Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thực vật thuộc chi kadsura và schisandra họ schisandraceae ở Việt Nam

m mục 2.2.2.1, trang 40.  2,3-dihydroxypropyl hexacosanoat (SpH3) Phân đoạn P-H5 (3,1 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexan/axeton (3:1), thu được ba phân đoạn P-H5A→P-H5C. Phân đoạn P- H5B (1,2 g) kết tinh lại bằng dung môi axeton thu được hợp chất vô định hình, không màu (SpH3; 52,8 mg), điểm nóng chảy 102-105 0C. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.4.5, trang 103.  2,3-dihydroxypropyl 28-hydroxyoctacosanoat (SpH4) Phân đoạn P-H6 (2,8g) được tinh chế qua cột sephadex với dung môi rửa giải metanol, thu được hợp chất vô định hình, không màu (SpH4; 96 mg), điểm nóng chảy 108-1090C. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.3.7, trang 98. 2.5.2.2. Cặn etyl axetat thân cây Ngũ vị vảy chồi (S. perulata) Cặn chiết etyl axetat (44g trong tổng số 68,2g - kiểm tra định tính trên bản mỏng cho thấy cặn dịch chiết diclometan và etyl axetat có thành phần giống nhau nên gộp lại) tiến hành phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi clorofom/metanol (50:1→4:1) thu được 6 phân đoạn chính P-E1→P-E6.  Axit meso-dihydroguaiaretic (SpE5) Phân đoạn P-E2 (3,6 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo, hệ dung môi rửa giải metanol/nước (3:7) thu được ba phân đoạn P-E2A→P-E2C. Kết tinh phân đoạn P-E2C (1,2g) bằng axeton thu được hợp chất dạng vô định hình, không màu (SpE5; 89,7 mg), nhiệt độ nóng chảy 87-89 0C. FT-ICR/HRMS: [M+H]+ (m/z) 331,19095 amu, ứng với công thức phân tử 1 13 C20H26O4. H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.4.1, trang 99.  Rel-(8R,8'R)-dimetyl-(7S,7'R)-bis(3,4-metylendioxiphenyl)tetrahydrofuran (SpE6) Phân đoạn P-E2B (1,3 g) được tinh chế qua cột sephadex với dung môi rửa giải metanol, thu được hợp chất dạng bột vô định hình, không màu (SpE6; 71,6 mg). 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.2.3, trang 82. 52  (7S,8R,8’R,7’R)-3,4-dimetoxi-3’,4’-metylendioxi-7,7’-epoxylignan (SpE7) Phân đoạn P-E2A (1,0 g) được tinh chế qua cột sephadex với dung môi rửa giải metanol thu được hợp chất dạng tinh thể hình kim, không màu (SpE7; 63,7 mg). FT-ICR/MS: [M+H]+ (m/z) 341,17523 amu, ứng với công thức phân tử C20H20O5. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3-CD3OD): xem mục 3.2.4, trang 83.  β-sitosteryl 3-O-β-D-glucopyranozit (SpE2) Phân đoạn P-E3 (1,8 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường, với hệ dung môi rửa giải clorofom/metanol (9:1), thu được hai phân đoạn P-E3A→P-E3B. Kết tinh lại phân đoạn P-E3B (1,2g) bằng metanol thu được hợp chất vô định hình, không màu (SpE2; 48,3 mg). 1 13 H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem mục 2.2.2.2, trang 41.  (2R,3S)-3,5,7,3’,4’-pentahydroxy-flavan (SpE8) Phân đoạn P-E4 (2,9 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi metanol/nước (3:7), thu được ba phân đoạn P-E4A→P-E4C. Kết tinh phân đoạn P-E4B (0,9 g) bằng axeton thu được hợp chất vô định hình, màu nâu đỏ (SpE8; 23 mg), nhiệt độ nóng chảy 174-175 oC. 24 Độ quay cực: D = +14,8 (c = 0,69; axeton) 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3-CD3OD): xem mục 3.4.4, trang 101. Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong hình 2.4b. P-E (44g) CM 50:1→ 4:1 50:1 9:1 9:1 4:1 4:1 4:1 P-E1 P - E2 P - E3 P - E4 P - E5 P - E6 1,8g 2,9g 2,9g 12,1g 11,5g 3,6g RP-18 RP-18 CM 9:1 M/W 3:7 M/W 3:7 P-E2A P-E2B P-E2C P-E3A P-E3B P-E4A P-E4B P-E4C 1,0g 1, 3g 1,2g 0,5g 1,2g 0,6g 0,9g 1,1g Sephadex SpE7 SpE6 SpE5 SpE2 SpE8 63,7mg 71,6mg 89,7mg 48,3mg 23mg Hình 2.4b . Sơ đồ phân lập c ặn etyl axetat thân cây Ngũ vị vả y chồi (S. perulata) 53 Kết luận Như vậy, từ thân cây Ngũ vị vảy chồi thu được 8 hợp chất gồm β-sitosterol (SpH1); 2,3-dihydroxypropyl hexacosanoat (SpH3); 2,3-dihydroxypropyl 28-hydroxyoctacosanoat (SpH4); axit meso-dihydroguaiaretic (SpE5); rel-(8R,8'R)- dimetyl-(7S,7'R)-bis(3,4-metylendioxiphenyl)tetrahydrofuran (SpE6); (7S,8R,8’R,7’R)- 3,4-dimetoxi-3’,4’-metylendioxi-7,7’-epoxylignan (SpE7), β-sitosterol 3-O-β-D- glucopyranozit (SpE2) và (2R,3S)-3,5,7,3’,4’-pentahydroxy-flavan (SpE8). Các kết quả trên cho thấy các hợp chất lignan là thành phần chính của thân Ngũ vị vảy chồi, điều này phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây về các loài thuộc chi Schisandra. 2.6. Thân cành Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera) 2.6.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu thân cành S. sphenanthera (4,5 kg) được xử lý theo sơ đồ 2.5. Mẫu thân cành S. sphenanthera khô (4,5 kg) Chiết M (3 x 5L) Cặn M tổng (468,6 g) Bổ sung 2L W chiết H (3 x 3L) Lớp H Lớp W Chiết E (3 x 2L) S-H (78,3g) S-E S-N (104,3g) (234,1g) Sơ đồ 2.5. Sơ đồ ngâm chiết thân cành cây Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera) 2.6.2. Phân lập các hợp chất từ thân cành cây Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera) 2.6.2.1. Cặn n-hexan thân cành cây Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera) Cặn chiết n-hexan (40 g trong tổng số 78,3 g) tiến hành phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat (20:1→1:1) thu được 6 phân đoạn chính S-H1→S-H6.  β-sitosterol (SsH1) Phân đoạn S-H1 (4,5 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexan/etyl axetat (20:1), thu được ba phân đoạn S-H1A→S-H1C. Phân đoạn S-H1B (2,1 g) kết tinh lại bằng n-hexan thu được hợp chất tinh thể hình kim, không màu (SsH1; 1,1 g), điểm chảy 138-140 0C. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 2.2.2.1, trang 40. 54  1-linoleoylglycerol (SsH2) Phân đoạn S-H1C (1,5 g) kết tinh lại trong dung môi clorofom thu được hợp chất vô định hình, không màu (SsH2; 57 mg), điểm nóng chảy 85-86 0C. Thủy phân este hóa hợp chất SsH2: Lấy 20 mg hợp chất SsH2 thủy phân trong dung môi metanol (30 ml) với sự có mặt của dung dịch HCl 1N (2 ml), hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu 6h, Sau khi phản ứng kết thúc thêm 70 ml nước cất và chiết bằng n-hexan (3x20 ml). Dịch chiết n-hexan được làm khô bằng Na2SO4 khan và đuổi hết dung môi thu được 11 mg cặn. Sau khi chạy qua thiết bị GC có so sánh với các phổ đồ của chất chuẩn cho biết thành phần chính là metyl linoleat. Do vậy, có thể khẳng định phần axit của SsH2 chính là axit linoleic. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): Phần axit: 2,35 (2H, t, J= 7,5 Hz, H- 2’); 1,64 (2H, m, H-3’); 2,02 (6H, m, H-8’,11’,14’); 5,35 (4H, m, H-9’,10’,12’,13’); 0,88 (3H, t, J= 7 Hz, H-18’); 1,28 (br s, CH2); Phần glycerin: 4,20 (2H, m, H-1); 3,94 (1H, m, H-2), 3,69 (1H, m, H-3). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): Phần axit: 174,3 (C-1’); 35,9 (C-2’); 24,9 (C-3’); 31,6-34,2 (C-8’,11’,17’,20’,16’); 25,6-29,8 (CH2); 129,8-130,0 (C- 9’,10’,12’,13’); 14,1 (C-18’). Phần glycerin: 65,2 (C-1); 70,3 (C-2); 63,4 (C-3).  (+)-gomisin M2 (SsH3) Phân đoạn S-H2 (3,7g) được phân tách trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexan/etyl axetat(15:1), thu được ba phân đoạn S-H2A→S-H2C. Phân đoạn S-H2B (2,3g) kết tinh lại bằng axeton thu được hợp chất tinh thể hình kim, không màu (SsH3; 215,7 mg), điểm nóng chảy 158-160 0C. + FT-ICR/MS: [M+H] (m/z) 387 amu, ứng với công thức phân tử C23H29O6. -1 IR (νmax cm ): 3345,0; 2960,5 và 2867,9; 1634,0; 1205,5 và 1035,2. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.5.1, trang 105.  (±)-gomisin M1 (SsH4) Phân đoạn S-H4 (3,1g) được phân tách trên cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexan/axeton (15:1), thu được bốn phân đoạn S-H4A→S-H4D. Trong đó, phân đoạn S-H4A (1,2g) kết tinh lại bằng axeton thu được hợp chất tinh thể hình kim, không màu (SsH4; 79,7 mg), điểm nóng chảy 117-119 0C. + FT-ICR/MS: [M+H] (m/z) 387 amu, ứng với công thức phân tử C23H29O6. -1 IR (νmax cm ): 3494,5; 2960,5 và 2875,0; 1614,0 (C=C); 1238,4 và 1049,3. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.5.2, trang 106. 55  Gomisin N (SsH5) Phân đoạn S-H4C (0,9g) kết tinh lại bằng axeton thu được hợp chất tinh thể hình kim, không màu (SsH5, 61 mg), điểm nóng chảy 105-107 0C. 1 13 H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.5.3, trang 108. Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong sơ đồ 2.5a. S-H (40,0g) HE 20:1→1:1 20:1 15:1 10:1 10:1 5:1 1:1 S-H1 S - H2 S - H3 S - H4 S - H5 S - H6 4,5g 3,7g 2,7g 3,1g 3,2g 2,9g HE 20:1 HE 15:1 HA 15:1 S-H1A S-H1B S-H1C S-H2A S-H2B S-H2C S-H4A S-H4B S - H4C S-H4D 0,6g 2,1g 1,5g 0,7g 2,3g 0,4g 1,2g 0,4g 0,9g 0,3g SsH1 SsH2 SsH3 SsH4 SsH5 1,1g 57mg 215,7mg 79,7mg 61mg Sơ đồ 2.5a. Sơ đồ phân lập cặn n-hexan thân cành cây Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera ) 2.6.2.2. Cặn etyl axetat thân cành cây Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera) Cặn chiết etyl axetat (50 g trong tổng số 104,3 g) được tiến hành phân tách trên sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi clorofom/metanol (50:1→1:1) thu được năm phân đoạn chính S-E1→S-E5.  β-sitosteryl 3-O-β-D-glucopyranozit (SsE1) Phân đoạn S-E2 (5,8 g) được kết tinh lại trong metanol thu được hợp chất vô định hình, không màu (SsE1; 49 mg), nhiệt độ nóng chảy 269-270oC. 1 13 H-NMR và C-NMR (CD3OD): xem 2.2.2.2, trang 41.  Axit kadsuric (SsE2) Phân đoạn S-E3 (6,1 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi metanol/nước (3:7), thu được bốn phân đoạn S-E3A→S-E3D. Kết tinh phân đoạn S-E3B (0,9 g) bằng clorofom thu được hợp chất tinh thể hình kim, không màu 0 1 13 (SsE2; 37 mg), điểm chảy 156-158 C. H-NMR và C-NMR (CDCl3): xem mục 3.1.3, trang 66. 56 Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong sơ đồ 2.5b. S-E (50g) CM 50:1→ 1:1 50:1 9:1 5:1 3:1 1:1 S-E1 S - E2 S - E3 S - E4 S - E5 5,8g 11,5g 5,8g 6,1g 4,2g RP-18 M/W 3:7 S-E3A S - E3B S - E3C S - E3D SsE1 SsE2 48,3mg 37mg Sơ đồ 2.5b. Sơ đồ phân lập cặ n etyl axetat thân cành Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera) Kết luận Như vậy, từ thân cành cây Ngũ vị tử nam thu được 7 hợp chất: β-sitosterol (SsH1), 1-linoleoylglycerol (SsH2), (+)-gomisin M2 (SsH3), (±)-gomisin M1 (SsH4), gomisin N (SsH5), β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranozit (SsE1) và axit kadsuric (SsE2). Các kết quả trên cho thấy các hợp chất lignan là thành phần chính của thân cành Ngũ vị tử nam (S. sphenanthera), điều này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây về các loài thuộc chi Schisandra. Trong quá trình ngâm chiết phân lập các hợp chất có trong 5 loài nghiên cứu, ngoài các hợp chất đã thu được từ các dịch chiết n-hexan và etyl axetat, chúng tôi cũng tiến hành phân tích định tính các lớp chất có trong các phân đoạn dịch chiết metanol, có thể khẳng định nó có chứa thành phần chính là các hợp chất glycozit. Chúng tôi thực hiện phương pháp thủy phân axit các cặn metanol để thu các genin của các glycozit. Tuy nhiên, sau khi thực hiện quá trình thủy phân chúng tôi đã không thu được kết quả nào đáng kể. 2.7. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập Hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được phân lập từ 5 loài nghiên cứu được thử nghiệm tại Trường Đại học Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được trình bày trong mục 3.6, trang 116. 57 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các hợp chất phân lập được từ thân cành cây Na leo (K. heteroclita) Từ cặn dịch chiết n-hexan và etyl axetat thân cành cây Na leo 8 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học, gồm 3 hợp chất tritecpenoit: heteroclitalacton N (KHE1), axit secococcinic F (KHH2) và axit kadsuric (KHH3); 3 hợp chất lignan: kadsuralignan B (KHE4), axit dihydroguaiaretic (KHE2) và schizanrin F (KHE3); và 2 hợp chất steroit: β-sitosterol (KHH1) và β-sitosteryl 3-O-β-D-glucopyranozit (KHE5). Trong đó, heteroclitalacton N (KHE1) là hợp chất mới. Cấu trúc hóa học của các hợp chất này được xác định dựa vào các dữ liệu phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trước đây đối với các hợp chất đã biết. Hình 3.1. Các hợp chất phân lập được từ thân cành cây Na leo (K. heteroclita) 3.1.1. Heteroclitalacton N (KHE1) - hợp chất mới Hợp chất KHE1 được phân lập dưới dạng bột vô định hình, không màu, nhiệt độ nóng chảy 204-206 oC. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho [M+H]+ (m/z) 551,2857 1 amu, cho phép xác định công thức phân tử KHE1 là C29H43O10. Phổ H-NMR của KHE1 cho biết tín hiệu: 1 proton olefinic tại H-24 (H 7,21); 4 proton oximetin tại H-1 (H 4,34), H-15 (H 3,87), H-22 (H 3,76) và H-23 (H 5,17); 2 proton metylenoxi tại H-29 (H 3,40 và 3,44); 1 nhóm metyl bậc hai tại H-21 (H 1,12) và 3 nhóm metyl tại H-18 (H 1,12), H-27 (H 1,91) và H-30 (H 1,17). Phổ 13C-NMR và DEPT của KHE1 quan sát thấy có 29 cacbon gồm 2 nhóm cacbonyl (CO) tại C-3 (δC 177,6) và C-26 (δC 177,0), 6 cacbon bậc bốn (trong đó có 4 cacbon liên kết với oxi tại C-4 (δC 88,8), C-9 (δC 73,3), C-10 (δC 101,1) và C-14 (δC 87,6)), 9 nhóm metin (CH), 8 nhóm metylen (CH2) và 4 nhóm metyl (CH3) (bảng 3.1). 58 Những dữ liệu này gợi ý KHE1 là một nortritecpenoit khung schiartan giàu oxi có bảy vòng [154]. Các dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của KHE1 tương tự như hợp chất micrandilacton C, trừ vị trí nhóm hydroxyl ở C-29 [130,160]. Phổ HMBC của KHE1 cho biết tương tác giữa H-23 (H 5,17) với C-20 (δC 38,3), C-22 (δC 73,9), C-24 (δC 149,9), C-25 (δC 131,3), và C-26 (δC 177,0); giữa H-27 (δH 1,91) với C-24 (δC 149,9), C-25 (δC 131,3),và C-26 (δC 177,0). Phổ COSY cho biết các tương tác của H-20/H-22/H-23/H-24, điều này khẳng định nhóm α,β-lacton chưa bão hòa và hydroxyl ở vị trí C-22. Ngoài ra, H-22 định hướng α được suy ra bởi tương tác H-22 (δH 3,76) và H-17 (δH 2,10) trên phổ NOESY. Các tương tác HMBC giữa H-1 (δH 4,34) với C-2 (δC 37,2), C-3 (δC 177,6), C-10 (δC 101,1), C-4 (δC 88,8), C-5 (δC 54,9), và C-19 (δC 47,2); giữa H-29 (δH 3,40 và 3,44) với C-4 (δC 88,8) và C-5 (δC 54,9); và giữa H-30 (δH 1,17) với C-4 (δC 88,8) và C-5 (δC 54,9) khẳng định sự hiện diện của một cầu epoxy tại C-1 và C-4, và cả hai nhóm metyl và hydroxymetylen tại C-4. Các tương quan trên phổ NOESY giữa H-1 (δH 4,34) và H-30 (δH 1,17), giữa H-5 (δH 2,66) và H-29 (δH 3,40 và 3,44) khẳng định rằng H-5 và H-29 định hướng α, H-1 và H-30 định hướng β. Các tương tác NOESY chính của KHE1 Hơn nữa, tương tác trên phổ HMBC của KHE1 giữa H-15 (δH 3,87) với C-8 (δC 56,6), C-14 (δC 87,6), C-16 (δC 35,9), và C-17 (δC 54,7) khẳng định nhóm hydroxyl ở C-15. Nhóm hydroxyl này định hướng α đã được xác định bởi tương tác giữa H-8 (δH 1,70) và H-15 (δH 3,87). Phân tích các dữ liệu phổ, kết hợp so sánh với dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo cho phép xác định hợp chất KHE1 với tên heteroclitalacton N, đây là một hợp chất mới, lần đầu tiên phân lập được trong tự nhiên [160]. Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC, COSY chính của heteroclitalacton N (KHE1) 59 1 13 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của KHE1 ( H: 500 MHz, C: 125 MHz, CD3OD) TT KHE1 [160] δC δH (mult., J Hz) DEPT H → C (HMBC) #δC #δH (mult., J Hz) 1 83,0 4,34 (d; 4,5) CH 10, 3, 2, 19 82,8 4,16 (d; 4,5) 2 37,2 2,83 (dd; 4,5 và 13,0) CH2 1, 10, 3 37,2 2,73 (dd; 4,5 và 17,9) 2,53 (d; 13,0) 2,35 (d; 17,9) 3 177,6 - C 177,6 - 4 88,8 - C 86,2 - 5 54,9 2,66 (dd; 3,0;13,0) CH 29, 4, 10 60,2 2,29 (dd; 3,8 và 15,1) 6 29,4 1,46 và 1,83 (m) CH2 5, 7 29,3 1,28 và 1,74 (o) 7 25,0 2,26 (dd, 8,5; 13,0) CH2 8, 6 24,7 2,14 (m) 1,80 (m) 1,60 (m) 8 56,6 1,70 (m) CH 13, 7, 6, 9, 14 56,8 1,60 (o) 9 73,3 - C 73,3 - 10 101,1 - C 101,3 - 11 39,6 1,55 (br d, 14,0) CH2 12, 9 38,5 1,58 (m) 2,18 ( m) 1,28 (m) 12 38,6 1,41 và 1,76 (m) CH2 13, 11 39,6 1,41 (m) và 1,98 (o) 13 46,4 - C 46,3 - 14 87,6 - C 87,6 - 15 77,3 3,87 (d; 3,5) CH 13, 14, 17 77,2 3,73 (d; 3,5) 16 35,9 1,98 (dt; 4,0;13,0) CH2 15, 17 36,0 1,88 (m) 1,74 (m) 1,58 (o) 17 54,7 2,10 (m) CH 13, 20 54,7 1,94 (m) 18 18,2 1,12 (s) CH3 13 18,2 1,00 (s) 19 47,2 2,20 (d; 15,0) CH2 9, 10 47,0 2,03 (d; 15,9) 1,85 (d; 5,0) 1,75 (d; 15,9) 20 38,3 1,60 (m) CH 17, 21, 22 38,3 1,98 (m) 21 18,2 1,12 (d; 6,0) CH3 20 18,2 0,98 (d; 4,5) 22 73,9 3,76 (dd; 1,5; 6,5) CH 17, 20, 21, 23, 24 73,8 3,63 (dd; 2,0; 6,8) 23 83,6 5,17 (br s) CH 22, 24, 25 83,6 5,04 (d; 1,8) 24 149,9 7,21(br s) CH 23, 25, 26, 27 149,9 7,08 (d; 1,8) 25 131,3 - C 131,3 - 26 177,0 - C 177,0 - 27 10,6 1,91 (s) CH3 24, 25, 26 10,6 1,78 (s) 29 69,8 3,40 và 3,44 (d; 11,5) CH2 4, 5, 30 30,0 1,19 (s) 30 19,0 1,17 (s) CH3 4 23,5 1,04 (s) 1 13 #δH và #δC của micrandilacton C ( H: 400 MHz, C: 100 MHz, pyridin-d5) [160] Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của heteroclitalacton N 60 Hình 3.3. 1H- và 13C-NMR của heteroclitalacton N 61 Hình 3.4. Phổ DEPT của heteroclitalacton N 62 Hình 3.5. Phổ HSQC và HMBC của heteroclitalacton N 63 Hình 3.6. Phổ COSY và NOESY của heteroclitalacton N 64 3.1.2. Axit secococcinic F (KHH2) Hợp chất KHH2 thu được từ dịch chiết n-hexan dưới dạng bột vô định hình, không màu. Phổ 1H-, 13C-NMR, DEPT của KHH2 cho biết đây là một hợp chất tritecpen khung 3,4-seco-lanostan, là dạng khung phổ biến của các loài thuộc chi Kadsura. Trên phổ NMR của KHH2 có sự hiện diện của 3,4-seco ở vòng A được thể hiện qua các tín hiệu đặc trưng cacbon: nhóm COOH tại C-3 (δC 180,7), 1 nối đôi dạng >C=CH2 tại H-28 (δH 4,87 và 4,98), ứng với C-28 (δC 112,0), C-4 (δC 149,7). Ngoài ra, các dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR còn cho biết trong phân tử có 2 nối đôi dạng >C=CH- tại H-7 (δH 5,31), với cacbon tương ứng tại C-7 (δC 117,7), C-8 (146,7) và δH 5,10 (br s, H-24), ứng với cacbon tại C-24 (δC 125,2), C-25 (δC 130,9), 7 tín hiệu các proton thuộc nhóm metyl, trong đó có 6 tín hiệu ở dạng singlet tại H-18 (δH 0,75), H-19 (δH 0,85), H-26 (δH 1,68), H-27 (δH 1,61), và H-29 (δH 1,80) và H-30 (δH 1,03), và 1 tín hiệu của nhóm metyl dạng doublet tại H-21 (δH 0,89), ứng với C-21 (δC 18,3). Phân tích các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC của KHH2 và kết hợp so sánh với các dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo cho thấy hoàn toàn phù hợp với axit 3,4-seco-9βH-lanosta-4(28),7,24-trien-3-oic [156]. Do vậy, KHH2 được xác định là axit 3,4-seco-9βH-lanosta-4(28),7,24-trien-3-oic hay axit secococcinic F. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của axit secococcinic F (KHH2) 1 13 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của KHH2 ( H: 500 MHz, C: 125 MHz, CDCl3) TT KHH2 [156] δC δH (mult., J Hz) # δC # δH (mult., J Hz) 1 29,2 2,30 (m) 29,0 2,31 (m) 2 28,8 1,74 và 1,57 (m) 28,8 1,60 và 1,74 (m) 3 180,7 - 179,4 - 4 149,7 - 149,7 - 5 45,4 2,07 (d; 7,5) 45,4 2,07 (d; 7,5) 6 29,7 2,25 và 2,07 (m) 29,7 1,98 và 2,25 (m) 7 117,7 5,32 (br s) 117,7 5,31 (d; 3,0) 8 146,7 - 146,8 - 9 38,8 2,59 (m) 38,8 2,57 (m) 65 10 36,3 - 36,3 - 11 18,6 1,61 và 1,50 (m) 18,6 1,55 và 1,65 (m) 12 33,96 1,83 và 1,66 (m) 34,0 1,44 và 1,82 (m) 13 43,7 - 43,7 - 14 51,6 - 51,6 - 15 34,1 1,45 (m) 34,1 1,44 (m) 16 28,3 1,93 và 1,25 (m) 28,3 1,27 và 1,97 (m) 17 53,1 1,51 (m) 53,0 1,50 (m) 18 21,7 0,75 (s) 21,7 0,75 (s) 19 24,1 0,85 (s) 24,1 0,85 (s) 20 35,9 1,37 (m) 35,9 1,38 (m) 21 18,3 0,89 (d; 6,5) 18,3 0,88 (d; 6,5) 22 36,2 1,48 (m) 36,2 1,04 và 1,44 (m) 23 25,0 2,03 và 1,85 (m) 25,0 1,87 và 2,04 (m) 24 125,2 5,10 (m) 125,2 5,10 (m) 25 130,9 - 130,9 - 26 25,7 1,68 (s) 25,7 1,68 (s) 27 17,7 1,61 (s) 17,6 1,61 (s) 28 112,0 4,87 và 4,83 (br s) 111,9 4,87 và 4,82 (br s) 29 25,9 1,80 (s) 25,9 1,80 (s) 30 27,5 1,03 (s) 25,7 1,03 (s) 1 13 #δH và #δC của axit secococcinic F ( H: 500 MHz, C: 125 MHz, CDCl3) [156]. 3.1.3. Axit kadsuric (KHH3) Hợp chất KHH3 được phân lập dưới dạng hình kim nhỏ, không màu, nhiệt độ nóng chảy 156-158 oC. Phổ 1H-, 13C-NMR kết hợp với DEPT cho biết trong phân tử của KHH3 có 30 nguyên tử cacbon, gồm có 6 nhóm metyl (CH3), 10 nhóm metylen (CH2), 6 nhóm metin (CH) và 8 nguyên tử cacbon bậc 4. Phổ khối LC-ESI-MS cho [M+H]+ (m/z) 471 amu, kết hợp với dữ liệu phổ 13C- NMR cho phép xác định công thức phân tử của KHH3 là C30H46O4. Đây là một hợp chất tritecpen thuộc khung lanostan, gồm có 2 gốc axit cùng với một liên kết đôi ngoại vòng, có nhóm metylen (CH2 olefin) ngoài cùng, một liên kết đôi ở mạch nhánh và một liên kết đôi trong vòng. Phổ 1H- và 13C-NMR cho thấy ở vùng trường thấp có tín hiệu cộng hưởng của 2 proton olefinic (H 4,88 và 4,69; H-28a và H-28b) với cacbon tương ứng C 113,7. Phân tích phổ HSQC là phổ tương tác trực tiếp giữa cacbon và hydro cho biết 2 proton này thuộc nhóm metylen olefin, đây là tương tác rất đặc trưng của nối đôi ngoại vòng. Đặc biệt, trên phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu đặc trưng của 2 nhóm C=O axit ở C 181,1 và ở C 173,7 ứng với C-3 và C-27. Ngoài ra, ở vùng trường thấp còn có tín hiệu của proton olefin tại H 5,34 (1H, dd, J= 5,5 Hz, H-11) và H 6,09 (1H, dd, J= 7,5 Hz, H-24) 66 với cacbon tương ứng C-11 (C 118,6) và C-24 (C 147,3). Phân tích phổ HSQC và HMBC của hợp chất KHH3 cho biết cacbon tại C-3 (C 181,1) chỉ có tương tác với proton của H-2 và H-1, như vậy có thể khẳng định có sự mở vòng tại C-3. Dữ liệu phổ NMR của KHH3 được thống kê trong bảng 3.3. Dựa vào các tài liệu tham khảo đã công bố đã cho biết cacbon ở vị trí C-26 nếu có độ chuyển dịch hóa học nằm trong khoảng C 18ppm trở lên thì cacbon ở vị trí C-24 có cấu hình Z, ngược lại nếu độ chuyển dịch hóa học của cacbon ở vị trí C-26 nằm ở độ dịch chuyển hóa học < 13 ppm thì cacbon ở vị trí C-24 có cấu hình E. Kết hợp các dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo đã cho phép khẳng định hợp chất KHH3 là axit 3,4- seco-lanosta-4(28),9(11),24(Z)-trien-3,26-dioic hay axit kadsuric [161]. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của axit kadsuric (KHH3) 1 13 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của KHH3 ( H: 500 MHz, C: 125 MHz, CDCl3) TT KHH3 [161] δC δH (mult., J Hz) H → C (HMBC) # δC #δH (mult., J Hz) 1 26,7 2,43 và 1,58 (m) 2; 3; 10 29,9 2,76 (m) 2 32,0 2,04 và 1,80 (m) 3 33,4 2,37 và 2,11 (m) 3 181,1 - 176,8 - 4 147,5 - 148,2 - 5 49,5 2,05 (m) 4; 6; 10 49,4 2,19 (m) 6 27,8 7 28,2 1,92 và 1,73 (m) 7 28,9 6 27,0 1,50 (m) 8 42,5 2,14 (m) 7; 9; 14 42,7 2,12 (m) 9 142,4 - 143,0 - 10 42,5 - 42,9 - 11 118,6 5,34 (dd; 5,5) 8; 13 118,8 5,58 (d; 5,5) 12 37,6 37,9 2,08 và 1,87 (m) 13 43,9 - 44,2 - 14 47,2 - 47,5 - 15 33,7 1,38 (m) 16 33,9 1,36 (m) 16 27,8 1,90 và 1,78 (m) 15 28,2 1,52 (m) 17 50,7 1,64 (m) 13; 16; 18; 22 51,2 1,63 (m) 18 14,6 0,66 (s) 12; 13; 14; 17 14,9 0,70 (s) 19 26,8 1,07 (s) 1; 5; 8; 9 27,2 1,11 (s) 67 20 36,0 1,43 (m) 19 36,3 1,47 (m) 21 18,2 0,95 (d) 17; 22; 23 18,4 0,97 (d; 6,4) 22 35,7 1,17 và 1,53 (m) 20; 23 35,5 1,20 và 1,60 (m) 23 26,7 26,0 2,34 và 2,17 (m) 24 147,3 6,09 (dd; 7,5) 22, 26; 27 142,5 7,21 (m) 25 125,8 - - 129,0 - 26 20,4 1,90 (s) - 12,9 2,13 (s) 27 173,7 - 24; 25; 26 170,7 - 28 113,7 4,88 và 4,69 (dd) 13; 14; 15; 17 114,1 4,97 (s) 29 23,2 1,76 (s) 5; 30 23,6 1,83 (s) 30 18,1 0,75 (s) 4; 29 18,5 0,80 (s) 1 13 #δH và #δC của axit kadsuric ( H: 600 MHz, C: 150 MHz, pyridin-d5) [161] 3.1.4. Schizanrin F (KHE3) Hợp chất KHE3 có dạng tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 183-184oC. Phổ FT-IR cho biết dao động hóa trị của nhóm OH ở vùng 3568 cm-1, nhóm CH ở vùng 2961 cm-1, đặc trưng cho liên kết C=C ở vùng 1465 cm-1 và 1620 cm-1, đặc trưng cho liên kết C=O ở vùng 1722 cm-1. 1 Phổ H-NMR của KHE3 cho biết 2 tín hiệu proton olefin đặc trưng tại H 6,84 (1H, s, H-4) và 6,52 (1H, s, H-11), và tín hiệu của các proton thuộc vòng thơm tại H 7,51 (1H, m, H-4'); 7,47 (2H, m, H-2',6'); 7,32 (2H, m, H-3',5'). Ngoài ra, còn có tín hiệu của 2 proton thuộc nhóm metylen liên kết với oxi tại H 5,88 (1H, s, H-6); 5,75 (1H, s, H-9), cặp tín hiệu của proton thuộc nhóm metylendioxi tại H 5,78 (1H, d, J= 1,5 Hz, H-19a) và 5,63 (1H, d, J= 1,5 Hz, H-19b). Trên phổ 1H-NMR còn cho biết tín hiệu của các proton thuộc 4 nhóm metoxi dạng singlet tại H 3,95 (3H, s, 3-OCH3); 3,87 (3H, s, 2-OCH3); 3,62 (3H, s, 1-OCH3); 3,32 (3H, s, 14-OCH3). Ngoài những tín hiệu đặc trưng 1 nói trên, trên phổ H-NMR cũng cho biết proton của 2 nhóm metyl dạng singlet tại H 1,60 (3H, s, H-21'); 1,39 (3H, s, H-17) và proton của nhóm metyl dưới dạng doublet 1,31 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-18). Phổ 13C-NMR và DEPT của KHE3 cho biết trong phân tử có 32 nguyên tử cacbon gồm có 7 nhóm metyl, 1 nhóm metylen, 10 nhóm metin và 14 nguyên tử cacbon bậc 4. Trong đó, có 2 cacbon cacbonyl tại C-20 (C 164,7) và C-21 (168,8); 4 nhóm metoxi tại 1-OCH3 (C 60,5), 2-OCH3 (C 60,5), 14-OCH3 (C 58,7), 3-OCH3 (C 56,0); 3 nhóm cacbon metyl tại C-17 (C 28,8), C-18 (C 17,1), C-21’ (C 20,5), 6 cacbon metin thuộc vòng thơm (C nằm trong khoảng 127,9-133,9), 3 cacbon metin no tại C-8 (C 43,2), C-9 (C 83,4), C-6 (C 85,2) và 1 cacbon metin khác C-11 (C 101,7). Đặc biệt 68 ở vùng trường thấp xuất hiện cacbon metylen đặc trưng cho liên kết O-C