Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài nàng nàng (callicarpa candicans) và loài tử châu lá to (callicarpa macrophylla) ở Việt Nam

ệ dung môi rửa giải methanol:nước (3:7) thu được hợp chất C7 (dạng vô định hình, không màu, Rf = 0,5 (chloroform:methanol 9:1), 12,5 mg). 1H-NMR (500 MHz, CDCl3-CD3OD),  (ppm): 5,13 (1H, d, J = 14,6 Hz, H-12); 3,40 (1H, dd, J = 4,2 và 13,7 Hz, H-2); 2,73 (1H, d, J = 9,3 Hz, H-3); 2,10 (1H, d, J = 11,2 Hz, H-18); 1,03 (3H, s, H-27); 0,91 (3H, s, H-23); 0,90 (3H, s, H-25); 0,89 (3H, d, J = 4,0 Hz, H-29); 0,80 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-30); 0,73 (3H, s, H-24); 0,69 (3H, s, H-26). 13C-NMR (125MHz, CDCl3-CD3OD),  (ppm): 47,0 (C-1); 67,1 (C-2); 82,2 (C- 3); 45,3 (C-4); 52,3 (C-5); 18,0 (C-6); 32,6 (C-7); 38,8 (C-8); 46,9 (C-9); 37,5 (C- 10); 22,7 (C-11); 124,4 (C-12); 138,2 (C-13); 41,6 (C-14); 27,4 (C-15); 23,7 (C-6); 46,8 (C-17); 54,7 (C-18); 38,4 (C-19); 38,4 (C-20); 30,1 (C-21); 36,2 (C-22); 28,8 (C-23); 16,9 (C-24); 16,4 (C-25); 16,9 (C-26); 23,3 (C-27); 178,2 (C-28); 21,0 (C- 29); 17,1 (C-30). 54  Hợp chất 2β,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8) Phân đoạn CCE4.2 (0,1 g) được tinh chế qua cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải methanol thu được hợp chất C8 (dạng chất vô định hình, không màu, Rf = 0,75 (chloroform: methanol 5 : 1), mp: 295-296 oC, 11,5 mg). 1H -NMR (500 MHz, CDCl3- CD3OD),  (ppm): 5,3 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12); 3,72 (1H, dt, J = 10,5 và 5,6 Hz, H-2); 2,2 (1H, d, J = 11,3 Hz, H-18); 3,53 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-23b); 3,38 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-3); 3,31 (1H, d, J = 9,9 Hz, H-23a); 0,72 (3H, s, H-24); 0,87 (3H, s, H-25); 1,06 (3H, s, H-26); 1,2 (3H, s, H-27); 0,98 (3H, d, J = 4,5 Hz, H-30); 0,91 (3H, d, J = 6,9 Hz, H-30). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3- CD3OD),  (ppm): 48,0 (C-1); 69,7 (C-2); 78,3 (C- 3); 44,1 (C-4); 48,5 (C-5); 19,1 (C-6); 33,7 (C-7); 40,8 (C-8); 48,2 (C-9); 38,9 (,C-10); 24,5 (C- 11); 126,7 (C-12); 139,8 (C-13); 43,4 (C-14); 29,2 (C-15); 25,3 (C-16); 49,5 (C-17); 54,4 (C- 18); 40,4 (C-19); 40,4 (C-20); 31,8 (C-21); 38,1 (C-22); 66,4 (C-23); 13,9 (C-24); 17,7 (C- 25); 17,9 (C-26); 24,2 (C-27); 181,1 (C-28); 17,7 (C-29); 21,6 (C- 30).  Hợp chất genkwanin (C9) Phân đoạn CCE2 (1,3 g) được tách lặp lại trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi rửa giải CH2Cl:MeOH (20:1→10:1) thu được bốn phân đoạn nhỏ từ CCE2.1→CCE2.4. Phân đoạn CCE2.2 (0,55 g) được thực hiện trên cột silica gel hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được hợp chất C9 (dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, Rf = 0,68 (chloroform:methanol 9:1), 13,0 mg). 1H-NMR (500 MHz, DMSO,  ppm): 12,95 (1H, s, 5-OH); 7,94 (d, J = 7,0 Hz, H-2',6'); 6,94 (d, J = 7,0 Hz, H-3',5'); 6,84 (1H, s, H-3); 6,77 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 3,87 (3H, s, 7-OCH3). 13C-NMR (125 MHz, DMSO,  ppm): 164,1 (C-2); 103,0 (C-3); 181,9 (C-4); 161,2 (C-5); 97,9 (C-6); 165,1 (C-7); 92,7 (C-8); 157,2 (C-9); 104,7 (C-10); 121,0 (C-1'); 128,5 (C-2',6′); 116,0 (C-3',5′; 161,3 (C-4').  Hợp chất cynaroside (C10) Phân đoạn CCE2.3 (0,55 g) được thực hiện trên cột silica gel rửa giải bằng dung môi CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được hợp chất C10 (dạng chất bột màu vàng nhạt, Rf= 0,67 (chloroform:methanol 7:1), mp: 256-258 oC, 10,8 mg). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD,  ppm): 7,46 (1H, dd, J= 2,5 và 8,0 Hz, H-6'); 7,43 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'); 6,93 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'); 6,83 (1H, d, J = 2,5 55 Hz, H-8); 6,63 (1H, s, H-3); 6,52 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6); 5,09 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1"); 3,94 (1H, dd, J = 2,5 Hz và 12,5 Hz, H-6b"); 3,73 (1H, dd, J = 6,0 và 12,5 Hz, H-6a"); 3,56 (1H, m, H-5"); 3,51 (1H, m, H-3"); 3,51 (1H, m, H-2"); 3,42 (1H, m, H-4"). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD,  ppm): 166,9 (C-2); 104,2 (C-3); 184,1 (C-4); 162,9 (C-5); 101,7 (C-6); 164,8 (C-7); 96,1 (C-8); 159,0 (C-9); 107,1 (C-10); 121,5 (C-1'); 114,3 (C-2'); 147,1 (C-3'); 151,2 (C-4'); 116,8 (C-5'); 120,5 (C-6'); 100,5 (C- 1"), 74,7 (C-2"); 78,4 (C-3"); 71,3 (C-4"); 77,9 (C-5"); 62,5 (C-6"). 3.3. Xác định thành phần tinh dầu lá Tử châu lá to và Nàng nàng Xác định thành phần hóa học của tinh dầu lá Tử châu lá to và Nàng nàng được thực hiện như mục 2.3 trang 36. Kết quả về thành phần hóa học của tinh dầu được trình bày ở mục 4.1 trang 56. 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết và hợp chất phân lập được Hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư gan, phổi và vú của các cặn chiết và một số hợp chất phân lập được phân lập từ lá và hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư (gan, phổi, tiền liệt tuyến) và vi sinh vật kiểm định của hai loài nghiên cứu được thử nghiệm tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được trình bày trong mục 4.26 trang 131. 56 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thành phần hóa học của tinh dầu cây Nàng nàng và cây Tử châu lá to Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định và nhận dạng một cách chính xác dựa vào sự kết hợp của hệ thống máy sắc kí khí ghép khối phổ với thư viện phổ chuẩn và phần mềm khóa thời gian lưu Mass Finder 4.0. 4.1.1. Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng Phân tích GC - MS trong thành phần lá khô Nàng nàng có 39 cấu tử, chiếm 92,57% tổng hàm lượng. Trong đó có 25 sesquiterpene hydrocacbon (62,98%) và 11 sesquiterpen có chứa oxi (22,46%). Có 03 cấu tử chưa xác định tại thời gian lưu (RI) là: 1626, 1653, 1672 chiếm 7,13% tổng hàm lượng. α - Gurjunene (21,97%) được xác định là cấu tử chính trong tinh dầu, tiếp theo là δ -cadinene (7,78%), α- selinene (5,13%), α-cadinol (5,13%), E- caryophyllene( 5,09%), α- copaene (4,43%), β - selinene (3,90%), γ - muurolene (3,84%), 1-epi- cubenol (3,60%), ledol (2,54%), neo - intermedeol (2,53%), γ - cadinene (2,36%) và caryophyllene oxit (2,00%). Trong thành phần tinh dầu của lá tươi cây Nàng nàng có 47 cấu tử chiếm 93,17% tổng hàm lượng. Trong đó có 28 sesquiterpene hydrocarbon (69,84%), 12 sesquiterpen (16,50%), 01 monosesquiterpene hydrocarbon (0,24%), 01 monosesquiterpene (0,31%), 01 dẫn xuất diterpene (0,55%) và 01 benzenoid (0,13%). Ngoài ra, tinh dầu lá tươi còn chứa 03 cấu tử chưa xác định được tại (RI): 1626, 1653, 1672 chiếm 5,6 %. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là α - Gurjunene (21,31%), δ- cadinene (7,70%), E- caryophyllene (6,32%), α- selinene (5,71%), γ- muurolene (5,66%), α - copaene (5,39%). Thành phần tinh dầu hoa Nàng nàng có 47 cấu tử chiếm 92,86% tổng hàm lượng. Trong đó còn 3 cấu tử chưa xác định được tại thời gian lưu là 27,77; 27,84 và 28,86 chiếm 30,61% tổng hàm lượng. Các cấu tử có hàm lượng chính được xác định trong tinh dầu hoa cây Nàng nàng là E- caryophyllene (5,07%), α- selinene (5,66%), δ- cadinene (5,44%). Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng (C. candicans) được thể hiện trong bảng 4.1. 57 Bảng 4.1. Thành phần hóa học tinh dầu lá và hoa Nàng nàng (C. candicans) STT Rt RI Hợp chất Công thức PP vi sóng PP cất thông thường Mẫu lá tươi Mẫu lá tươi Mẫu lá khô Hoa tươi Hàm lượng % 1 11,50 984 β-pinene - 0,24 - 0,26 2 15,51 1103 Linalool - 0,31 - 0,32 3 18,91 1200 α-terpineol - - - 0,10 4 19,07 1204 Methyl salicylate - 0,13 - - 5 22,17 1294 (E)-anethole (trans - anethole) - - - 0,22 6 23,95 1348 -elemene - 0,27 - - 58 7 24,36 1360 α-cubebene 0,3 0,40 0,31 0,35 8 25,17 13841 385 α-ylangene 0,62 0,70 0,59 0,47 9 25,34 1389, 1390 α-copaene 5,4 5,39 4,43 2,72 10 25,67 1400 β-bourbonene - 0,17 - - 11 25,77 1403 Cis-β-elemene - - - 0,20 12 26,54 1426, 1427 α-gurjunene 8,95 21,31 21,97 - 13 26,87 1437, 1438 (E)-caryophyllene β - caryophyllene 1,045 6,32 5,09 5,07 14 27,08 1445 β-gurjunene 1,55 0,94 0,76 0,82 59 15 27,13 1446 α-trans-bergamotene - 0,94 0,76 - 16 27,46 1457 Aromadendrene 0,55 0,61 0,53 3,70 17 27,59 1461 (Z)-β-farnesene - - - 0,46 18 27,77 1467 unknown (159, 202, RI 1467) - - - 26,82 19 27,84 1469 unknown (159, 202, RI 1469) - - - 2,65 20 27,93 1471, 1472 α-humulene 0,78 0,47 0,36 2,60 21 28,16 1479 1483 9-epi-(E)-caryophyllene - 0,39 0,30 3,88 22 28,43 1488 Trans-cadina1(6),4-diene 0,15 0,62 0,55 1,38 23 28,55 1491 δ-muurolene 8,92 5,66 3,84 3,76 24 28,65 1494 α-amorphene 0,82 0,53 0,34 0,52 60 25 28,77 1498 Germacrene D 0,51 0,25 - 1,08 26 28,86 1501 unknown (161, 204, RI 1501) - - - 1,14 27 28,98 1505 β-selinene 5,59 4,23 3,90 3,33 28 29,11 1509, 1510 δ-amorphene 1,36 1,25 0,76 0,84 29 29,23 1513, 1514 α-selinene 7,06 5,71 5,13 5,66 30 29,35 1518 β-bisabolene 0,48 0,56 0,30 - 31 29,46 1521 γ-amorphene - - - 0,58 32 29,74 1530, 1531 γ-cadinene 3,15 2,17 2,36 1,58 33 29,96 1537, 1538 δ-cadinene 10,28 7,70 7,78 5,44 34 30,00 1539 Cis-calamenene 1,23 0,82 0,46 - 61 35 30,05 1541 Zonarene - 0,21 - - 36 30,27 1548, 1549 Trans-cadina-1,4-diene 0,56 0,46 0,49 0,41 37 30,41 1553 α-cadinene 0,61 0,46 0,42 0,71 38 30,63 1560, 1561 α-calacorene 0,19 0,80 0,70 0,55 39 31,12 1577 Germacrene B - - - 0,22 40 31,23 1580 β-calacorene - - 0,22 - 41 31,51 1589, 1590 Ledol 0,7 1,30 2,54 - 42 31,76 1598 Spathulenol 0,44 0,43 0,77 - 62 43 31,84 1601 Axenol (Gleenol) 0,33 0,21 0,47 0,20 44 31,95 1605 Caryophyllene oxide 1,56 1,25 2,00 0,65 45 32,16 1612 Guaiol (Champacol) - - - 0,87 46 32,55 1626 unknown (109, 222, RI 1626) - 1,55 2,44 - 47 32,80 1634 1635 1,10-di-epi-cubenol 0,83 0,65 1,08 1,14 48 33,15 1647 1-epi-cubenol 2,09 2,51 3,60 0,78 49 33,24 1650 Valerianol - - - 0,55 50 33,30 1652 1653 γ-eudesmol - - - 1,10 63 51 33,51 1660 epi-α-Cadinol (T-cadinol) 1,50 1,40 1,66 0,90 52 33,56 1661, 1662 epi-α- muurolol (T-muurolol) 1,62 1,42 1,77 0,90 53 33,65 1664, 1665 α-muurolol (δ-cadinol) 0,83 0,75 0,91 0,41 54 33,87 1672 1873 β-eudesmol - 2,53 2,71 1,31 55 33,93 1674, 1675 α-cadinol 3,03 4,17 5,13 2,10 56 33,95 1676 α-eudesmol - - - 1,38 57 34,03 1678 Neo-intermedeol - 1,98 2,53 1,31 58 34,40 1691 Caryophyllene - 0,43 - - 64 59 34,50 1695 Cadalene 0,49 0,50 0,63 - 60 35,17 1719 Eudesm-7(11)-en-4α-ol - - - 0,23 61 37,35 1801 Guaiazulene - - - 1,19 62 45,10 2120 Phytol - 0,55 - - Monoterpene - 0,24 - - Monoterpene có oxi - 0,31 - - Sesquiterpene - 69,84 62,98 - Dẫn xuất sesquiterpenecó oxi - 16,50 22,46 - Dẫn xuất benzen - 0,13 - - Dẫn xuất diterpene - 0,55 - - Chưa biết - 5,6 7,13 - Tổng 93,17 92,57 92,86 Kết quả bảng 4.1 cho thấy thành phần trong tinh dầu của lá khô và lá tươi có nhiều cấu tử giống nhau. Cả hai đều có 38 cấu tử tương tự và đều chứa các cấu tử có hàm lượng lớn như α-gurjunene, δ-cadinene, (E)- caryophyllene, α–selinene, γ- muurolene, α-copaene, β-selinene, α-cadinol, 1-epi-cubenol, γ-cadinene, neo- intermedeol. Ngoài ra, hầu hết các cấu tử của tinh dầu lá khô được phát hiện đều có trong tinh dầu lá tươi, ngoại trừ β–calacorene. Trong đó, có 17 cấu tử thuộc nhóm 65 sesquiterpene và dẫn xuất chứa oxi của chúng có hàm lượng trong mẫu tươi nhỏ hơn trong mẫu khô như α-gurjunene (21,31% : 21,97%), γ-cadinene (2,17%:2,36%), δ- cadinene (2,70% : 7,78%), trans-cadina-1,4-diene (0,46% : 0,49%), ledol (1,30% : 2,54%), spathulenol (0,43% : 0,77%), axenol (0,21% : 0,47%), caryophyllene oxide (1,25% : 2,00%), 1-epi-cubenol (2,51% : 3,60%), 1,10-di-epi-cubenol (0,65% : 1,08%), epi-α- cadinol (1,40% : 1,66%), epi-α- muurolol (1,42% : 1,77%), δ-cadinol (0,75% : 0,91%), β-eudesmol (2,53% : 2,71%), α-cadinol (4,17% : 5,13%), neo- intermedeol (1,98% : 2,53%), cadalene (0,50% : 0,63%); 21 cấu tử phần lớn thuộc nhóm monoterpene và dẫn xuất chứa oxi của chúng có hàm lượng trong mẫu tươi lớn hơn trong mẫu khô. Sự chênh lệch về hàm lượng của các cấu tử trong mẫu tươi và mẫu khô không đáng kể (hầu hết nhỏ hơn 1%). Tổng cộng có 9 cấu tử gồm dẫn xuất diterpene, monoterpen hydrocarbon và oximonoterpen: β-pinene linalool, methyl salicylate, δ–elenmene, β-bourbonene, germacrene D, δ–zonarene, caryophyllene và phytol được phát hiện trong lá tươi nhưng không được tìm thấy trong lá khô. Sự khác biệt này có thể là do bay hơi các hợp chất nhỏ (thấp hơn 1%) trong quá trình làm khô lá. Phổ GC-MS cho biết píck có cường độ cao nhất của tinh dầu lá tươi ở thời gian lưu 26,54 phút, tinh dầu lá khô là 26,49 phút, điều này cho thấy thành phần tương ứng với các đỉnh này là cấu tử chính trong các loại tinh dầu. So sánh thời gian lưu với cơ sở dữ liệu khối phổ và so sánh với dữ liệu thư viện phổ chuẩn đã xác định được cấu tử chính của tinh dầu C. candicans là α–gurjunrene. Như vậy, cấu tử chính của C.candicans được phát hiện hoàn toàn khác biệt so với cấu tử chính trong tinh dầu các loài khác thuộc chi Callicarpa. Cụ thể, theo nghiên cứu của tác giả Mario và cs cấu tử chính của tinh dầu C. americana là humulene epoxide II, α–humulene, β-pinene là [90]. Các cấu tử chính của tinh dầu từ lá C. japonica là spathulenol, germacrene B [91]. Cả C. candicans và C. macrophylla cấu tử chính là α-selinene và β-selinene. Cấu tử tinh dầu của lá C. candicans có khoảng 20 cấu tử giống loài C. americana. 12 cấu tử giống C. japonica, 11 cấu tử như C. macrophylla và 8 cấu tử giống C. nudiflora. Có một số yếu tố có thể dẫn đến sự khác biệt trong các hợp chất giữa các loài tinh dầu là do cách thu hái, cách lấy mẫu, môi trường sống xung quanh và một phần cấu tạo của cây. Cấu tử chính của tinh dầu Nàng nàng khi được chiết bằng phương pháp chưng 66 cất lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ vi sóng là β-caryophyllene (10,45%), δ- cadinene (10,28%), α-gurjunene (8,95%), γ-muurolene (8,92%), α-selinene (7,06%), β- selinene (5,59%) và α- copaene (5,40%). Các cấu tử thu được khi chiết bằng phương pháp có hỗ trợ vi sóng so với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước thông thường gần như giống nhau, chúng rất giàu sesquiterpene, tuy nhiên hàm lượng các cấu tử chính thu được có sự khác nhau giứa 2 phương pháp. Chẳng hạn, khi chưng cất thông thường, cấu tử chính thu được là α- gurjunene (21,31%), trong khi đó theo phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng cấu tử chính thu được là (E)- caryophyllene (10,45%). Phương pháp chưng cất có hỗ trợ vi sóng thu được các chất kém phân cực với hàm lượng ít hơn còn các cấu tử phân cực lại chiếm hàm lượng cao hơn phương pháp chưng cất thông thường bởi vì phương pháp vi sóng ưu tiên tác dụng lên những cấu tử phân cực, giúp những cấu tử này tăng nhiệt độ rất nhanh, thoát ra tế bào và bị lôi cuốn theo hơi nước dễ hơn [92]. Ngoài ra, khi chưng cất lôi cuốn hơi nước có hỗ trợ vi sóng thu được thêm một số cấu tử mà khi chưng cất bằng phương pháp thường không thu được như: cis-muurola-3,5-diene, cis-muurola- 4(14),5-diene, δ-amorphene, β-calacorene, α-corocalen, γ-eudesmol và α- eudesmol. Các cấu tử này đều là sesquiterpene hoặc dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene, chúng thường có giá trị lớn trong việc tạo thành mùi thơm đặc trưng của tinh dầu [93]. Kết quả cho thấy các thành phần tinh dầu của hoa tươi và lá tươi có nhiều cấu tử giống nhau. Cả hai đều có 31 cấu tử tương tự và đều chứa các cấu tử có hàm lượng lớn như α-copaene, (E)-caryophyllene, α-selinene, δ-muurolene, β-selinene, α- cadinol, γ-cadinene, δ-cadinene, neo-intermedeol. Trong đó, phần lớn các cấu tử có hàm lượng phần trăm gần bằng nhau (chênh lệch hàm lượng nhỏ hơn 1%) trừ các cấu tử như α- copaene, aromadendrene, α-humulene, 9-epi-E-caryophyllene, δ-muurolene, δ- cadinene, 1-epi-cubenol, β-eudesmol và α-cadinol có hàm lượng phần trăm lá tươi: hàm lượng phần trăm hoa tươi lớn hơn 1% tương ứng là 5,39% : 2,72%; 0,61% : 3,70%; 0,47% : 2,60%; 0,39%: 3,88%; 5,66% : 3,76%; 7,70% : 5,44%; 2,51% : 0,78%; 2,53% : 1,31% và 4,17% : 2,10%. Ngoài ra, có 11 cấu tử của tinh dầu lá tươi không xuất hiện trong tinh dầu hoa tươi như methyl salicylate, β -bourbonene, α-gurjunene, trans-α- bergamotene, β-bisabolene, cis-calamenene, zonarene, ledol, spathulenol, 67 caryophyllene, phytol và 9 cấu tử của tinh dầu hoa tươi không được phát hiện trong tinh dầu lá tươi gồm €-anethole, cis-β-elemene, β-farnesene, γ- amorhene, β- germacrene, α-valerianol, α-eudesmol, eudesm-7(11)-en-4α-ol và guaiazulene. Hình 4.1. Phổ GC-MS của tinh dầu lá tươi Nàng nàng 68 Hình 4.2. Phổ GC-MS của tinh dầu lá khô Nàng nàng Hình 4.3. Phổ GC-MS của tinh dầu hoa Nàng nàng 69 Hình 4.4. Phổ GC-MS của tinh dầu lá tươi Nàng nàng có hỗ trợ vi sóng 4.1.2. Thành phần hóa học của tinh dầu lá Tử châu lá to (C. macrophylla) Phân tích cấu tử tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to phát hiện có 50 cấu tử, chiếm 90,59% tổng hàm lượng. Cấu tử chính được xác định trong tinh dầu là Phytol (11,03%), tiếp theo là các cấu tử α- Cadinol (6,53%), Linalool (4,64%), (E) - β - Damascenone (6,45%). Ngoài ra, còn 13 cấu tử chưa xác định được. Cấu tử chính của tinh dầu lá cây Tử châu lá to được xác định là phytol (11,03%). Hoàn toàn khác biệt so với cấu tử chính được phát hiện trong tinh dầu lá cây Tử châu lá to đã nghiên cứu trước đây (với thành phần hóa học chính là β-selinene với hàm lượng 57,01%) [94]. Nguyên nhân có thể dẫn đến sự khác biệt do cách thu hái, địa lý, môi trường sống của cây. Ngoài ra, các cấu tử tinh dầu khác là giống nhau với hàm lượng gần tương đương Bằng cách so sánh với các nghiên cứu khác, cho thấy rằng cấu tử tinh dầu của lá C. candicans có khoảng 25 cấu tử giống loài C. americana, khoảng 13 cấu tử giống loài C. japonica, và 10 cấu tử giống loài C. nudiflora. Thành phần tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to được thể hiện trong bảng 4.2 70 Bảng 4.2. Thành phần hóa học tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to (C. macrophylla) STT Rt RI Hợp chất Công thức Mẫu tươi 1 15,713 1102 Linalool 4,64 2 15,815 1105 Nonanal 0,22 3 15,84 1106 Hotrienol 0,22 4 18,251 1175 Borneol (=Endo-Borneol) 0,18 5 19,055 1198 α-terpineol 1,08 6 19,286 1204 Myrtenol 0,54 7 19,359 1206 Myrtenal 0,26 8 20,201 1231 Nerol 0,38 9 21,049 1255 Geraniol 0,94 10 21,328 1264 2-(E)-decenal 0,11 71 11 24,747 1366 1,2-dihydro-1,1,6-trimethyl- naphthalene 0,42 12 24,935 1371 (Z)-β-damascenone 0,26 13 25,513 1389 Α-copaene 0,37 14 25,705 1395 (E)-β-damascenone 6,45 15 26,668 1425 α-gurjunene 0,4 16 27,025 1436 (E)-caryophyllene β-caryophyllene 0,45 17 27,256 1444 β-gurjunene (Calarene) 0,23 18 27,323 1446 Trans-α-bergamotene 0,23 19 27,636 1456 Aromadendrene 0,55 72 20 28,705 1490 γ-muurolene 1,24 21 29,134 1504 β-selinene 1,09 22 29,365 1512 (E),(E)-α-farnesene 0,42 23 29,389 1513 α-muurolene 0,42 24 29,88 1529 γ-cadinene 0,45 25 30,087 1536 δ-cadinene 0,82 26 30,14 1538 cis-calamenene 1,60 27 30,771 1559 α-calacorene 0,56 28 30,867 1562 n-dodecanoic acid 0,33 73 29 31,06 1569 (E)-nerolidol 0,66 30 31,382 1580 β–calacorene 0,4 31 31,878 1596 Spathulenol 0,6 32 31,965 1599 Axenol (Gleenol) 0,45 33 32,11 1604 Viridiflorol 1,71 34 32,187 1607 β-copaen-4-α-ol 0,92 35 32,37 1613 Cubeban-11-ol 2,28 36 32,596 1621 Humulene epoxide I 1,96 37 32,808 1629 Unknown (91, 220, RI 1629) 1,09 38 33,183 1642 unknown (149, 222, RI 1642) 1,14 39 33,275 1645 unknown (159, 220, RI 1645) 2,82 74 40 33,597 1657 unknown (91, 218, RI 1657) 1,80 41 33,684 1660 epi-α-muurolol (T- muurolol) 2,10 42 33,78 1663 α-muurolol 1,29 43 33,939 1669 unknown (161, 220, RI 1669) 2,64 44 34,074 1674 α-cadinol 6,53 45 34,161 1677 neo-termedeol 1,03 46 34,334 1683 unknown (175, 218, RI 1683) 1,05 47 34,426 1686 Foeniculin 0,43 48 34,614 1693 Cadalene 0,64 49 34,984 1706 unknown (109, 220, RI 1706) 2,41 50 35,259 1716 unknown (82, 218, RI 1716) 1,37 51 35,548 1727 (E)-farnesol 0,45 75 52 36,472 1762 n-tetradecanoic acid 1,07 53 38,543 1841 unknown (175, 234, RI 1841) 5,84 54 38,702 1847 unknown (43, 268, RI 1847) 1,13 55 40,06 1900 unknown (79, 248, RI 1900) 2,63 56 41,263 1950 Isophytol 0,20 57 41,668 1966 Palmitic acid 4,13 58 43,56 2046 epi-13-manoyl oxide 0,16 59 44,451 2084 unknown (95, 260, RI 2084) 1,05 60 45,27 2120 Phytol 11,03 61 45,877 2147 unknown (79, 280, RI 2147) 2,12 62 46,806 2189 Incensole 0,36 63 47,393 2216 Incensol acetate 0,24 Tổng 90,59 76 Hình 4.5. Phổ GC-MS của tinh dầu lá tươi cây Tử châu lá to 4.2. Các hợp chất phân lập được từ lá cây Tử châu lá to và Nàng nàng Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Tử châu lá to 10 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 7 hợp chất terpenoid: callimacrophylla B (M8), 3β-hydroxyolean-12-ene (M2), β-amyrin (M3), ursolic acid (M6), oleanolic acid (M10), callimacrophylla A (M1) và ent-1β-acetoxy- 7β,14α-dihydroxy-16-kauren-15-on (M7) và 3 hợp chất steroid: spinasterol (M5), β- sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, callimacrophylla A (M1) và callimacrophylla B (M8) là hợp chất mới. Từ cặn dịch chiết n-hexane và ethyl acetate lá cây Nàng nàng (Callicara candicans) 11 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 4 hợp chất flavonoid:5- hydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (C1), 5-hydroxy-3’,4’,7-trimethoxyflavon (C3), Hợp chất genkwanin (C9) và cynaroside (C10); 4 hợp chất terpenoid: 2α-hydroxy-ursolic acid (C7), 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (C8), seco-hinokiol (C5) và methyl seco-hinokiol (C6) và 2 hợp chất steroid: β-sitosterol (M4) và daucosterol (M9). Trong đó, hợp chất methyl seco-hinokiol lần đầu phân lâp được từ tự nhiên. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết. 77 4.2.1. Các hợp chất diterpenoid 4.2.1.1. Hợp chất callimacrophylla A (M1) – Hợp chất mới Hợp chất M1 thu được dưới dạng tinh thể trắng. Công thức phân tử của hợp chất M1 được xác định là C20H28O5 dựa trên sự xuất hiện của các píck ion giả phân tử trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS tại m/z 387.1940 [M + 35Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O535Cl: m/z 387,1938) và m/z 389,1918 [M + 37Cl] (tính toán lý thuyết cho C20H32O537Cl: 389,1909). Phổ 1H-NMR của hợp chất M1 cho thấy sự xuất hiện hai tín hiệu dưới dạng singlet của 2 nhóm methyl [H 0,65 (3H, s, H3-19) và 1,02 (3H, s, H3-20)], 1 nhóm oxymethine [H 3,62 (1H, dd, J = 10,5; 5,5 Hz, H-7)], tín hiệu của 2 nhóm oxymethylen [H 2,85 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Ha-18); 3,18 (1H, dd, J = 10,5; 5,0 Hz, Hb-18) và H 3,45 (1H, dd, J = 12,0; 6,5 Hz, Ha-17); 3,54 ((1H, dd, J = 12,0; 4,5 Hz, Hb-17)] và tín hiệu của các proton khác nằm trong khoảng từ H 0,93 đến 2,38 ppm. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của hợp chất M1 còn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm hydroxyl [H 4,30 (1H, d, J = 5,0 Hz, 7-OH); 4,78 (1H, s, 16-OH); 4,43 (1H, dd, J = 4,5; 6,5 Hz, 17-OH)] và H 4,49 (1H, dd, J = 5,0; 10,0 Hz, 18-OH) (Bảng 4.3). Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất M1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm keton tại C 219,3 (C-15), 1 nhóm oxymethine tại C 69,5 (C-7), 2 nhóm oxymethylene [C 61,4 (C-17) và 69,9 (C-18)], 2 nhóm methyl tại C 17,4 (C-19) và C 17,7 (C-20), 4 tín hiệu carbon bậc 4 [C 36,9 (C-4), 38,6 (C-1), 58,4 (C-8) và 78,4 (C-16)], 6 nhóm methylene [C 38,6 (C-1), 17,3 (C-2), 34,7 (C-3), 26,9 (C-6), 17,9 (C-11), 28,0 (C-12) và 25,3 (C-14)] và 3 nhóm methine [C 44,9 (C-5), 52,6 (C-9) và 38,7 (C-13)]. Các dữ liệu trên cho thấy hợp chất M1 là một hợp chất ent- kaurane diterpen và có cấu trúc tương tự hợp chất ent-7α,16β,17-trihydroxy-18- acetoxykaur-15-one ngoại trừ nhóm acetoxy tại C-18 của hợp chất ent-7α,16β,17- trihydroxy-18-acetoxykaur-15-one được thay thế bằng nhóm hydroxyl [H 4,49 (1H, dd, J = 5,0; 10,0 Hz, 18-OH)] của hợp chất M1 [101]. Phổ HSQC cho thấy các proton tại H 0,65 (H3-19); H 1,02 (H3-20) và H 3,62 (H-7) liên kết với các nguyên tử carbon tương ứng C 17,4 (C-19); C 17,7 (C-20) và C 69,5 (C-7) cũng như các proton tại H 2,85/3,18 (H-18) và H 3,45/3,54 (H-17) có 78 tương tác với các nguyên tử carbon tương ứng tại C 69,9 (C-18) và 64,1 (C-17). Ngoài ra, bốn tín hiệu proton tại H 4,30 (7-OH); 4,43 (17-OH); 4,49 (18-OH) và H 4,78 (16- OH) không liên kết với bất kỳ nguyên tử carbon nào trên phổ HSQC chứng tỏ rằng hợp chất M1 có 4 nhóm hydroxyl (Hình 4.6 và bảng 4.3). Phổ HMBC của hợp chất M1 xuất hiện các tương tác xa dị hạt nhân của các proton tại H 0,65 (H3-19) và 2,85/3,18 (H-18) với các nguyên tử carbon tại C 34,7 (C-3), 36,9 (C-4) và C 44,9 (C-5); proton tại H 1,02 (H-20) với C 38,6 (C-1), C 44,9 (C-5), C 52,6 (C-9) và C 38,5 (C-10). Hơn nữa, các liên kết từ proton tại H 3,45/3,54 (H-17) đến các nguyên tử carbon tại