Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây đinh lăng (Polyscias Fruticosa (L.) Harms)

4,93 d (7,5) 4,94 d (8,0) 4,88 d (7,5) 4,83 d (8,0) OMe 3,84 s 3,85 s 3,84 s Glc (1→4) GlcA 1'' 4,82 d (7,5) 6,14 d (8,0) 4,96 d (7,5) 4,96* 4,90 d (8,0) 4,85* 28-O-Glc 1''' 6,28 d (8,0) 6,24 d (8,0) Glc (1→2) GlcA 1''' 5,37 d (7,5) *tín hiệu yếu 91 3.2.7.2. Các hợp chất sterol a. Hợp chất PF7 (Stigmasta-4,22-dien-3-on) Hợp chất PF7 thu được ở dạng tinh thể hình kim, không màu, tan trong cloroform. Phổ 1H-NMR (phụ lục 14b) cho thấy sự hiện diện của 6 nhóm methyl, gồm có 2 tín hiệu mũi đơn tại δH 0,72 (H-18), δH 1,18 (H-19) và 3 tín hiệu mũi đôi tại δH 1,03 (H-21), δH 0,85 (H-26), δH 0,80 (H-27) và 1 methyl mũi ba ở δH 0,80 (H-29) cho biết đây là 1 nhánh nằm ngoài khung chính. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện của 1 proton olefin mũi đơn tại δH 5,72 (H-6) và 2 proton olefin mũi đôi tại δH 5,15 (H-22) và 5,03 (H-23). Phân tích hằng số ghép của hai proton olefin mũi đôi này cho thấy chúng ghép trans với nhau bởi hằng số ghép J = 15,5; 8,5 Hz, chứng tỏ có 2 cặp liên kết đôi C=C. Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 14c, 14d) cho thấy sự hiện diện của 29 carbon, trong đó có 6 nhóm methyl, 9 nhóm methylen, 7 nhóm methin, 4 carbon olefin, 2 nguyên tử carbon bậc 4 và 1 carbon carbonyl ở δC 199,6 (C-3). Độ dịch chuyển hóa học của carbon olefin tứ cấp tại δC 171,6 (C-5) chuyển dịch về vùng từ trường thấp, chứng tỏ sự tồn tại của một liên kết đôi C=C liên hợp với liên kết đôi C=O. Từ những dữ kiện phổ trên hợp chất PF7 được đề nghị có khung sterol với 29 carbon và chứa một cặp liên kết đôi C=C tại C-4 và C-22. Phổ HMBC (phụ lục 14e) cho thấy sự tương quan giữa nhóm methyl ở δH 1,03 (H-21) với 2 carbon methyl ở δC 40,6 (C-20) và 138,1 (C-22) giúp tái khẳng định sự hiện diện của nối đôi C=C tại C-22 và C-23. Từ việc phân tích dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu [157], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF7 được xác định là stigmasta-4,22-dien-3-on.. Đây là hợp chất lần đầu tiên phát hiện trong chi Polyscias so với các nghiên cứu trước đây. Hợp chất PF7 đã từng được công bố trong các loài dương xỉ [157]. 92 b. Hợp chất PF8 (Stigmasterol (stigmasta-5,22-dien-3-ol)) Hợp chất PF8 ở dạng tinh thể hình kim, không màu, tan trong cloroform. Phổ IR (KBr) (phụ lục 15a) có các tín hiệu đặc trưng ở 3421,6 cm-1 (O-H), 2936,87 (C-H), 1049 (C-O). . Phổ 1H-NMR (phụ lục 15b) cho thấy sự hiện diện 6 nhóm methyl, gồm có 2 tín hiệu mũi đơn tại δH 0,70 (H-18), δH 1,01 (H-19) và 3 tín hiệu mũi đôi tại δH 0,97 (H-21), δH 0,81 (H-26), δH 0,79 (H-27) và 1 methyl mũi ba ở δH 0,83 (H-29) cho biết đây là 1 nhánh nằm ngoài khung chính. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện của 3 tín hiệu proton olefin tại δH 5,35 (H-6), δH 5,15 (H-22), δH 5,02 (H-23). Phân tích hằng số ghép của hai proton olefin mũi đôi này cho thấy chúng ghép trans với nhau bởi hằng số ghép J=15,0; 8,5 Hz, chứng tỏ có 2 cặp liên kết đôi C=C. Đồng thời xuất hiện 1 tín hiệu methin liên kết với nhóm OH tại δH 3,52 (H-3). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 15c, 15d) của PF8 tương tự hợp chất PF7 cho thấy có sự hiện diện của 29 carbon, trong đó có 6 nhóm methyl, 9 nhóm methylen, 11 nhóm methin và 3 nguyên tử carbon bậc 4. Ngoài ra, còn có 1 tín hiệu carbon hydroxymethin tại δC 71,9 ppm (C-3), cho biết có sự tồn tại của 1 nhóm hydroxyl. Dữ liệu phổ còn chỉ ra sự hiện diện của 2 liên kết đôi trong phân tử được xác nhận bởi 2 cặp carbon ở δc 140,8 (C-5) và 121,7 (C-6); δc 138,3 (C-22) và 129,3 (C-23) của liên kết đôi dạng -HC=CH- trên mạch carbon hở. Đó là các tín hiệu đặc trưng của khung stigmasta-5,22-dien. Từ việc phân tích dữ liệu phổ IR, 1H, 13C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu [157], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF8 được xác định là stigmasterol. Hợp chất này đã từng tìm thấy trong loài Polyscias balfouriana và Polyscias serrata [43]. PF7: Stigmasta-4,22-dien-3-on PF8: Stigmasterol Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của PF7 và PF8 93 Bảng 3.12. Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) và 1H-NMR (500 MHz) của PF7, PF8 Vị trí C Hợp chất PF7 Stigmasta- 4,22-dien- 3-on [157] Hợp chất PF7 Stigmasta- 4,22-dien- 3-on [157] Hợp chất PF8 Stigmasterol [157] Hợp chất PF8 Stigmasterol [157] δC ppm CDCl3 δC ppm CDCl3 δH ppm CDCl3 δH ppm CDCl3 δC ppm CDCl3 δC ppm CDCl3 δH ppm CDCl3 δH ppm CDCl3 1 35,7 35,7 37,3 37,2 2 34,0 33,8 31,7 32,0 3 199,6 199,7 71,9 71,8 3,52 m 3,51 m 4 123,8 123,7 5,72 s 5,74 s 42,3 42,2 5 171,6 171,8 140,8 140,7 6 33,0 33,0 121,7 121,7 5,35 t (5,5) 5,34 t (5,4) 7 32,1 32,0 31,9 31,6 8 35,7 35,6 31,9 31,9 9 55,9 55,9 50,2 50,1 10 38,6 38,6 36,6 36,5 11 21,2 21,0 21,1 21,0 12 39,6 39,6 39,7 39,7 13 42,3 42,4 42,4 42,3 14 53,8 53,8 56,0 56,7 15 24,3 24,2 24,4 26,0 16 28,9 28,9 28,9 28,9 17 56,0 56,0 56,9 56,0 18 12,2 11,9 0,72 s 0,75 s 12,3 11,8 0,70 s 0,68 s 19 17,4 17,4 1,18 s 1,20 s 19,4 19,0 1,01 s 0,99 s 20 40,6 40,5 40,5 40,5 21 21,1 21,2 1,03 d (7,6) 1,03 d (6,6) 21,2 18,7 0,97 d (6,5) 0,91 d (6,3) 22 138,1 138,1 5,15 dd (15,5; 8,5) 5,15 dd (15,1; 8,7) 138,3 138,3 5,15 dd (15,0; 8,5) 4,99 dd (15,5; 9,0) 23 129,5 129,4 5,03 dd (15,5; 8,5) 5,04 dd (15,1; 8,7) 129,3 129,2 5,02 dd (15,0; 8,5) 5,14 dd ( 15,5; 9,0) 24 51,2 51,2 51,3 51,2 25 31,9 32,0 31,3 29,1 26 19,0 19,0 0,85 d (6,5) 0,86 d (6,4) 19,0 19,8 0,81 d (6,5) 0,81 d (6,4) 27 21,1 21,1 0,80 d (6,5) 0,86 d (6,4) 21,1 19,4 0,79 d (6,5) 0,76 d (6,5) 28 25,4 25,4 25,4 23,0 29 12,1 12,0 0,80 t (6,5) 0,82 t (7,3) 12,3 11,9 0,83 t (8,0) 0,84 t (3,3) 94 3.2.7.3. Các hợp chất flavonoid a. Hợp chất PF10 (Kaempferol-3-O-rhamnosid (Afzelin)) Hợp chất PF10 thu được ở dạng chất bột màu vàng nhạt, dễ tan trong aceton. Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 17a) cho mũi ion phân tử [M+Na]+ tại m/z 455,0930 (lý thuyết 455,0954), cho phép xác định công thức phân tử là C21H20O10. Phổ 1H-NMR (phụ lục 17b) của hợp chất PF10 tại vùng từ trường yếu, cho thấy sự hiện diện của 1 nhóm -OH tại δH 12,71 (s, 1H) và 2 tín hiệu proton nhân thơm tại δH 6,48 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-8), δH 6,27 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-6) ghép cặp meta với nhau đặc trưng cho nhân thơm A của khung flavonoid. Phổ 1H–NMR còn cho thấy 2 tín hiệu proton nhân thơm tại δH 7,86 (d, 2H, J = 8,5 Hz), δH 7,02 (d, 2H, J = 9,0 Hz) chứng tỏ sự hiện diện của 1 nhân thơm mang 2 nhóm thế ở vị trí 1,4 (nhân B). Phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của 5 nhóm oxymethin tại δH 5,54 (brs, 1H), δH 4,23 (brs, 1H), δH 3,70 (dd, 1H, J = 9,0, 2,5 Hz), δH 3,33 (m, 1H), δH 3,30 (m, 1H) và 1 nhóm methyl mũi đôi tại δH 0,90 (d, 3H, J = 5,5 Hz), khẳng định sự hiện diện của phân tử đường α-L-rhamnopyranosyl trong cấu trúc của hợp chất PF10. Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC (phụ lục 17c, 17e) giúp xác định 21 tín hiệu carbon của hợp chất PF10, trong đó bao gồm 15 tín hiệu carbon của flavonoid (bao gồm 1 nhóm carbonyl tại δC 179,3; có 6 tín hiệu carbon sp2 liên kết trực tiếp với nguyên tử oxygen tại δC 165,0; 163,2; 160,9; 158,5; 158,0 và 135,6; có 5 tín hiệu carbon nhân thơm tại δC 131,7; 116,3; 105,8; 99,8; 94,3) và 6 tín hiệu của phân tử đường α-L-rhamnopyranosyl (5 tín hiệu methin tại δC 102,8; 73,0; 72,2; 71,5; 71,4 và 1 tín hiệu của nhóm methyl tại δC 17,7). Khảo sát dữ liệu phổ HMBC (phụ lục 17d) giúp khẳng định hợp chất PF10 là một hợp chất flavonoid glycosid. Bên cạnh đó, tương quan giữa tín hiệu proton anomer tại δH 5,54 (H-1'') và tín hiệu carbon tại δC 135,6 (C-3) chứng tỏ sự liên kết của phân tử đường tại C-3 của phần aglycon. Từ việc phân tích dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H, 13C-NMR, kết hợp với phổ HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu [81], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF10 được xác định là kaempferol-3-O-rhamnosid. Hợp chất PF10 đã từng được công bố có trong lá Polyscias fruticosa nĕm 2012 [30]. 95 Hình 3.22. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của PF10 Bảng 3.13. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) và 1H-NMR (500 MHz) của hợp chất PF10 và kaempferol-3-O-rhamnosid Vị trí Hợp chất PF10 Kaempferol-3-O-rhamnosid [81] δC (ppm) (Aceton-d6, 125 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (Aceton-d6, 500 MHz) δC (ppm) (MeOD-d4, 150 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (MeOD-d4, 600 MHz) 2 158,5 159,3 3 135,6 136,2 4 179,3 179,6 5 163,2 163,2 6 99,8 6,27 d (2,0) 99,8 6,30 d (1,9) 7 165,0 165,9 8 94,3 6,48 d (2,0) 94,7 6,48 d (1,9) 9 158,0 158,5 10 105,8 105,9 5-OH 12,71 s 1’ 122,7 122,6 2’ 131,7 7,86 d (8,5) 131,9 7,86 d (8,5) 3’ 116,3 7,02 d (9,0) 116,5 7,03 d (8,7) 4’ 160,9 161,6 5’ 116,3 7,02 d (9,0) 116,5 7,03 d (8,7) 6’ 131,7 7,86 d (8,5) 131,9 7,86 d (8,5) 1’’ 102,8 5,54 brs 103,5 5,47 d (1,6) 2’’ 71,5 4,23 m 71,9 4,31 dd (3,3; 1,6) 3’’ 72,2 3,70 dd (9,0; 2,5) 72,1 3,80 dd (9,0; 3,4) 4’’ 73,0 3,33 m 73,1 3,42 m 5’’ 71,4 3,30 m 72,0 3,40 m 6’’ 17,7 0,90 d (5,5) 17,6 1,01 d (5,5) 96 b. Hợp chất PF12 (Liquiritigenin) Hợp chất PF12 thu được ở dạng bột màu vàng nhạt, dễ tan trong aceton. Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 19a) cho mũi ion phân tử [M-H]- tại m/z 255,0661 (lý thuyết 255,0657), cho phép xác định công thức phân tử là C15H12O4. Phổ 1H-NMR (phụ lục 19b) của hợp chất PF12 ở vùng trường thấp cho thấy sự hiện diện của 7 tín hiệu proton vòng thơm, gồm proton của vòng thơm A tương ứng với 1 vòng thơm có các nhóm thế ở vị trí 1, 3, 4 [δH 6,41 (1H, d, J =2,5 Hz, H- 8), δH 7,71 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5) và δH 6,56 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz, H-6)] và 4 proton đối xứng từng cặp của vòng thơm B [δH 7,39 (2H, d, J = 8,5, H-2' và H-6') và δH 6,89 (2H, d, J =8,5 Hz, H-3' và H-5')]. Ở vùng trường cao xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 nhóm methylen [δH 2,66 (1H, dd, J =16,5; 3,0 Hz, H-3a) và δH 3,06 (m, H-3b)] và 1 nhóm oxymethin ở δH 5,44 (1H, dd, J =13,0; 3,0 Hz, H-2). Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ HSQC (phụ lục 19c, 19e) cho thấy hợp chất PF12 có sự hiện diện của 15 tín hiệu carbon bao gồm: 1 carbon carbonyl (δC 190,9), 12 carbon vòng thơm (δC 128,3; 110,2; 164,4; 102,8; 65,6; 114,4; 130,7; 128,0; 115,5; 158,1; 115,5; 128,0), 1 carbon methylen (δC 43,4), và 1 carbon methin (δC 80,0). Dựa vào các tín hiệu phổ đặc trưng: Proton δH 5,44 (C-2) và 2 proton δH 2,66 và δH 3,00 (C-3) và tín hiệu 1 carbon carbonyl tại δC 190,9 (C-4) có thể dự đoán hợp chất PF12 có khung flavan. Phổ HMBC (phụ lục 19d) cho thấy hợp chất PF12 có tương quan của proton ở δH 7,71 (d, 8,5, H-5) và δH 6,41 (d, 2,5, H-8) với carbon tứ cấp ở δC 164,4 (C-7), giúp xác định nhóm thế OH được xác định tại vị trí C-7. Tương quan HMBC của proton ở δH 7,39 (H-2') và δH 6,89 (H-6') với cùng δC 80,0 (C-2) giúp xác định sự liên kết của nhân B và nhân C tại C-2. Từ việc phân tích dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H, 13C-NMR, kết hợp với phổ HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu [112], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF12 được xác định là liquiritigenin. Đây là hợp chất lần đầu tiên phát hiện trong chi Polyscias so với các nghiên cứu trước đây. Hợp chất PF12 đã từng được công bố có trong loài Guizotia abyssinica nĕm 2007 [112]. 97 Hình 3.23. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc hóa học của PF12 Bảng 3.14. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (100 MHz) và 1H-NMR (400 MHz) của hợp chất PF12 và liquiritigenin Vị trí Hợp chất PF12 Liquiritigenin [112] δC (ppm) (Aceton-d6, 100 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (Aceton-d6, 400 MHz) δC (ppm) (Aceton-d6, 100 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (Aceton-d6, 400 MHz) 1 - - 2 80,0 5,44 dd (13,0; 3,0) 79,5 5,40 dd (12,8; 2,8) 3 43,4 3,00 m 2,66 dd (16,0; 3,5) 43,8 3,00 dd (16,8; 12,8) 2,62 dd (16,0; 2,8) 4 190,9 189,6 5 128,2 7,71 d (8,5) 128,5 7,68 d (8,8) 6 110,2 6,56 dd (8,5; 2,0) 110,9 6,54 dd (8,8; 2,4) 7 164,4 165,9 8 102,8 6,41 d (2,5) 102,8 6,38 d (2,4) 9 165,6 163,8 10 114,4 113,5 1’ 130,7 130,4 2’ 128,0 7,39 d (8,5) 128,0 7,36 d (8,8) 3’ 115,5 6,89 d (8,5) 115,2 6,87 d (8,8) 4’ 158,1 157,7 5’ 115,5 6,89 d (8,5) 115,2 6,87 d (8,8) 6’ 128,0 7,39 d (8,5) 128,0 7,36 d (8,8) 3.2.7.4. Các hợp chất phenol a. Hợp chất PF15 [acid (E)-3,4-dihydroxycinnamic (acid caffeic)] Hợp chất PF15 dạng tinh thể hình kim, không màu, tan trong aceton. Phổ 1H-NMR (phụ lục 22a) của hợp chất PF15 tại vùng từ trường thấp, cho thấy sự hiện diện của 3 tín hiệu proton nhân thơm tại δH 7,16 (d, J = 2,0 Hz), δH 7,03 (dd, J = 8,4; 2,0 Hz), δH 6,86 (d, J = 8,4 Hz). Dựa vào hằng số ghép của 3 tín hiệu proton nhân thơm có thể khẳng định hợp chất PF15 có 1 nhân thơm mang 3 nhóm thế tại vị trí 1,3,4. Bên cạnh đó, phổ 1H–NMR còn cho thấy sự hiện diện của 2 tín hiệu proton olefin ghép trans tại δH 7,53 (d, J = 16,0 Hz) và δH 6,20 (d, J = 16,0 Hz) ghép trans với nhau dựa trên hằng số ghép J = 16,0 Hz. Chứng tỏ có 1 liên kết đôi ở C-7, C-8 (CH=CH). 98 Phổ 13C-NMR (phụ lục 22b) của hợp chất PF15 xuất hiện 9 tín hiệu carbon, trong đó bao gồm 1 tín hiệu carbon carbonyl tại δC 168,1; có 2 tín hiệu carbon thơm liên kết trực tiếp với nguyên tử oxygen tại δC 147,9 và δC 143,6; có 4 tín hiệu carbon nhân thơm tại δC 127,7; 122,4; 116,4; 115,8 và 2 tín hiệu carbon olefin tại δC 145,9 và δC 115,2. Các dữ kiện nêu trên giúp khẳng định hợp chất PF15 là một dẫn xuất của acid cinnamic. Từ việc phân tích dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR kết hợp so sánh với tài liệu [146], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF15 được xác định là acid (E)- 3,4-dihydroxycinnamic (acid caffeic). Đây là hợp chất lần đầu tiên phát hiện trong chi Polyscias so với các nghiên cứu trước đây. Hợp chất PF15 đã từng được công bố có trong loài Cassia alata nĕm 2013 [146]. Bảng 3.15. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (100 MHz) và 1H-NMR (400 MHz) của hợp chất PF15 và acid (E)-3,4-dihydroxycinnamic Vị trí Hợp chất PF15 Acid (E)-3,4-dihydroxycinnamic [146] δC (ppm) (Aceton-d6, 100 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (Aceton-d6, 400 MHz) δC (ppm) (DMSO-d6, 75 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (DMSO-d6, 300 MHz) 1 127,7 126,2 2 115,8 7,16 d (2,0) 115,6 7,02 s 3 147,9 148,6 4 145,9 146,0 5 116,4 6,86 d (8,4) 116,2 6,75 d (8,1) 6 122,4 7,03 dd (8,4; 2,0) 121,6 6,95 dd (8,1; 2,1) 7 143,6 7,53 d (16,0) 145,1 7.41 d (15,9) 8 115,2 6,20 d (16,0) 115,1 6,16 d (15,9) 9 168,1 168,4 1-OH 9,52 brs 2-OH 9,12 brs 9-COOH 12,11 brs b. Hợp chất PF16 ((E)-Isoferulaldehyd) Hợp chất PF16 thu được ở dạng dầu màu vàng nhạt, dễ tan trong MeOH. Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 23a) cho mũi ion phân tử [M-H]- tại m/z 177,0555 (lý thuyết 177,0551), cho phép xác định công thức phân tử là C10H10O3. Trên phổ 1H-NMR (phụ lục 23b) của hợp chất PF16 tương tự hợp chất PF15 cho thấy sự hiện diện của 3 tín hiệu proton nhân thơm tại δH 7,16 (d, J = 2,0 Hz), δH 7,07 (dd, J = 8,4; 2,0 Hz), δH 6,76 (d, J = 8,4 Hz) giúp xác định một nhân benzen 99 mang 3 nhóm thế ở vị trí 1,3,4. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện của một nhóm methoxy tại δH 3,81. Bên cạnh đó, còn có 1 tín hiệu proton aldehyd tại δH 9,48 (d, J = 8,0 Hz), 2 tín hiệu proton olefin ghép cặp với nhau tại δH 7,49 (d, J = 15,6 Hz), δH 6,56 (dd, J = 15,6; 8,0 Hz) cho thấy sự hiện diện cúa nhóm CH=CH-CHO và cấu hình trans của liên kết đôi C-7, C-8. Từ việc phân tích dữ liệu phổ 1H-NMR kết hợp so sánh với tài liệu [54], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF16 được xác định là (E)- isoferulaldehyd. Đây là hợp chất lần đầu tiên phát hiện trong chi Polyscias so với các nghiên cứu trước đây. Hợp chất PF16 đã từng được công bố có trong loài Tamarix nilotica nĕm 1987 [54]. PF15: Acid caffeic PF16: (E)-Isoferulaldehyd Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của PF15 và PF16 Bảng 3.16. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz) của hợp chất PF16 và (E)- isoferulaldehyd Vị trí Hợp chất PF16 (E)-isoferulaldehyd [54] δH (ppm) (MeOD-d4, 400 MHz) δH (ppm) (CDCl3, 500 MHz) 1 2 7,16 d (2,0) 7,16 d (2,0) 3 4 5 6,76 d (8,4) 6,76 d (7,0) 6 7,07 dd (8,4; 2,0) 6,80 dd (7,0; 2,0) 7 7,49 d (15,6) 7,38 d (16,0) 8 6,56 dd (15,6; 8,0) 6,55 dd (16,0; 8,0) 9 9,48d (8,0) 9,60 d (8,0) 4-OCH3 3,81 s 3,80 s 100 3.2.7.5. Hợp chất coumarin Hợp chất PF11 (Esculetin) Hợp chất PF11 dạng bột màu vàng, dễ tan trong aceton. Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 18a) cho mũi ion phân tử [M-H]- tại m/z 177,0194 (lý thuyết 177,0187), cho phép xác định công thức phân tử là C9H6O4. Phổ 1H-NMR (phụ lục 18b) của hợp chất PF11 tại vùng từ trường yếu, cho thấy sự hiện diện của 2 nhóm hydroxy tại δH 9,31 và δH 8,53; 2 tín hiệu proton thơm mũi đơn tại δH 7,05, δH 6,78 và 2 proton olefin mũi đôi ghép cis với nhau tại δH 6,15 (d, J = 9,6 Hz) và δH 7,79 (d, J = 9,6 Hz). Các dữ liệu trên chứng tỏ hợp chất PF11 mang khung coumarin với hai nhóm –OH tại vị trí C-6 và C-7. Dữ liệu phổ 13C-NMR (phụ lục 18c) giúp khẳng định cấu trúc hợp chất PF11 với sự hiện diện của 9 tín hiệu carbon, trong đó bao gồm 1 tín hiệu của nhóm carbonyl ester tại δC 161,4; có 3 tín hiệu carbon sp2 gắn trực tiếp với nguyên tử oxygen tại δC 150,7; 150,2; 143,4; có 3 tín hiệu carbon nhân thơm tại δC 113,3; 113,2; 103,6 và 2 tín hiệu carbon olefin tại δC 144,6; 113,2. Từ việc phân tích dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H, 13C-NMR kết hợp so sánh với tài liệu [98], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF11 được xác định là esculetin. Đây là hợp chất lần đầu tiên phát hiện trong chi Polyscias so với các nghiên cứu trước đây. Hợp chất PF11 đã từng được công bố có trong loài Artemisia montana nĕm 2000 [98]. Hình 3.25. Cấu trúc của hợp chất PF11 101 Bảng 3.17. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (100 MHz) và 1H-NMR (400 MHz) của hợp chất PF11 và esculetin Vị trí Hợp chất PF11 Esculetin [98] δC (ppm) (Aceton-d6, 100 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (Aceton-d6, 400 MHz) δC (ppm) (MeOD-d4, 125 MHz δH (ppm) (J, Hz) (MeOD-d4, 500 MHz) 2 161,4 164,2 3 113,2 6,15 d (9,6) 112,8 6,16 d (9,5) 4 144,6 7,79 d (9,6) 146,0 7,76 d (9,5) 4a 112,4 112,5 5 113,3 7,05 s 113,0 6,92 s 6 143,4 144,5 7 150,2 150,5 8 103,6 6,78 s 103,6 6,74 s 8a 150,7 151,9 6-OH 7-OH 9,31 brs 8,53 brs 3.2.7.6. Hợp chất sesquiterpen Hợp chất PF13 (6,15α-epoxy-1β, 4β-dihydroxyeudesman) Hợp chất PF13 thu được ở dạng bột, không màu, dễ tan trong cloroform. Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 20a) cho mũi ion phân tử [M+H2O+Na]+ tại m/z 295,1835 (lý thuyết 295,1932), cho phép xác định công thức phân tử là C15H26O3. Phổ 1H-NMR (phụ lục 20b) của hợp chất PF13 cho thấy sự hiện diện của 2 tín hiệu nhóm methyl mũi đôi tại δH 0,98 (d, 3H, J = 7,0 Hz), δH 0,92 (d, 3H, J = 6,5 Hz) và 1 nhóm methin mũi đa tại δH 1,88 (m, 1H), chứng tỏ sự hiện diện của nhóm isopropyl. Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR còn xuất hiện 2 nhóm oxymethin tại δH 3,76 (dd, 1H, J =11,5; 9,5 Hz) và δH 3,40 (dd, 1H, J = 11,0; 4,0 Hz); có 1 nhóm oxymethylen tại δH 3,74 (d, 1H, J = 9,0 Hz) và δH 3,64 (d, 1H, J = 9,0 Hz); 1 nhóm methyl mũi đơn tại δH 1,05 (s, 3H) và các tín hiệu nhóm methylen và methin ở vùng từ trường cao δH 1,98-1,03. Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC (phụ lục 20c, 20e) cho thấy sự hiện diện 15 tín hiệu carbon, bao gồm 3 nhóm methyl (δC 20,9; 18,8; 13,0); có 2 carbon tứ cấp (δC 39,2 và δC 76,7); 5 nhóm methin (δC 80,7; 75,7; 57,4; 51,4; 29,7); 5 nhóm methylen 102 (δC 80,5; 39,7; 33,0; 28,1; 22,5). Độ dịch chuyển hóa học của các carbon tại δC 80,7; 75,7 và δC 80,5 chứng tỏ các carbon này liên kết trực tiếp với oxygen. Khảo sát dữ liệu phổ HMBC (phụ lục 20d) của hợp chất PF13 giúp khẳng định cấu trúc của hợp chất. Cụ thể, các tương quan HMBC giữa δH 3,76 (H-6) với các carbon tại δC 76,7 (C-4) và δC 29,7 (C-11); giữa δH 3,40 (H-1) với các carbon tại δC 39,7 (C-9) và δC 13,0 (C-15); giữa δH 1,88 (H-11) với các carbon tại δC 51,4 (C-7), δC 22,5 (C-8), δC 20,9 (C-13), δC 18,8 (C-12) và cuối cùng giữa δH 1,03 (H-15) với các carbon tại δC 80,7 (C-1), δC 57,4 (C-5), δC 39,7 (C-9), δC 39,2 (C-10) chứng tỏ hợp chất PF13 là hợp chất sesquiterpen thuộc khung carbon selinen. Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa δH 3,64 (H-14) và δC 75,7 (C-6) xác nhận vòng furan giữa C-14 và C-6. Ngoài ra, phân tích hằng số ghép của các tín hiệu proton H-1 (J = 11,0; 4,0 Hz) giúp xác định vị trí trục của proton này (hay nhóm 1-OH ở vị trí β). Tương tự phân tích hằng số ghép của H-6 (J = 11,5; 9,5 Hz) giúp xác định proton này ở vị trí trục và qua đó xác định các proton H-5 và H-7 cũng phải ở vị trí trục. Từ việc phân tích dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H, 13C-NMR, kết hợp với phổ HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu [80], cho thấy có sự tương đồng. Do đó, cấu trúc hợp chất PF13 được xác định là 6,15α-epoxy-1β, 4β-dihydroxyeudesman. Đây là hợp chất lần đầu tiên phát hiện trong chi Polyscias so với các nghiên cứu trước đây. Hợp chất PF13 đã từng được công bố có trong loài Ageratina saltillensis nĕm 1988 [80]. Hình 3.26. Các tương tác HMBC chính và cấu trúc của PF13 103 Bảng 3.18. So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) và 1H-NMR (500 MHz) của hợp chất PF13 và 6,15α-epoxy-1β, 4β-dihydroxyeudesman Vị trí Hợp chất PF13 6,15α-epoxy-1β,4β-dihydroxyeudesman [80] δC (ppm) (CDCl3, 125 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (CDCl3, 500 MHz) δC (ppm) (CDCl3, 90 MHz) δH (ppm) (J, Hz) (CDCl3, 500 MHz) 1 80,7 3,40 dd (4,0; 11,0) 80,5 3,37 brdd (4,1; 11,0) 2 28,1 1,96 m 1,79 t (3,0) 28,0 1,98 m 1,77 m 3 33,0 1,93 d (4,0) 1,56 d (4,0) 33,2 4 76,7 80,4 5 57,4 1,03 d (7,0) 57,6 1,03 d (11,6) 6 75,7 3,76 dd (9,5; 11,5) 75,6 3,73 dd (9,4; 11,6) 7 51,4 1,30 m 51,2 1,28 m 8 22,5 1,63 m 1,25 m 22,2 9 39,7 1,81 t (3,5) 1,11 d (3,5) 39,7 10 39,2 39,1 11 29,7 1,88 m 29,6 12 18,8 0,92 d (6,5) 18,5 0,96 d (11) 13 20,9 0,98 d (7,0) 20,7 0,90 d (6,9) 14 80,5 3,74 d (9,0) 3,64 d (9,0) 76,5 3,71 d (9,1) 3,60 d (9,1) 15 13,0 1,05 s 12,8 1,03 s Bảng 3.19. Tổng hợp các hợp chất phân lập được Hợp chất (Hàm lượng) CTPT Cấu trúc/Tên Ghi chú Triterpenoid PF9 (15 mg) C30H48O3 Đã biết 104 Hợp chất (Hàm lượng) CTPT Cấu trúc/Tên Ghi chú Acid oleanolic PF14 (8 mg) C30H50O2 Olean-12-en-3β,15α-diol Mới trong chi Saponin triterpenoid PF1 (33 mg) C42H66O14 Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)--D- glucuronopyranosyl oleanolic (Ladyginosid A) Đã biết PF2 (22 mg) C42H66O14 3-O--D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β- D-glucopyranosyl ester (Chikusetsusaponin IVa) Mới trong chi PF3 (22 mg) C43H68O14 Mới trong loài 105 Hợp chất (Hàm lượng) CTPT Cấu trúc/Tên Ghi chú Acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-(6- O-methyl) glucuronopyranosyloleanolic PF4 (12 mg) C49H78O19 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-(6-O- methyl)glucuronopyranosyl oleanolic acid 28-O- β-D-glucopyranosyl ester (Polysciosid J) Mới trong tự nhiên PF5 (15 mg) C49H78O19 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→4), β-D- glucopyranosyl-(1→2)]--D-(6-O-methyl) glucuronopyranosyl oleanolic acid (Polysciosid K) Mới trong tự nhiên PF6 (70 mg) C48H76O19 3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→4)--D- glucuronopyranosyl] oleanolic -28-O--D- glucopyranosyl ester (PFS) Đã biết Sterol 106 Hợp chất (Hàm lượng) CTPT Cấu trúc/Tên Ghi chú PF7 (20 mg) C29H46O Stigmasta-4,22-dien-3-on Mới trong chi PF8 (45 mg) C29H48O Stigmasterol (Stigmasta-5,22 dien-3-ol) Mới trong loài Flavonoid PF10 (17 mg) C21H20O10 Kaempferol-3-O-rhamnosid (Afzelin) Đã biết PF12 (7 mg) C15H26O3 Liquiritigenin Mới trong chi 107 Hợp chất (Hàm lượng) CTPT Cấu trúc/Tên Ghi chú Phenol PF15 (15 mg) C9H8O4 Acid (E)-3,4-dihydroxycinnamic (Acid caffeic) Mới trong chi PF16 (6 mg) C10H10O3 (E)-Isoferulaldehyd Mới trong chi Coumarin PF11 (16 mg) C9H6O4 Esculetin Mới trong chi Sesquiterpen PF13 (11 mg) C15H28O4 6,15α-epoxy-1β, 4β-dihydroxyeudesman Mới trong chi 108 3.3. NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 3.3.1. Kết quả độc tính cấp đường uống Trước khi khảo sát tác dụng sinh học, các cao Đinh lĕng nghiên cứu được khảo sát độc tính cấp sau 72 giờ thử nghiệm và sau 14 ngày uống cao toàn phần lá, cao toàn phần rễ, cao n-BuOH lá, cao n-BuOH rễ ở liều thử nghiệm như Bảng 3.20. thì số lượng chuột ở các lô thử nghiệm có phân suất tử vong là 0%. Quan sát hành vi và thể trạng tổng quát chuột thử nghiệm cho thấy không có triệu chứng bất thường nào trên chuột thử nghiệm. Lặp lại thử nghiệm 2 lần (mỗi lần 5 con) và xác định liều Dmax của cao toàn phần lá, cao toàn phần rễ, cao n-BuOH lá, cao n-BuOH rễ ở liều 22,47 g/kg; 26,91 g/kg; 22,25 g/kg; 31,28 g/kg chuột tương ứng. Từ kết quả này và theo mục 2.3.3.2 thiết