Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài vitex limonifolia wall. ex c.b.clark và vitex trifolia l

giếng (với mật độ 2 x 104 tế bào/giếng) và nuôi cấy ở điều kiện nêu trên trong 24 giờ. Ngày tiếp theo, loại bỏ toàn bộ môi trường trong giếng, rửa sạch bằng PBS (photphat buffer saline), sau đó thêm vào 0,09 mL dung dịch pha loãng chứa virus đảm bảo liều lượng TCID50 (liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) và 0,01 mL hợp chất thử nghiệm hoạt tính, ủ ở điều kiện 37°C, 5% CO2 trong 2 ngày (mẫu thử). Hoạt tính kháng virus của mỗi hợp chất được theo dõi ở các nồng độ khác nhau 10 lần từ 0,1, 1,0, 10,0 và 100 μM. Bốn giếng chứa các tế bào nhiễm virus nhưng không được bơm chất thử nghiệm hoạt tính (mẫu trắng), bốn giếng được bơm các tế bào không cấy virus để đối chứng (mẫu đối chứng âm). Sau khi rửa một lần với PBS, thêm vào mỗi giếng 100 ml acetone 70% lạnh (- 20°C) và ủ trong 30 phút ở -20°C. Sau đó, aceton được loại bỏ và tiến hành sấy 96 giếng ở 60°C trong 30 phút. Tiếp tục hút 100 μL SRB 0,4% trong axit acetic 1% thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ trong phòng trong 30 phút tiếp theo. Rửa sạch các đĩa 5 lần bằng axit acetic 1%, rồi sấy khô. Sau khi sấy trong 1 ngày, SRB còn lại trong mỗi giếng được hòa tan bởi 100 μL dung dịch đệm Tris-base (10 mM), và để ở nhiệt độ trong phòng 30 phút. Độ hấp thụ trong mỗi giếng được đo bằng VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) ở bước sóng 540 nm. Hoạt tính kháng virus của mỗi hợp chất thử trong tế bào bị nhiễm CVB3, EV71 hoặc HRV1B được tính theo tỷ lệ phần trăm so với mẫu đối chứng. Hoạt tính kháng virus được đánh giá bằng phần trăm tế bào sống sót: %sống sót = ODmẫu thử − ODmẫu trắng ODmẫu đối chứng âm − ODmẫu trắng × 100 Phân tích số liệu, xây dựng đồ thị và tính toán giá trị IC50 (theo phương pháp hồi qui Sigmoidal dose-response) được thực hiện trên phần mềm GraphPad Prism 6.0. 2.3. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia Lá V. limonifolia sau khi phơi khô, nghiền thành bột mịn (4,2 kg), được làm ẩm sau đó chiết với methanol (3 lần x 10L) bằng thiết bị siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1 47 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 350 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa tan vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với CH2Cl2 và EtOAc thu được cặn CH2Cl2 (VIL1, 130,0 g), cặn EtOAc (VIL2, 27,0 g) và lớp nước (VIL3) sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Phân đoạn VIL1 được phân bố đều trong dichloromethane, tẩm với silica gel, quay khô loại bỏ dung môi, nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane:acetone (100:0 → 0:1, v/v) thu được sáu phân đoạn chính, VIL1A-VIL1F. Phân đoạn VL1B được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (5:1, v/v) thu được bốn phân đoạn, VIL1B1-VIL1B4. VIL1B1được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải n- hexane:EtOAc (1,5:1, v/v) thu được hợp chất VL7 (6,0 mg). Hợp chất VL4 (4,4 mg) và VL6 (12,5 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIL1B3 bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,5:1, v/v). Phân đoạn VIL1C được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (5:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL1C1-VIL1C3. VIL1C1 tiếp tục được đưa lên đưa lên cột sắc ký LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1, v/v) thu được hợp chất VL5 (2,5 mg). VIL1C2 được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (17:1, v/v) thu được hợp chất VL3 (14,0 mg). Hợp chất VL8 (10,3 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIL1C3 bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,4:1, v/v). Phân đoạn VIL1D được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (4:1, v/v) thu được năm phân đoạn, VIL1D1-VIL1D5. VIL1D2 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (1,8:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL1D2A-VIL1D2C. Hợp chất VL9 (18,0 mg) và VL10 (4,5 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIL1D2A bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,4:1, v/v). Hợp chất VL11 (7,0 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VIL1D2C bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (1,4:1, v/v). Phân đoạn VIL1D4 được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (2:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL1D4A-VIL1D4C. VIL1D4A được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:acetone (2,5:1, v/v) thu được hợp chất VL2 (8,0 mg). 48 Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. limonifolia 49 VIL1D4C được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải n- hexane:acetone (1,4:1, v/v) thu được hợp chất VL1 (10,5 mg). Phần nước VIL3 được đưa lên cột diaion HP-20 để loại đường bằng nước, sau đó được rửa giải bằng methanol trong nước với nồng độ tăng dần (25%, 50%, 75% và 100%) thu được bốn phân đoạn VIL3A-VIL3D. Phân đoạn VIL3A được tẩm với silica gel rồi đưa lên cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải dichloromethane:MeOH (100:1 → 0:1, v/v) thu được bảy phân đoạn, VIL3A1-VIL3A7. Phân đoạn VIL3A5 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký R-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (5:1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIL3A5A-VIL3A5C. Hợp chất VL12 (9,2 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VIL3A5A bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi EtOAc:MeOH:nước (3,5:1:0,15, v/v/v). 2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia Lá loài V. trifolia sau khi phơi khô, nghiền thành bột mịn (2,2 kg), được làm ẩm sau đó chiết với methanol (3 lần x 5L) bằng thiết bị siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 1 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 130 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hòa vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với CH2Cl2 và EtOAc thu được cặn CH2Cl2 (VIT1, 51,0 g), cặn EtOAc (VIT2, 27,0 g) và lớp nước (VIT3) sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Phân đoạn VIT2 được phân bố đều trong ethyl acetate, tẩm với silica gel, quay khô loại bỏ dung môi, nghiền mịn đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane:acetone (100:0 → 0:1, v/v) thu được bốn phân đoạn chính, VIT2A-VIT2D. Phân đoạn VIT2B tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (1,5:1, v/v) thu được hai phân đoạn, VIT2B1 và VIT2B2. VIT2B2 được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải n-hexane:EtOAc (1,1:1, v/v) thu được hợp chất VT15 (12,0 mg) và VT16 (10,0 mg). Hợp chất VT9 (9,0 mg) và VT10 (10,0 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn VIT2C trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1,2:1, v/v). Phân đoạn VIT2D được đưa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (10:1, v/v) thu được ba phân đoạn, VIT2D1-VIT2D3. VIT2D1 được phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được bốn phân đoạn 50 nhỏ hơn, VIT2D1A-VIT2D1D. VIT2D1A được đưa lên đưa lên cột sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1, v/v) thu được hợp chất VT1 (5,0 mg) và VT3 (9,0 mg). VIT2D1C được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:acetone:nước (1,5:1:0,05, v/v/v) thu được hợp chất VT4 (10,0 mg) và VT7 (8,0 mg). VIT2D2 được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được hai phân đoạn, VIT2D2A và VIT2D2B. Hợp chất VT8 (8,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIT2D2A bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (12:1, v/v). Hợp chất VT5 (16,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIT2D2B bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:acetone:nước (1:1:0,05, v/v/v). VIT2D3 được phân tách trên cột sắc ký RP- 18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được hợp chất VT11 (10,0 mg). Phần nước VIT3 được đưa lên cột diaion HP-20 để loại đường bằng nước, sau đó được rửa giải bằng methanol trong nước với nồng độ tăng dần (25%, 50%, 75% và 100%) thu được bốn phân đoạn VIT3A-VIT3D. VIT3B được phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, VIT3B1-VIT3B3. Hợp chất VT13 (12,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIT3B1 bằng cột sắc ký sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1, v/v). Hợp chất VT2 (8,0 mg) và VT6 (12,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIT3B2 bằng cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone:nước (1:3, v/v). Hợp chất VT12 (13,0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn VIT3B3 bằng cột sắc ký sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1, v/v). VIT3C được phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:nước (1:1,5, v/v) thu được hợp chất VT14 (15,0 mg). 51 Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. trifolia 52 2.4. Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được 2.4.1. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia 2.4.1.1. Hợp chất VL1: 7α,12α-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide A) (hợp chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25 D[ ] : –24,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 369,1830 [M+Cl]‒. Tính toán lý thuyết [C20H30O4Cl]‒: 369,1838. Công thức phân tử C20H30O4, M = 334. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.1. 2.4.1.2. Hợp chất VL2: 7α,12β,16-Trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide B) (hợp chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : –16,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 385,1772 [M+Cl]‒. Tính toán lý thuyết [C20H30O5Cl]‒: 385,1787. Công thức phân tử: C20H30O5, M = 350. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.2 2.4.1.3. Hợp chất VL3: 7α,16-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide C) (hợp chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực 25D[ ] : –24,0 (c 0,1, MeOH) HR-ESI-MS: m/z 357,2036 [M+Na]+. Tính toán lý thuyết [C20H30O4Na]+: 357,2036. Công thức phân tử: C20H30O4, M = 334. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.3. 2.4.1.4. Hợp chất VL4: 5,4′-Dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone Chất bột màu vàng. HR-ESI-MS: m/z 313,0711 [M-H]‒. Tính toán lý thuyết [C17H13O6]‒: 313,0718. 53 Công thức phân tử: C17H14O6, M = 314. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.4. 2.4.1.5. Hợp chất VL5: Vitecetin Chất bột màu vàng. HR-ESI-MS: m/z 359,0752 [M-H]‒. Tính toán lý thuyết [C18H15O8]‒ : 359,0772. Công thức phân tử: C18H16O8, M = 360. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.5. 2.4.1.6. Hợp chất VL6: 5,4′-Dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone Chất bột màu vàng. HR-ESI-MS: m/z 313,0712 [M-H]‒. Tính toán lý thuyết [C17H13O6]‒ : 313,0718. Công thức phân tử: C17H14O6, M = 314. 1H-NMR (DMSO-d6): H 6,93 (s, H-2), 6,35 (s, H-6), 6,76 (s, H-8), 7,57 (s, H-2′), 6,94 (d, J = 7,5 Hz, H-5′), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, H-6′), 3,90 (s, 7-OMe), 3,86 (s, 3′- OMe). 13C-NMR (DMSO-d6): C 161,1 (C-2), 103,3 (C-3), 181,9 (C-4), 164,0 (C-5), 97,9 (C-6), 165,1 (C-7), 92,7 (C-8), 157,2 (C-9),104,7 (C-10), 121,4 (C-1′), 110,2 (C-2′), 148,0 (C-3′), 150,9 (C-4′), 115,8 (C-5′), 120,5 (C-6′), 56,0 (7-OMe), 56,0 (3′-OMe). 2.4.1.7. Hợp chất VL7: Verrucosin Dạng dầu, không màu. Độ quay cực 25D[ ] : +12,0 (c 0,1, CHCl3). HR-ESI-MS: m/z 343,1544 [M-H]‒. Tính toán lý thuyết [C20H23O5]‒: 343,1551. Công thức phân tử: C20H24O5, M = 344. 1H-NMR (CDCl3): H 5,11 (d, J = 8,5 Hz, H-2), 2,24 (m, H-3), 1,77 (m, H-4), 4,39 (d, J = 9,5 Hz, H-5), 7,04 (d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,92 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,99 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,85 (d, J = 1,5 Hz, H-2′′), 6,88 (d, J = 8,0 Hz, H-5′′), 6,82 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′′), 3,86 (s, 3′-OMe), 3,91 (s, 3′′-OMe), 1,05 (d, J = 7,0 Hz, 3- Me), 0,66 (d, J = 7,0 Hz, 4-Me). 54 13C-NMR (CDCl3): C 87,4 (C-2), 47,8 (C-3), 46,0 (C-4), 83,2 (C-5), 133,2 (C-1′), 109,4 (C-2′), 146,5 (C-3′), 145,2 (C-4′), 114,2 (C-5′), 119,3 (C-6′), 132,8 (C-1′′), 109,8 (C-2′′), 146,2 (C-3′′), 144,6 (C-4′′), 113,9 (C-5′′), 119,9 (C-6′′), 55,9 (3′-OMe), 55,9 (3′′-OMe), 15,0 (3-Me), 15,0 (4-Me). 2.4.1.8. Hợp chất VL8: 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +30,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C30H48O4, M= 472. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.6. 2.4.1.9. Hợp chất VL9: Euscaphic acid Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +20,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C30H48O5, M = 488. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.7. 2.4.1.10. Hợp chất VL10: 2α,3α-Dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien- 28-oic acid Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : –40,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C30H46O5, M = 486. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.8. 2.4.1.11. Hợp chất VL11: Maslinic acid Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : –64,1 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C30H48O4, M = 472. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.9. 2.4.1.12. Hợp chất VL12: Maltol O-β-D-glucopyranoside Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : –15,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C12H16O8, M = 288. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.10. 55 2.4.2. Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia 2.4.2.1. Hợp chất VT1: 3α-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (hợp chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +50,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 455,3540 [M-H]‒. Tính toán lý thuyết [C30H47O3]‒: 455,3531. Công thức phân tử: C30H48O3, M = 456. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 3.11. 2.4.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : –18,0 (c 0,1, MeOH). CD (c=1,0×10‒3, MeOH): [θ]25 (rel, nm) ‒1,00 (226), ‒0,21 (275) HR-ESI-MS: m/z 521,2009 [M+H]+. Tính toán lý thuyết [C26H33O11]+: 521,2017. Công thức phân tử: C26H32O11, M = 520 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.12. 2.4.2.3. Hợp chất VT3: Ecdysone Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +70,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C27H44O6, M = 464. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.13. 2.4.2.4. Hợp chất VT4: 20-Hydroxyecdysone Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +52,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C27H44O7, M = 480. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.14. 2.4.2.5. Hợp chất VT5: 20-Hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +50,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C30H48O7, M = 520. 56 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.15. 2.4.2.6. Hợp chất VT6: Turkesterone Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +85,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 495,2950 [M-H]‒. Tính toán lý thuyết [C27H43O8]‒: 495,2963. Công thức phân tử: C27H44O8, M = 496. 1H-NMR (CD3OD): H 4,03 (ddd, J = 3,0, 4,0, 12,0 Hz, H-2), 3,98 (br d, J = 2,0 Hz, H-3), 2,36 (dd, J = 4,0, 13,0 Hz, H-5), 5,82 (d, J = 2,5 Hz, H-7), 3,17 (dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-9), 4,13 (m, H-11), 0,90 (s, H-18), 1,08 (s, H-19), 1,23 (s, H-21), 3,37 (m, H- 22), 1,22 (s, H-24), 1,22 (s, H-27). 13C-NMR (CD3OD): C 39,1 (C-1), 68,9 (C-2), 68,6 (C-3), 33,3 (C-4), 52,8 (C-5), 206,7 (C-6), 122,7 (C-7), 165,7 (C-8), 42,9 (C-9), 39,9 (C-10), 69,5 (C-11), 43,8 (C- 12), 49,0 (C-13), 84,9 (C-14), 31,9 (C-15), 21,5 (C-16), 50,3 (C-17), 18,9 (C-18), 24,6 (C-19), 77,8 (C-20), 21,0 (C-21), 78,4 (C-22), 27,3 (C-23), 42,4 (C-24), 71,3 (C- 25), 29,0 (C-26), 29,7 (C-27). 2.4.2.7. Hợp chất VT7: Polypodine B Chất bột vô định hình, màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +94,2 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C27H44O8, M = 496. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.16. 2.4.2.8. Hợp chất VT8: Rubrosterone Chất bột màu trắng. Độ quay cực 25D[ ] : +120,0 (c 0,1, MeOH) Công thức phân tử: C19H26O5, M = 334. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.17. 2.4.2.9. Hợp chất VT9: Luteolin Chất bột màu vàng. Công thức phân tử: C15H10O6, M = 286. 1H-NMR (CD3OD): H 6,55 (s, H-3), 6,22 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,39* (H-2), 6,92 (d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,39* (H-6). (*Tín hiệu chập). 57 13C-NMR (CD3OD): C 166,0 (C-2), 103,9 (C-3), 183,9 (C-4), 163,2 (C-5), 100,1 (C-6), 166,4 (C-7), 95,0 (C-8), 159,4 (C-9), 105,3 (C-10), 123,7 (C-1), 114,2 (C-2), 147,0 (C-3), 151,0 (C-4), 116,8 (C-5), 120,3 (C-6). 2.4.2.10. Hợp chất VT10: (2S)-7,4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25D[ ] : -20,5 (c 0,1, MeOH) Công thức phân tử: C16H14O5, M = 286. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.18. 2.4.2.11. Hợp chất VT11: Vitexin Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25D[ ] : +9,1 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C21H20O10, M = 432. 1H-NMR (DMSO-d6): H 6,77 (s, H-3), 6,28 (s, H-6), 8,02 (d, J = 8,5 Hz, H-2′), 6,89 (d, J = 8,5 Hz, H-3′), 4,69 (d, J = 10 Hz, H-1′′). 13C-NMR (DMSO-d6): C 164,0 (C-2), 102,5 (C-3), 182,1 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1 (C-6), 162,5 (C-7), 104,6 (C-8), 156,0 (C-9), 104,1 (C-10), 121,6 (C-1′), 129,0 (C- 2′), 115,8 (C-3′), 161,1 (C-4′), 115,8 (C-5′), 129,0 (C-6′), 73,4 (C-1), 70,9 (C-2), 78,7 (C-3), 70,6 (C-4), 81,8 (C-5), 61,3 (C-6). 2.4.2.12. Hợp chất VT12: Orientin Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25D[ ] : +20,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C21H20O11, M = 448. 1H-NMR (CD3OD): H 6,63 (s, H-3), 6,26 (s, H-6), 7,48 (s, H-2′), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,53 (d, J = 8,0 Hz, H-6′), 4,68 (d, J = 10 Hz, H-1′′). 13C-NMR (CD3OD): C 164,1 (C-2), 102,3 (C-3), 182,0 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1 (C- 6), 162,7 (C-7), 104,5 (C-8), 156,0 (C-9), 104,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 114,0 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,7 (C-4′), 115,6 (C-5′), 119,3 (C-6′), 73,4 (C-1), 70,8 (C-2), 78,7 (C-3), 70,7 (C-4), 82,0 (C-5), 61,6 (C-6). 2.4.2.13. Hợp chất VT13: Homoorientin Chất bột màu vàng. 58 Độ quay cực 25D[ ] : +28,5 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C21H20O11, M = 448. 1H-NMR (DMSO-d6): H 6,67 (s, H-3), 6,48 (s, H-8), 7,41 (d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,89 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,41 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, H-6′), 4,59 (d, J = 10,0 Hz, H-1′′). 13C-NMR (DMSO-d6): C 163,3 (C-2), 102,8 (C-3), 181,9 (C-4), 160,7 (C-5), 108,9 (C-6), 163,7 (C-7), 93,5 (C-8), 156,2 (C-9), 103,4 (C-10), 121,4 (C-1′), 113,3 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,7 (C-4′), 116,1 (C-5′), 119,0 (C-6′), 73,1 (C-1), 70,6 (C-2), 79,0 (C-3), 70,2 (C-4), 81,6 (C-5), 61,5 (C-6). 2.4.2.14. Hợp chất VT14: 2-O-Rhamnosylvitexin Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25D[ ] : +30,0 (c 0,1, MeOH). Công thức phân tử: C27H30O14, M = 578. 1H-NMR (CD3OD): H 6,62 (s, H-3), 6,26 (s, H-6), 8,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H- 6′), 6,97 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′/H-5′), 5,06 (d, J = 10,0 Hz, H-1′′), 5,11* (H-1′′′). 13C-NMR (CD3OD): C 166,7 (C-2), 103,6 (C-3), 184,1 (C-4), 162,7 (C-5), 100,1 (C- 6), 164,9 (C-7), 105,8 (C-8), 158,0 (C-9), 105,8 (C-10), 123,6 (C-1′), 130,1 (C-2′), 117,0 (C-3′), 162,8 (C-4′), 117,0 (C-5′), 130,1 (C-6′), 73,8 (C-1), 78,2 (C-2), 81,6 (C-3), 72,3 (C-4), 82,9 (C-5), 63,1 (C-6), 102,5 (C-1), 72,5 (C-2), 72,0 (C- 3), 73,6 (C-4), 70,0 (C-5), 18,0 (C-6).(*Tín hiệu chập). 2.4.2.15. Hợp chất VT15: Euscaphic acid Xem VL9 2.4.2.16. Hợp chất VT16: Tormentic acid Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực 25D[ ] :+29,0 (c 0,1, MeOH) Công thức phân tử: C30H48O5, M = 488. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.19. 59 2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 2.5.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia Các hợp chất VL1- VL12 được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự sản sinh NO được sinh ra bởi tế bào BV2, kích thích bởi LPS. Đầu tiên, các hợp chất được kiểm tra độ độc của chúng đối với tế bào ở nồng độ 20 µM. Những hợp chất không thể hiện độc tính (VL1-VL10, VL12) tiếp tục được đánh giá sàng lọc ức chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở 50 µM. Những chất thử nghiệm đều có khả năng ức chế mạnh sự sản sinh NO do tế bào BV2 sinh ra (% ức chế >50%) nên tiếp tục được đánh giá ở các nồng độ khác nhau: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị IC50. Chất đối chứng dương sử dụng trong thí nghiệm là L-NMMA, một loại chất ức chế sản sinh NO, với giá trị IC50 là 22,11,20 µM. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào BV2, được kích thích bởi LPS của 12 hợp chất (VL1-VL12) ở nồng độ 20 µM được thể hiện như bảng dưới đây. Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất VL1-VL12 trên tế bào BV2 Hợp chất % tế bào sống sót IC50 (µM) VL1 87,062,43 >50 VL2 120,757,80 2,500,34 VL3 147,828,55 7,130,87 VL4 87,1211,28 24,701,52 VL5 104,519,50 39,673,14 VL6 86,633,23 19,161,09 VL7 96,935,10 45,315,31 VL8 104,519,50 >50 VL9 141,198,73 44,232,48 VL10 119,536,65 15,881,17 VL11 59,045,83 - VL12 80,503,25 >50 L-NMMA 22,101,20 (-) Không đánh giá hoạt tính kháng viêm ở các nồng độ do tỉ lệ % tế bào sống sót nhỏ (< 80%) 60 2.5.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất Từ loài V. limonifolia 12 hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ loài V. limonifolia được tiến hành đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71) theo phương pháp thử nghiệm SRB. Rupuntrivir và ribavirin được sử dụng làm chất đối chứng dương. Kết quả cho thấy, 2 hợp chất flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh (Bảng 2.2). Đồng thời, các hợp chất VL4 và VL6 không thể hiện độc tính đối với tế bào (dữ liệu không được hiển thị). Bảng 2.2. Hoạt tính kháng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71 của một số hợp chất từ loài V. limonifolia. Kí hiệu CC50 (M) IC50 (M) Coxsackievirus B3 (CVB3) VL4 >50 0,21±0,06 VL6 >50 1,86±0,18 Rupuntrivir >50 0,12±0,06 Human rhinovirus 1B (HRV1B) VL4 >50 0,61±0,21 Ribavirin >50 48,07±1,46 Enterovirus 71 (EV71) VL4 >50 32,05±0,94 Rupuntrivir >50 0,11±0,05 Từ loài V. trifolia Các hợp chất VT1-VT16 được phân lập từ loài V. trifolia trước tiên được đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71. Kết quả đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng các chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71 của các hợp chất VT1-VT16 ở nồng độ 10 M được trình bày ở bảng dưới đây. 61 Bảng 2.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng một số chủng virus của các hợp chất từ loài V. trifolia Hợp chất % tế bào sống sót Coxsackievirus B3 Human rhinovirus 1B Enterovirus 71 VT1 2,38 5,41 1,30 VT2 3,52 4,23 5,97 VT3 4,99 -1,51 -4,34 VT4 13,27 0,71 3,37 VT5 1,94 -0,12 2,29 VT6 -2,31 -1,87 -5,16 VT7 4,20 -3,10 6,44 VT8 1,85 -0,68 1,42 VT9 77,14 80,20 43,35 VT10 -5,98 -1,75 -4,99 VT11 3,44 1,03 -4,94 VT12 1,89 -3,34 -1,17 VT13 6,23 -0,95 -1,87 VT14 -0,63 -0,20 1,53 VT15 -0,19 -2,30 -0,19 VT16 1,32 -1,79 -8,83 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng virus của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia cho thấy, chỉ có hợp chất VT9 thể hiện hiệu quả kháng các chủng virus virus CVB3/ HRV1B/ EV71. 62 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được Tổng số 28 hợp chất đã được phân lập và xác định được cấu trúc từ hai loài V. limonifolia và V. trifolia, trong đó có: * 12 hợp chất từ loài V. limonifolia (Hình 3.1): 3 hợp chất diterpenoid khung labdane, đều là hợp chất mới được đặt tên là vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 9 hợp chất đã biết gồm: ba hợp chất flavonoid, 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), vitecetin (VL5), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6); 1 hợp chất lignan, verrucosin (VL7); 4 hợp chất triterpenoid khung ursane và oleanane, 2α,3α- dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9), 2α,3α-dihydroxy-19- oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maslinic acid (VL11); và 1 hợp chất -pyrone glycoside, maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12). Trong đó, các hợp chất VL4, VL6, VL7, VL10 và VL12 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex. Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. limonifolia 63 * 16 hợp chất từ loài V. trifolia (Hình 3.2): Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. trifolia 64 Một hợ