng định vị trí của nhóm methyl và
cacboxylic tại C-4. Nhóm methyl tại C-4 được xác định có cấu hình β bởi tương tác
NOESY giữa H-18 (δH 1,18) với H-5 (δH 1,77). Tương tác HMBC từ H-13 (δH
2,08)/H-15 (δH 1,56 và 1,74) tới C-16 (δC 82,86)/C-17 (δC 66,71) khẳng định vị trí
của 2 nhóm hydroxyl tại C-16 và C-17.
55
Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo
C δC(#) δC($) DEPT δC(@) δH(@)
1 41,2 41,1 CH2 41,71 0,93 (m)
1,87 (m)
2 19,9 19,8 CH2 20,29 1,44 (m)
1,96 (m)
3 38,8 38,7 CH2 34,23 1,08 (dd, J = 4,5 Hz, 13,5 Hz)
2,17 (d, J = 13,5 Hz)
4 44,0 43,9 C 44,25 -
5 57,1 57,0 CH 48,09 1,77 (d, J = 9,0 Hz)
6 22,5 23,0 CH2 30,48 1,98 (m)
2,11 (m)
7 42,6 42,8 CH 78,05 3,63 (br s)
8 43,9 45,0 C 49,00 -
9 56,8 56,3 CH 51,08 1,43 (d, J = 7,5 Hz)
10 40,1 40,1 C 40,44 -
11 19,5 19,0 CH2 19,11 1,57 (m)
1,64 (m)
12 26,7 26,8 CH2 27,64 1,57 (m)
1,68 (m)
13 41,7 45,9 CH 46,09 2,08 (m)
14 38,6 37,8 CH2 37,50 1,70 (dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz)
1,83 (d, J = 12,0 Hz)
15 53,5 53,9 CH2 50,13 1,56 (d, J = 13,5 Hz)
1,74 (d, J = 13,5 Hz)
16 79,8 81,7 C 82,86 -
17 70,5 66,5 CH2 66,71 3,62 (d, J = 11,5 Hz)
3,72 (d, J = 11,5 Hz)
18 29,4 29,3 CH3 29,27 1,18 (s)
19 180,2 180,1 C 182,00 -
20 16,0 16,0 CH3 16,14 1,00 (s)
#δC của 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9) đo trong CDCl3 [138], $δC của 16α,17-
dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (1a) đo trong CDCl3 [138], @ đo trong CD3OD.
Bên cạnh đó, cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-16 được xác định là α bằng
cách so sánh độ chuyển dịch C-13 (δC 46,09), C-16 (δC 82,86), và C-17 (δC 66,71)
của 1 với các hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9) [138] [δC 41,7
(C-13), 79,8 (C-16) và 70,5 (C-17)] và 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid
(1a) [138] [δC 45,9 (C-13), 81,7 (C-16) và 66,5 (C-17)]. Vị trí của nhóm hydroxyl
tại C-7 được xác định thông qua tương tác HMBC giữa H-5 (δH 1,77)/H-15 (δH
56
1,74) với C-7 (δC 78,05) cùng với đó là tương tác COSY giữa các proton H-5 (δH
1,77)/H-6 (δH 1,98 và 2,11)/H-7 (δH 3,63).
Thêm vào đó, tương tác NOESY giữa H-7 (δH 3,63) với H-14 (δH 1,70) và
dạng tín hiệu broad singlet của H-7, cho phép khẳng định H-7 có cấu hình α (vị trí
equatorial). Từ các phân tích trên, hợp chất 1 được xác định là 7β,16α,17-
trihydroxy-ent-kauran-19-oic. Tra cứu trên Science Finder cho phép kết luận đây là
hợp chất mới.
1
COOH
OH
OH
OH
HH
H C
COSY
HMBC
Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY quan trọng của hợp chất 1
Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1
57
Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1
Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1
58
Hình 4.6. Phổ DEPT của hợp chất 1
Hình 4.7. Phổ HSQC của hợp chất 1
59
Hình 4.8. Phổ HMBC của hợp chất 1
Hình 4.9. Phổ COSY của hợp chất 1
60
Hình 4.10. Phổ NOESY của hợp chất 1
4.1.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-
glucopyranoside ester (mới)
1
3
4
5
810
11 13
18
15
16 17
20
H
OH
H
OH
2a
OO
OHHOHO
HO
H H
19
H H
OH
O
2
OO
OHHOHO
HO
1'
3'
6'
O
CHO
H
OH
2b
H
H
Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo
Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử
của 2 được xác định là C26H42O9 dựa vào kết quả phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion
phân tử tại m/z 521,2732 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức
[C26H42O9Na]+: 521,2721). Phổ 1H-NMR của 2 khá giống 1 đều có sự xuất hiện tín
hiệu 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,99 (3H, s) và 1,22 (3H, s), 1 nhóm oxymethine
61
tại δH 3,50 (1H, br s), 1 nhóm oxymethylene tại δH 3,35 (2H, m) gợi ý 2 cũng có cấu
trúc khung ent-kaurane. Bên cạnh đó, tín hiệu 1 proton anome tại δH 5,42 (1H, d, J
= 8,0 Hz) cho thấy sự có mặt của 1 phân tử đường.
Phổ 13C-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, bao gồm 1
nhóm cacboxyl, 3 cacbon bậc 4, 10 cacbon methine (trong đó có 6 nhóm
oxymethine), 10 cacbon methylene (trong đó có 2 nhóm oxymethylene) và 2 nhóm
methyl. Phổ 1H- và 13C-NMR của 2 khá tương đồng với hợp chất helikauranoside A
(2a) [13], ngoại trừ 2 xuất hiện thêm nhóm hydroxyl tại C-7.
Vị trí nhóm hydroxyl tại C-7 được khẳng định bởi tương tác HMBC giữa
proton H-5 (δH 1,78)/H-9 (δH 1,43)/H-15 (δH 1,12 và 1,71) với C-7 (δC 78,70).
Tương tự như 1, cấu trúc lập thể của proton H-7 trong 2 được xác định là α (vị trí
equatorial) bởi dạng tín hiệu broad singlet của H-7. Tương tác HMBC giữa H-17
(δH 3,35) với C-13 (δC 39,46)/C-15 (δC 42,58)/C-16 (δC 44,66) gợi ý có nhóm
hydroxyl tại C-17. Bên cạnh đó, cấu trúc lập thể của nguyên tử hydro tại C-16 được
xác định là α bằng việc so sánh giá trị độ chuyển dịch của C-12 (δC 32,96) C-13 (δC
39,46), C-16 (δC 44,66) và C-17 (δC 67,66) với dữ kiện của 16α-ent-kaurane:
helikauranoside A (2a) [δC 32,5 (C-12), 39,5 (C-13), 44,5 (C-16) và 67,7 (C-17)]
[13] và 16β-ent-kaurane: 17-hydroxy-16β-ent-kauran-19-al (2b) [δC 25,8 (C-12),
36,9 (C-13), 43,1 (C-16), và 64,1 (C-17)] [138]. Tương tác HMBC giữa H-18 (δH
1,22) với C-3 (δC 39,09)/C-4 (δC 44,69)/C-5 (δC 49,50)/C-19 (δC 178,67) khẳng định
nhóm cacboxyl tại C-4.
Thủy phân hợp chất 2 trong môi trường axit thu được đường D-glucose (xác
định bằng dẫn xuất TMS). Bên cạnh đó, tương tác HMBC giữa proton anome H-1′
(δH 5,42) với C-19 (δC 178,67) cho thấy phân tử đường D-glucose liên kết với
aglycone tại C-19. Bên cạnh đó hằng số tương tác JH-1′/2′ = 8,0 Hz chứng tỏ H-1′ và
H-2′ đều chiếm vị trí axial. Do đó, nhóm hydroxyl tại cacbon anomeric có cấu hình
β. Căn cứ vào những dữ kiện phổ trên, 2 được xác định là 7β,17-dihydroxy-16α-ent-
kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester. Hợp chất này cũng là hợp chất
mới.
62
O
O
O
OH
HOHO
HO
OH
OH
Hình 4.12. Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 2
Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo
C δC(#) δC($) δC(@) δH(@)
1 42,1 41,9 41,77 0,94 (m)/1,88 (m)
2 20,0 19,0 20,20 1,45 (m)/1,94 (m)
3 39,1 39,8 39,09 1,13 (m)/2,22 (m)
4 45,1 48,4 44,69 -
5 58,8 56,6 49,50 1,78 (d, J = 13,0 Hz)
6 23,5 20,1 30,68 1,97 (m)/2,18 (dd, J = 13,0 Hz, 14,5 Hz)
7 43,0 40,5 78,70 3,50 (br s)
8 45,9 44,0 49,80 -
9 56,0 55,9 50,62 1,43 (m)
10 40,9 39,3 40,47 -
11 20,2 18,3 19,51 1,57 (m)/1,63 (m)
12 32,5 25,8 32,96 1,43 (m)/1,63 (m)
13 39,5 36,9 39,46 2,11 (m)
14 37,9 34,2 37,17 1,08 (m)/1,80 (d, J = 11,5 Hz)
15 46,3 43,6 42,58 1,12 (m)/1,71 (dd, J = 3,5 Hz, 10,0 Hz)
16 44,5 43,1 44,66 1,94 (m)
17 67,7 64,1 67,66 3,35 (m)
18 29,1 24,2 28,82 1,22 (s)
19 178,3 206,0 178,67 -
20 16,5 16,3 16,28 0,99 (s)
19-OGlc
1′ 95,6 95,66 5,42 (d, J = 8,0 Hz)
2′ 74,1 74,07 3,38 (m)
3′ 78,7 78,67 3,45 (m)
4′ 71,1 71,14 3,39 (m)
5′ 78,7 78,56 3,39 (m)
6′ 62,4 62,42 3,71(dd, J = 4,0 Hz, 11,5 Hz)
3,86 (d, J = 11,5 Hz)
#δC của helikauranoside A (2a) đo trong CD3OD [13], $δC của 17-hydroxy-16β-ent-kauran-19-al
(2b) đo trong CDCl3 [138], @ đo trong CD3OD.
63
Hình 4.13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2
Hình 4.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2
64
Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2
Hình 4.16. Phổ HSQC của hợp chất 2
65
Hình 4.17. Phổ HMBC của hợp chất 2
4.1.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-D-
glucopyranoside ester (mới)
3
O
O
O
OHHOHO
HO
OH
OH
1
3
4
5
810
11 13
18
15
16 17
20
H
OH
H
19
H
OH
3
OO
OHHOHO
HO
1'
3'
6'
O
Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 3
Hợp chất 3 thu được được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử
của 3 được xác định là C26H40O9 bởi sự xuât hiện pic ion phân tử tại m/z 519,2550
trên phổ HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H40O9Na]+: 519,2565).
66
Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3
C DEPT δC(@) δH(@)
1 CH2 41,72 1,03 (dd, J = 3,5 Hz, 13,5 Hz)
1,87 (d, J = 13,5 Hz)
2 CH2 20,17 1,44 (dt, J = 5,0 Hz, 10,0 Hz)
1,96 (m)
3 CH2 39,10 1,12 (dd, J = 4,0 Hz, 13,5 Hz)
2,22 (m)
4 C 44,71 -
5 CH 48,30 1,78 (m)
6 CH2 29,28 1,96 (m)
2,23 (m)
7 CH 75,62 3,59 (br s)
8 C 54,25 -
9 CH 43,56 1,39 (d, J = 7,5 Hz)
10 C 40,88 -
11 CH2 19,65 1,58 (m)
1,64 (m)
12 CH2 26,33 1,52 (m)
13 CH 42,19 2,57 (m)
14 CH2 43,51 1,42 (dd, J = 7,5 Hz, 10,5 Hz)
2,06 (d, J = 10,5 Hz)
15 CH 132,13 5,81 (s)
16 C 148,11 -
17 CH2 61,21 4,13 (d, J = 1,0 Hz)
18 CH3 28,79 1,22 (s)
19 C 178,58 -
20 CH3 16,10 1,02 (s)
19-OGlc
1′ CH 96,64 5,42 (d, J = 7,5 Hz)
2′ CH 74,06 3,38 (m)
3′ CH 78,70 3,42 (m)
4′ CH 71,13 3,40 (m)
5′ CH 78,69 3,39 (m)
6′ CH2 62,41 3,71 (dd, J = 4,0 Hz, 12,0 Hz)
3,85 (dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz)
@ đo trong CD3OD
67
Phổ 1H-NMR của 3 xuất hiện tín hiệu 1 proton olefin tại δH 5,81 (1H, s) và 2
nhóm methyl tại δH 1,02 (3H, s) và 1,22 (3H, s), gợi ý sự có mặt của cấu trúc khung
ent-kaurane; tín hiệu 1 proton anome tại δH 5,42 (1H, d, J = 7,5 Hz) cho thấy 3 có
cấu trúc khung ent-kaurane đính đường.
Phổ 13C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, trong đó
có 20 nguyên tử cacbon thuộc khung ent-kaurane diterpenoid và 6 nguyên tử
cacbon của một phân tử đường. Phổ 1H- và 13C-NMR của 3 khá giống với 7β,17-
dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2), ngoại
trừ sự xuất hiện thêm liên kết đôi tại C-15/C-16. Liên kết đôi này được xác định
dựa trên các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 1,42 và 2,06)/H-17 (δH 4,13) với C-15
(δC 132,13)/C-16 (δC 148,11); giữa H-15 (δH 5,81) với C-7 (δC 75,62)/C-8 (δC
54,25)/C-9 (δC 43,56)/C-14 (δC 43,51)/C-16 (δC 148,11)/C-17 (δC 61,21). Cấu hình
của nhóm hydroxyl tại C-7 dược xác định tương tự như 7β,17-dihydroxy-16α-ent-
kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2). Từ những dữ kiện phổ trên,
3 được xác định là một hợp chất mới có tên khoa học 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15-
en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester.
Hình 4.19. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 3
68
Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3
Hình 4.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3
69
Hình 4.22. Phổ HSQC của hợp chất 3
Hình 4.23. Phổ HMBC của hợp chất 3
70
4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-D-
glucopyranoside ester (mới)
O
O
O
OH
HO
HO
HO
O
O
O
OH
HOHO
HO
1
3
4
5
810
11 13
18
15
16
17
19
20
1'
3'
6'
1"
3"
6"
H
4
COOH
COOH
H
4a
H H
Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo
Hợp chất 4 phân lập được dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử
của hợp chất 4 được xác định là C32H50O14 bởi sự xất hiện pic ion phân tử tại m/z
681,3095 trên phổ HR-ESI-MS (tính toán lý thuyết cho công thức [C32H50O14Na]+:
681,3093). Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 2 nhóm methyl bậc
ba tại δH 0,97 (3H, s) và 1,24 (3H, s), gợi ý sự có mặt của cấu trúc khung ent-
kaurane; 2 proton anome tại δH 5,43 (d, J = 8,0 Hz) và 5,53 (d, J = 8,0 Hz), gợi ý sự
có mặt của 2 phân tử đường.
Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 32 nguyên tử
cacbon gồm 2 cacbonyl, 3 cacbon bậc bốn, 14 nhóm methine, 11 nhóm methylene
và 2 nhóm methyl. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất 4 giống với của hợp
chất 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) [71], ngoại trừ sự xuất hiện tín
hiệu của 2 phân tử đường tại C-17 và C-19.
Tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,24) với C-3 (δC 39,04)/C-4 (δC 45,11)/C-5
(δC 58,61)/C-19 (δC 178,43) gợi ý sự có mặt của nhóm methyl và cacboxyl tại C-4;
giữa proton H-13 (δH 2,55)/H-15 (δH 1,59 và 1,97)/H-16 (δH 3,06) với C-17 (δC
175,32) khẳng định nhóm cacboxyl tại C-16; giữa H-1′ (δH 5,53) với C-17 (δC
175,32) và giữa H-1″ (δC 5,43) với C-19 (δC 178,43) khẳng định vị trí của 2 phân tử
glucopyranosyl tại C-17 và C-19. Tương tác NOESY giữa H-18 (δH 1,24) với H-5
(δH 1,15) nhưng không có tương tác với H-20 (δH 0,97) chứng tỏ nhóm methyl tại
C-4 có cấu hình β.
71
Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo
C δC(#) DEPT δC(@) δH(@)
1 40,0 CH2 41,44 0,87(m)/1,88 (m)
2 20,3 CH2 19,15 1,52 (m)/1,69 (m)
3 41,1 CH2 39,04 1,11 (m)
1,21 (d, J = 14,0 Hz)
4 44,8 C 45,11 -
5 58,2 CH 58,61 1,15 (m)
6 23,5 CH2 23,19 1,88 (m)/2,00 (m)
7 41,6 CH2 42,91 1,57 (m)/1,96 (m)
8 45,6 C 45,62 -
9 57,8 CH 57,59 1,08 (m)
10 40,8 C 40,83 -
11 19,3 CH2 20,14 1,43 (m)/1,94 (m)
12 28,5 CH2 28,05 1,47 (m)/1,71 (m)
13 40,5 CH 41,09 2,55 (m)
14 43,1 CH2 41,87 1,17 (m)
2,16 (d, J = 12,0 Hz)
15 42,0 CH2 42,69 1,59 (m)/1,97 (m)
16 46,7 CH 46,62 3,06 (m)
17 178,1 C 175,32 -
18 29,5 CH3 29,04 1,24 (s)
19 180,6 C 178,43 -
20 16,8 CH3 16,36 0,97 (s)
17-O-Glc
1' CH 95,61 5,53 (d, J = 8,0 Hz)
2' CH 74,04 3,35 (m)
3' CH 78,68 3,48 (m)
4' CH 71,11 3,42 (m)
5' CH 78,68 3,40 (m)
6' CH2 62,40 3,71 (dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz)
3,84 (d, J = 11,5 Hz)
19-O-Glc
1'' CH 95,61 5,43 (d, J = 8,0 Hz)
2'' CH 74,04 3,38 (m)
3'' CH 78,68 3,48 (m)
4'' CH 71,11 3,42 (m)
5'' CH 78,68 3,40 (m)
6'' CH2 62,34 3,71 (dd, J = 2,0 Hz, 11,5 Hz)
3,84 (d, J = 11,5 Hz)
#δC của 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) đo trong CD3OD [71], @ đo trong CD3OD.
72
Ngoài ra, tương tác NOESY của H-16 (δH 3,06) với H-13 (δH 2,55); H-16 (δH
3,06) với Hα-15 (δH 1,59); và giữa H-9 (δH 1,08) với Hβ-15 (δH 1,97) khẳng định cấu
hình α của H-16. Thủy phân hợp chất 4 trong môi trường axit thu được D-glucose
[17]. Bên cạnh đó, hằng số tương tác J giữa glc H-1′/glc H-2′; glc H-1″/glc H-2″, J
= 8,0 Hz cho phép khẳng định các proton này đều chiếm vị trí axial. Do đó, 2 nhóm
hydroxyl liên kết với cacbon anomeric C-1′ và C-1′′ có cấu hình β. Từ những dữ
kiện phổ trên, hợp chất mới 4 được xác định là 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic
acid 17,19-di-O-β-D-glucopyranoside ester.
O
O
O
OH
HOHO
HO
O
O
O
OH
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- tv_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc_cay_na_bien_annona_glabra_l_1092_1920122.pdf