Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây xáo tam phân (paramignya trimera (oliv.) guill.) và cây nhó đông (morinda longissima y. z. ruan)

như: hoàng đản do tắc mật, gan nhiễm mỡ, rối loạn chuyển hóa lipid... Chính vì vậy, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng của cao metanol và cao nước Xáo tam phân tới nồng độ cholesterol toàn phần Bảng 4. 4.Ảnh hưởng của cao metanol và cao nước lên nồng độ cholesterol toàn phần huyết thanh chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol (n=6) Lô Thuốc và liều lượng Cholesterol TP (mmol/L) Giá trị p 1 Đối chứng sinh lý 2,38 ± 0,08 2 Đối chứng bệnh lý 3,43 ± 0,54 p<0,05 so với (1) 3 cao metanol 10g/kg 2,78 ± 0,49 p<0,05 so với (1) P<0,05 so với (2) p>0,05 so với (5) 4 cao nước liều 10g/kg 3,23 ± 0,30 p<0,05 so với (1) p>0,05 so với (2) 5 Đối chứng tham khảo 2,80 ± 0,44 p>0,05 so với (1) 54 p<0,05 so với (2) Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy khi chuột được uống cao metanol xáo tam phân liều 10 g/kgP thì chỉ số cholesterol toàn phần đã giảm gần bằng so với lô đối chứng sinh lý) (p>0,05)và có sự sai khác thống kê so với lô đối chứng bệnh lý (p<0,05). Trong khi đó ở lô được uống cao nước xáo tam phân liều 10 g/kgP không sự sai khác thống kê so với lô đối chứng bệnh lý (p>0,05). Chỉ số cholesterol toàn phần ở lô uống cao chiết metanol giảm hơn so với lô uống cao chiết nước, sự sai khác là có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của cao metanol và cao nước Xáo tam phân lên khối lượng gan tương đối Sau quá trình thí nghiệm, toàn bộ chuột được mổ để thu nhận gan và được xác định khối lượng theo phương pháp của Girish và đồng tác giả. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4. 5. Khối lượng gan chuột ở các lô thí nghiệm Lô Thuốc và liều lượng Khối lượng gan (g/10g cơ thể) Giá trị p 1 Đối chứng sinh lý 0,381 ± 0,009 2 Đối chứng bệnh lý 0,567 ± 0,033 p<0,05 so với (1) 3 cao metanol 10g/kg 0,404 ± 0,011 p<0,05 so với (5) p>0,05 so với (2) 4 cao nước liều 10g/kg 0,461 ± 0,042 p<0,05 so với (2) p>0,05 so với (5) 5 Đối chứng tham khảo 0,490 ± 0,067 p<0,05 so với (1) Kết quả kiểm tra khối lượng gan cho thấy gan ở lô đối chứng bệnh lý, không được sử dụng cao chiết Xáo tam phân có khối lượng lớn nhất. Trong khi đó, ở các lô được sử dụng cao chiết Xáo tam phân, khối lượng gan nhỏ hơn so với đối chứng và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với p<0.05. Kết quả kiểm tra đại thể gan Kiểm tra đại thể gan giữa các lô thí nghiệm cho thấy: lô chuột uống cao metanol và cao nước liều 10 g/kgP cũng như lô đối chứng tham khảo (uống Sylimarin 50 mg/kgP) biểu hiện tổn thương gan có giảm so với lô chứng bệnh lý (lô 2). Đặc biệt là lô chuột uống cao metanol liều 10 g/kgP và lô đối chứng tham khảo 55 (uống sylimarin 50 mg/kgP) gần như không thấy biểu hiện tổn thương gan (bảng 4.6). Bảng 4. 6. Quan sát hình thái trực quan gan chuột ở các lô thí nghiệm Lô Thuốc và liều lượng Quan sát hình thái trực quan gan 1 Đối chứng sinh lý Gan bình thường, nhu mô gan đồng nhất 2 Đối chứng bệnh lý 3/5 con gan bị hoại tử toàn bộ và xung huyết toàn bộ gan, gan to phù, nhu mô sần sùi không mịn 3 cao metanol 10g/kg Gan bình thường, nhu mô gan đồng nhất 4 cao nước liều 10g/kg 1/5 con gan bị tổn thương, nhu mô gan không đều 5 Đối chứng tham khảo Gan bình thường, nhu mô gan đồng nhất Kết quả kiểm tra thông qua tiêu bản vi thể tế bào gan (hình 4.1) cũng cho thấy lô chuột uống cao metanol và cao nước liều 10 g/kgP cũng như lô đối chứng tham khảo (uống Sylimarin 50 mg/kgP) biểu hiện tổn thương gan có giảm so với lô chứng bệnh lý (lô 2) như là: tế bào gan xung quanh tĩnh mạch trung tâm bình thường, vùng khoảng cửa và xung quanh tiểu thùy lác đác một số tế bào viêm cấp, tế bào gan ít thoái hóa hạt, không bị thoái hốc khi so sánh với chứng bệnh lý. Hình 4. 1.Hình ảnh tiêu bản vi thể tế bào gan ở độ phóng đại 200X (A): Đối chứng sinh lý, (B): Đối chứng bệnh lý, (C): cao metanol liều 10g/kg, (D) cao nước liều 10g/kg, (E): Đối chứng tham khảo Kết quả nghiên cứu cho thấy lô chuột không được uống hoạt chất bảo vệ (lô đối chứng bệnh lý) có nồng độ AST, ALT trong huyết thanh tăng cao và thể hiện tổn thương gan rõ rệt (quan sát đại thể) so với lô chứng sinh lý. Các lô chuột được uống cao metanol và cao nước rễ Xáo tam phân ở liều 10 g/kgP trong vòng 7 ngày trước khi gan bị gây độc và 2 ngày sau khi gan bị gây độc đã làm giảm chỉ số AST, ALT trong huyết thanh, giảm hàm lượng cholesterol toàn phần, giảm khối lượng gan và tổn thương gan so với lô đối chứng bệnh lý. Đặc biệt, lô chuột uống cao 56 metanol 10 g/kgP có tác dụng ngăn cản rõ rệt độc tính của paracetamol đối với gan, tương đương với đối chứng tham khảo (silymarin liều 50 mg/kgP). Nhận xét Cao nước Xáo tam phân ở liều 10 g/kg thể trọng/ngày có tác dụng bảo vệ gan thấp thông qua tác dụng làm giảm nồng độ AST, ALT và hạn chế được một phần tổn thương gan gây ra bởi paracetamol trên mô hình chuột nhắt trắng dòng BALB/c. Cao metanol Xáo tam phân ở liều 10 g/kgP chuột có tác dụng bảo vệ gan tốt gần tương đương so với chất đối chứng tham khảo (silymarin liều 50 mg/kgP) trong thử nghiệm này. Kết quả trên bước đầu làm sáng tỏ tác dụng cây thuốc Xáo tam phân trong việc điều trị bệnh gan. Các cao chiết thân rễ Xáo tam phân đều có tác dụng làm giảm men gan và hạn chế được các tổn thương gan. Do vậy, các cao trên đều được chọn để nghiên cứu về thành phần hóa học, nhằm làm sáng tỏ thành phần hóa học chính có tác dụng bảo vệ gan trong cây Xáo tam phân. Kết quả cụ thể được trình bày ở mục 4.2. 4.2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Xáo tam phân Bằng cách kết hợp các phương pháp sắc ký, tổng cộng có 10 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc từ cao chiết metanol (07) và cao nước (03) có tác dụng bảo vệ gan của rễ loài Xáo tam phân bao gồm: - 4 hợp chất coumarin (PT-1, PT-2, PT-8, PT-9). - 3 hợp chất chromen (PT-3, PT-5, PT-6). - 1 hợp chất alkaloid khung acridone (PT-4) - 1 hợp chất limonoid glucoside (PT-10) - 1 hợp chất ancol (PT-7) Đặc biệt, 07 hợp chất mới được phân lập từ chi Paramignya gồm hợp chất PT-2, PT-5, PT-7 từ cao metanol và hợp chất PT-8, PT-9, PT-10 từ cao nước. O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 57 PT-1 (ostruthin), C19H22O3, 298 PT-2 (ninhvanin) mới, C20H24O4, 328 PT-3 (6-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl- 2H-1-benzopyran), C13H16O2, 203 PT-4 (citrusinine-I), C16H15NO5, 301 PT-5 (paramitrimerol) mới, C14H16O3, 232 PT-6 6-(6-hydroxy-3,7- dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin, C19H22O4, 314 PT-7 (ninhvanin B) mới, C19H22O4, 314 PT-9 (paratrimerin B) mới, C40H44O16, 780 PT-8 (paratrimerin A) mới, C45H52O20, 912 PT-10 (axit parabacunoic) mới, C32H44O13, 636 Hình 4. 1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ thân rễ cây Xáo tam phân 58 4.2.1 Hợp chất PT-1: ostruthin . 6-(3,7-dimethyl-2,6-octadienyl)-7-hydroxy-2H-1-benzopyran-2-one Hợp chất PT-1 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ khối ESI-MS (+) của PT-1 cho pic ion dương [M+H]+ở m/z 299,4, tương ứng với công thức phân tử C19H22O3. Phân tích phổ 13 C-NMR và phổ DEPT của hợp chất PT-1 cho tín hiệu của 19 cacbon, trong đó có 3 nhóm metyl, 3 nhóm metylen, 6 nhóm metin, 6 cacbon không liên kết với hydro và 1 nhóm cacbonyl. Trên phổ 1H-NMR của PT-1 có 2 tín hiệu doublet có hằng số tương tác J = 9,5 Hz ở δH 6,23 (H-3) và 7,65 (H-4), 2 tín hiệu singlet ở δH ở 7,2 (H-5) và 7,8 (H-8), cho thấy đây là một coumarin bị thế ở vị trí C-6 và C-7. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của PT-1 xuất hiện các tín hiệu proton của một mạch nhánh có 3 nhóm vinyl metyl ở δH 1,73 (H-9'), 1.68 (H-8') và 1,60 (H-10'), hai proton metylen δH 2,12 (t, 6Hz, H-5') và 2,10 (t, 6Hz, H-4'), hai triplet của 2 proton olefin ở δH 5,33 (H-2') và 5,10 (H-6'). H-4 7-OH H-5 H-4’ H-5’ H-3 H-2’ H-1’ H-6’ H-8’ H-9’ H-10’ H-8 coumarin 59 Hình 4. 2. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-1 Cấu trúc của mạch nhánh và vị trí các nhóm thế của hợp chất PT-1 được xác định dựa trên phân tích dữ kiện phổ 2 chiều COSY, HSQC, HMBC và NOESY. Phổ HMBC cho thấy tương tác giữa các proton methylen của mạch nhánh ở δH3,39 (H-1')với cacbon C-6 và C-7, C-2'và C-3', giữa proton H-2' với C-6, C-1', C-4' và C- 9' cho phép khẳng mạch định nhánh geranyl (C10) gắn với C-6 của vòng coumarin. Nhóm OH được xác định ở vị trí C-7 do tương tác HMBC giữa H-1' với cacbon C-7 của vòng coumarin ở δC 158,9. O OHO 2 3 45 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 10' 4a 8a Hình 4. 3. Tương tác HMBC của hợp chất PT-1 H-8’ H-9’ H-10’ H-1’ C-2’ C-6 C-3’ C-7 C-9’ C-1’ C-4’ H-2’ Hình. Phổ HMBC của hợp chất PT-1 Kết hợp với các dữ liệu phổ ESI-MS (+), 1H, 13C-NMR, COSY, HSQC, HMBC và NOESY và so sánh tài liệu tham khảo [111], hợp chất PT-1 được xác định là ostruthin. 60 Bảng 4. 7. Số liệu phổ hợp chất PT-1 Vị trí δC (ppm) δH (ppm) CDCl3, 500 MHz δH (ppm)[111] CDCl3, 250MHz HMBC (H→C) 2 162,7 (s) 3 112,0 (d) 6,23 (1H, d, 9,5 Hz) 6,24 (1H, d, 9,5 Hz) C-2, C-10 4 144,5 (d) 7,65 (1H, d, 9,5 Hz) 7,65 (1H, d, 9,5 Hz) C-2, C-5, C-9, C-10 5 128,2 (d) 7,20 (1H, s) 7,20 (1H, s) C-4, C-7, C-9, C-1’ 6 126,1 (s) 7 158,9 (s) 7-OH 7,86 (1H, s) 7,86 (1H, s) 8 103,1 (d) 7,08 (1H, s) 7,01 (1H, s) C-6, C-7, C-9, C-10 9 154,1 (s) 10 112,1 (s) 1’ 28,2 (t) 3,39 (2H, d, 7,5 Hz) 3,340 (2H, d, 7,2 Hz) C-6, C-7, C-2’, C-3’ 2’ 121,0 (d) 5,33 (1H, t, 6,5 Hz) 5,33 (1H, tq, 7,2, 1,2 Hz) C-6, C-1’, C-4’, C-9’ 3’ 138,4 (s) 4’ 39,7 (t) 2,10 (2H) 2,10 (2H, m) C-2’, C-3’, C-5’, C-6’ 5’ 26,5 (t) 2,12 (2H) 2,10 (2H) C-4’, C-6’, C-7’ 6’ 124,0 (d) 5,10 (1H, t, 6,0 Hz) 5,09 (1H, br.t, 6.8 Hz) C-4’, C-5’, C-8’, C-10’ 7’ 131,8 (s) 8’ 25,7 (q) 1,68 (3H, s) 1,60 (3H, s) C-6’, C-7’, C-10’ 9’ 16,2 (q) 1,73 (3H, s) 1,74 (3H, s) C-2’, C-3’, C-4’ 10’ 17,7 (q) 1,60 (3H, s) 1,69 (3H, s) C-6’, C-7’, C-8’ 61 4.2.2 Hợp chất PT-2 (chất mới): ninhvanin 6-(3,7-Dimethyl-2,6-octadienyl)-7-hydroxy-8-methoxy-2H-1-benzopyran-2-one O OHO 2 3 45 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 10' 4a 8a OCH3 Tương tác HMBC của hợp chất PT-2 Hợp chất PT-2 (Phụ lục 1.2) được phân lập dưới dạng bột màu vàng nhạt. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất PT-2 cho công thức phân tử của chất này là C20H24O4 qua pic ion ở m/z 329,17459 [M+H]+. Phân tích dữ liệu phổ một chiều 1H-, 13C-NMR và DEPT của PT-2 cho thấy hợp chất có mạch nhánh geranyl và khung coumarin tương tự như hợp chất PT-1. So với hợp chất PT-1, hợp chất PT-2 có nhiều hơn một nhóm methoxy ở δH3,95 (s, 8-OCH3) và δC 135,1 (C-8) . 62 H-4 H-5 H-3 H-2’ H-6’ OCH3 H-1’ Hình 4. 4. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-2 Trên phổ 13C-NMR của hợp chất PT-2, tín hiệu cacbon của vòng thơm ở δC 135,1 (C-8) chuyển về phía trường thấp hơn so với chất PT-1, đồng thời phổ HMBC của PT-2 có tương tác 8-OCH3/C-8, khẳng định nhóm methoxy được gắn với khung coumarin ở vị trí C-8. Trên phổ HMBC cho phép xác định vị trí mạch mạch nhánh geranyl của hợp chất PT-2 thông qua các tương tác giữa proton methyl H-1'và H-2' với cacbon C-6, giữa H-1'với C-5 và C-7. 63 OCH3 C-6 C-3’ H-2’ H-1’ C-8 C-5, C-2’ C-7 Hình 4. 5. Phổ HMBC của hợp chất PT-2 Kết hợp các dữ liệu phổ ESI-MS (+), HR-ESI-MS (+), 1H, 13C-NMR, HSQC, HMBC, cho phép xác định PT-2 là môt coumarin mới và đặt tên là ninhvanin. Bảng 4. 8 Số liệu phổ hợp chất PT-2 Vị trí δC (ppm) δH (ppm) metanol-d6, 500 MHz HMBC (H→C) 2 163,1 (s) 3 112,0 (d) 6,14 (1H, d, 9,5 Hz) C-2, C-10 4 146,5 (d) 7,74 (1H, d, 9,5 Hz) C-2, C-5, C-8, C-9, C-10 5 123,7 (d) 6,98 (1H, s) C-4, C-7, C-9, C-1’ 6 127,8 (s) 7 153,1 (s) 8 135,1 (s) 8-OCH3 61,80 (q) 3,95 (3H, s) C-8 9 147,5 (s) 10 113,1 (s) 1’ 28,8 (t) 3,31 (2H, d, 7.0 Hz) C-5, C-6, C-7, C-2’, C-3’ 64 2’ 122,8 (d) 5,29 (1H, dt, 1.5, 7.5 Hz) C-6, C-1’, C-4’, C-9’ 3’ 137,7 (s) 4’ 40,8 (t) 2,02 (2H, t, 7.0 Hz) C-2’, C-3’, C-5’, C-6’, C-9’ 5’ 27,6 (t) 2,08 (2H, t, 7.0 Hz) C-3’, C-4’, C-6’, C-7’ 6’ 125,3 (d) 5,07 (1H, m) C-8’, C-10’ 7’ 132,2 (s) 8’ 25,9 (q) 1,63 (3H, s) C-6’, C-7’, C-10’ 9’ 16,2 (q) 1,69 (3H, s) C-2’, C-3’, C-4’ 10’ 17,8 (q) 1,56 (3H, s) C-6’, C-7’, C-8’ 4.2.3 Hợp chất PT-3: 6-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran 6-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran Chất PT-3 (Phụ lục 1.3) được phân lập dưới dạng dầu màu vàng nhạt. Phổ khối ESI-MS (+) có pic ion giả phân tử ở m/z 204,9 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử là C13H16O2.Trên phổ 1H-NMR của PT-3 xuất hiện tín hiệu singlet của 2 nhóm metyl tương đương ở δH 1,41 (6H, H-13, H-14), 2 nhóm metylen ở δH2,74 (2H, t, 6,5 Hz, H-11), 3,77 (2H, t, 7,0 Hz, H-12), 2 proton vinylic ở δH 5,6 (1H, d, 10 Hz, H-3), 6,28 (1H, d, 10 Hz, H-4). Phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu của 3 proton vòng thơm ở δH6,94 (1H, dd, 8,0, 2,0 Hz, H-7), 6,82 (1H, d, 2,0 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, 8,0 Hz, H-8), hằng số tương tác spin-spin J = 2 Hz, J = 8 Hz của các proton này cho phép xác định H-5 ở vị trí meta so với H-7, và H-7/H-8 ở vị trí ortho so với nhau. Phổ 13C-NMR của PT-3 xuất hiện tín hiệu của 13 nguyên tử cacbon tương ứng với 2 nhóm metyl, 2 nhóm metylen, 5 nhóm metin và 4 nhóm cacbon không có liên kết với hydro. Kết hợp các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, MS và so sánh với tài liệu tham khảo [13] cho phép xác định chất PT-3 là 6-(2-hydroxyethyl)-2,2- dimethyl-2H-1-benzopyran. 65 Bảng 4. 9. Số liệu phổ hợp chất PT-3 Vị trí hợp chất PT-3 CDCl3, 500 MHz 6-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl- 2H-1- benzopyran [13] CDCl3, 400 MHz δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) 2 76,0 (s) 76,4 (s) 3 130,9 (d) 5,60 (1H, d, 10,0 Hz) 131,2 (d) 5,62 (1H, d, 9.8 Hz) 4 122,1 (d) 6,28 (1H, d, 10,0 Hz) 122,4 (d) 6,30 (1H, d, 9,8 Hz) 5 126,7 (d) 6,82 (1H, d, 2,0 Hz) 127,0 (d) 6,84 (1H, d, 2,2 Hz) 6 130,6 (s) 130,6 (s) 7 129,3 (d) 6,94 (1H, dd, 8.0, 2,0 Hz) 129,7 (d) 6,96 (1H, dd, 8,2, 2,2 Hz) 8 116,1 (d) 6,70 (1H, d, 8,0 Hz) 116,6 (d) 6,73 (1H, d, 8,1 Hz) 9 151,3 (s) 151,8 (s) 10 121,2 (s) 121,5 (s) 11 38,2 (t) 2.74 (2H, t, 6,5 Hz) 38,6 (t) 2,78 (2H, t, 6,5 Hz) 12 63,4 (t) 3,77 (2H, t, 7,0 Hz) 64,0 (t) 3,83 (2H, td, 6,5, 5,9 Hz) 13 27,8 (q) 1,41 (3H, s) 28,2 (q) 1,43 (3H, s) 14 27,7 (7) 1,41 (3H, s) 28,2 (q) 1,43 (3H, s) 12-OH 1,38 (1H, t, 5,9 Hz) 4.2.4 Hợp chất PT-4: citrusinine-I. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (+) với hai pic ion giả phân tử m/z 302,1072 [M+H]+ và 324,0878 [M+Na]+ cho biết công thức phân tử của PT-4 làC16H15NO5. Trên phổ 13C-NMR của hợp chất PT-4, cho tín hiệu của 16 cacbon, trong đó 4 nhóm metin của hệ vòng thơm C-3 (δC 94,70, d), C-5 (δC 117,10, d), C-7 66 (δC 120,90, d), C-6 (δC123,90, d); 2 nhóm metoxyl 2-OCH3 (δC 56,70, q), 1-OCH3 (δC60,70, q); 1 nhóm N-CH3 (δC 47,0, q); 8 cacbon không có liên kết với hydro và nhóm cacbonyl C-9 (δC 183,8, s). Trên phổ 1H-NMR của hợp chất PT-4 cho thấy các tín hiệu của 3 proton thơm hệ ABX ở δH7,73 (1H, dd, 7,5 Hz; 1,5 Hz, H-5), 7,14 (1H, t, 7,5 Hz, H-6), và 7,19 (1H, dd, 7,5 Hz; 1.5 Hz, H-7), đặc trưng cho các proton thơm của một vòng benzen thế 1,2,3. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu singlet của hai nhóm metoxyl ở δH3,77 (1-OCH3), 3,96 (2-OCH3) và 1 nhóm CH3 liên kết với dị tố Nitơ ở δH3,81 (10-NCH3). Các dữ kiện trên cho phép dự đoán hợp chất PT-4 là một alkaloid N- metylacridone có 4 nhóm thế. Cấu trúc hợp chất PT-4 được chứng minh bởi các dữ kiện phổ hai chiều (HMBC và NOESY). Trên phổ HMBC của hợp chất PT-4 xuất hiện các tương tác giữa singlet proton của nhóm -NCH3 với hai cacbon bậc bốn C- 8a (δC 138,78, s), C-10a (143,57, s) cho phép xác định vị trí 10 của nguyên tử Nitơ trong bộ khung acridone. Phân tích phổ HMBC cho thấy tín hiệu singlet của proton metin thơm ở δH6.42 (H-3) có tương tác với bốn cacbon không liên kết với hydro, bao gồm C-1 (δC 131,50, s), C-2 (161,30, s), C-4 (161,30, s) và C-4a (107,20, s). Hơn nữa, trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa các proton của hai nhóm metoxyl (-OCH3) cho phép xác định hai nhóm thế này có dạng thế vicinal. Kết hợp dữ kiện phổ 1 chiều, 2 chiều, phổ khối lượng và so sánh với tài liệu tham khảo [112], xác định hợp chất PT-4 là citrusinine-I. Hình 19: Tương tác trong phổ HMBC và NOESY của hợp chất PT-4 Bảng 4. 10. Số liệu phổ hợp chất PT-4 Position 13C-NMR [112] CDCl3 + (CD3)SO, 25MHz 13C-NMR metanol-d6, 125 MHz 1H-NMR 1 159,4 161,3 (s) - 67 2 93,5 94,7 (d) 6,42 (s) 3 160,0 161,5(s) - 4 129,8 131,5 (s) - 4a 141,9 143,6 - 5 148,2 149,7 - 6 119,9 120,9 7,19 (dd, 7,5; 1,5) 7 122,5 123,9 7,14 (t, 7,5) 8 115,7 117,1 7,73 (dd, 7,5; 1,5) 8a 124,1 125,6 - 9 181,9 183,8 - 9a 105,8 107,2 - 10 - - - 10a 137,2 143,6 (s) - 4-OCH3 60,0 60,7 (q) 3,77, 3H, s 3-OCH3 56,0 56,7 (q) 3,96, 3H, s 10-NCH3 46,0 47,0 (q) 3,81, 3H, s 4.2.5 Hợp chất PT-5 (chất mới): paramitrimerol Hợp chất PT-5, được phân lập dưới dạng bột màu trắng từ phân đoạn clorofoc. Trên phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion giả phân tử m/z 231,1016 [M − H]− tương ứng với công thức phân tử của hợp chất PT-5 là C14H16O3. Trên phổ13C- NMR/DEPT của PT-5 xuất hiện tín hiệu của 14 carbon, trong đó có một nhóm metyl (δC 23,3, C-13), hai carbon metylene có gắn với oxi ở (δC 63,3, C-11),và (δC 68,5, C-12)], bảy cacbon metine, và bốn cacbon không liên kết với hydro [(δC 80,3, C-2), (δC 122,1, C-4a), (δC 131,0, C-6), và (δC 153,4, C-8a)]. Trên phổ 1H- và 13C- NMR của hợp chất PT-5 xuất hiện các tín hiệu proton và carbon của mạch nhánh 68 3-hydroxy-(E)-prop-1-enyl tại [(δH 6,49, d, J = 16,0 Hz, H-9)/( δC 129,7, C-9); (δH 6,22, dt, J = 5,5, 16,0 Hz, H-10)/( δC 128,7, C-10) và (δH 4,19, ddd, J = 1,5, 5,5, 16,0 Hz, H-11)/( δC 63,3, C-11)]. Cấu trúc mạch nhánh này được khẳng định một lần nữa bằng các tương tác 11-OH/C-11; H-9, H-10/C-6 và H-17/C-9 trên phổ HMBC. Cấu hình của hợp chất PT-5 được xác định bằng tương tác trên phổ NOESY của proton metine H-3 với proton metyl H-13 cho thấy proton H-13 ở vị trí equatorial và hydroxymetyl H-12 ở vị trí axial. Hơn nữa, độ quay cực của PT-5 là [α] 25 D +8,7 (c 0,20, MeOH)] tương tự với hợp chất artemisenol [α] 22 D +4.5 (c 0,87, CHCl3) điều này cho biết cấu hình tại vị trí C-2 là cấu hình 2S [113]. H-8 H-10H-7 H-5 H-9, H-4 H-3 13-CH3 H-11 H-12 11-OH 12-OH Hình 4. 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-5 Hình 4. 7. Tương tác HMBC và NOESY của hợp chất PT-5 Từ các dữ kiện trên cho phép xác định cấu trúc của hợp chất PT-5 là (2S)-6- (3-hydroxy-(E)-prop-1-enyl)-2-methyl-2-hydroxymethylchromene, được đặt tên là paramitrimerol. 69 Bảng 4. 11. Số liệu phổ hợp chất PT-5 C 13C-NMR 1H-NMR HMBC H→C COSY H→H NOESY H→ H 2 80,25, s - - 3 129,04 , d 5,73, 1H, d, 10 Hz 1, 4a, 13 4 4 4 124,40, d 6,47, 1H, d, 3 Hz 1, 4a, 8a 3 3, 13, 5 4a 122,11, s - - - - 5 125,06, d 7,09, 1H, d, 2 Hz 8a - 4 6 131,05, s - - - - 7 127,90, d 7,15,1H, dd, 2; 2,5 Hz 8a 8 7 8 116,88, d 6,66, 1H, d, 8,5 Hz 6, 4a 7 8 8a 153,42 , s - - - - 9 129,71, d 6,49, 1H, d, 9,5 Hz 5, 7 10 10 10 128,72 , d 6,22, 1H, m 6 9, 11 9 11 63,32, t 4,187, 2H, m OHa, 10 10, OHa - 11- OH - 3,87, 1H, t, 11,5 Hz - 11 - 12 68,5, t 3,53-3,63, 2H, m OHb, 13 OHb 13 12- OH - 4,05, 1H, t, 13 Hz - 12 - 13 23,29, q 1,35, 3H, s 1, 12 - 3, 12 70 4.2.6 Hợp chất PT-6: 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin Trên phổ 13C-NMR/DEPT của hợp chất PT-6 xuất hiện tín hiệu của 19 cacbon, trong đó 2 metyl, 4 nhóm metylen, 6 nhóm metin, 6 cacbon không liên kết với hydro và một nhóm cacbonyl. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện hai tín hiệu duplet tương ứng với hai proton của vòng thơm H-4 [δH 7,83 (1H, d, 19 Hz)] và H-3 [δH 6,16 (1H, d, 9 Hz)]. Hai singlet ở δH 6,72 (H-8) và 7,29 (H-5), cho thấy đây là một coumarin thế hai lần ở vị trí C-6 và C-7. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh dạng axiclic tecpen (monotecpen không vòng) được tạo thành từ bộ khung hai đơn vị iso-C5, với tín hiệu hai nhóm metyl CH3-9' (δH 1,72, s), CH3-10' (δH 1,74, s), proton nhóm hydroxylmetin H-6' (δH 4,00, t), hai proton olefin H-8' (δH 4,81-4,90), H-2' (δH 5,38), 3 nhóm metylen với các peak dạng multilet ở δH 1,67 [2H, m, H-4'], 2,09 [2H, m, H-5'], 3,33 [2H, m, H-1']. Trên phổ hai chiều HMBC xuất hiện các tương tác trong vòng coumarin ở H-4/C-2, C-8a, H- 8/ C-4a, C-6, H-5/C-7, C-8a. Vị trí thế 6 và 7 của vòng coumarin được khẳng định nhờ tương tác giữa H-1' (δH 3,33) và C-6, C-7. Mạch nhánh (iso-C5)2 còn cho thấy các tương tác trên phổ hai chiều HMBC ở H-4'/C-9', H-2'/C-9', H-1'/C-3', H-5'/C-3'. Vị trí proton olefin và nhóm hydroxyl hay các nhóm metylen, methyl phù hợp với các tương tác ở H-1'/H-2', H-4'/H-5' (COSY) và H-1'/H-9' (NOESY). So sánh dữ kiện phổ của hợp chất này với các hợp chất đã được công bố [114] chúng tôi kết luận hợp chất PT-6 là 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin, lần đầu tiên được phân lập từ chi Paramignya. Hình 4. 8. Tương tác trong phổ COSY, HMBC, và NOESY của hợp chất PT-6 71 Bảng 4. 12. Số liệu phổ hợp chất PT-6 C 13C-NMR metanol-d6, 125MHz 13C-NMR [114] 1H-NMR HMBC H→C 2 164,00 ,s 162,20 ,s - 3 112,06 ,d 112,3 ,d 6,16 ,1H, d, 9 Hz 2, 4a 4 146,22 ,d 144,1 ,d 7,83 ,1H, d, 19 Hz 2, 8a 4a 112,94 ,s 112,2 ,s - 5 129,48 ,d 128,4 ,d 7,29, 1H, s 7, 8a, 1' 6 127,93 ,s 125,6 ,s - 7 160,88 ,s 158,5 ,s - 8 102,65 ,d 103,1 ,d 6,72 ,1H, s 4a, 8a, 6, 7 8a 155,47 ,s 154,1 ,s - 1' 28,67,t 28,6,t 3,33, 2H, m 6, 7, 3' 2' 123,26 ,d 121,7 ,d 5,38 ,1H, quint 1', 9' 3' 137,5 ,s 137,9 ,s - 4' 34,41,t 32,9,t 1.67, 2H, m 6', 9' 5' 36,80 ,t 35,80 ,t 2,09, 2H, m 3, '4', 6' 6' 76,20 ,d 75,9 ,d 4,00 ,1H, t, 6,5 Hz 3, '4', 8', 10' 7' 148,83 ,s 147,1 ,s - 8' 111,5, t 111,3, t 4.81-4.90 ,2H, dd, 11 Hz, 1,5 Hz 6', 10' 72 9' 16,23, q 16,2, q 1,72, 3H, s 2', 3' 10' 17,30 ,q 17,7 ,q 1,74 ,3H, s 6', 8' 4.2.7 Hợp chất PT-7 (chất mới): ninhvanin B Hợp chất PT-7 có công thức phân tử là C19H22O4 được xác định bằng pic ion giả phân tử m/z 337.1438 [M + Na]+ trên phổ HR-ESI-MS. Trên phổ hồng ngoại (IR) của PT-7 xuất hiện các dải hấp thụ ở 3355 and 1667 cm−1, đặc trưng cho nhóm hydroxyl và carbon nối đôi. Trên phổ1H-NMR xuất hiện cặp tín hiệu đặc trưng của proton olefine dạng cis tại (δH 6.20, d, J = 9.5 Hz, H-3)/( δH 7.56, d, J = 9.5 Hz, H-4), và cặp tín hiệu của proton thế para tại (δH 7.10, s, H-5)/( δH 6.85, s, H-8) đặc trưng của vòng coumarin thế- 6,7. Cấu trúc của vòng counarin thế -6,7 được khẳng định một lần nữa bằng các tương tác HMBC của H-3/C-4a; H-4/C-2, C-5; H-5/C-7, C-8a; H-8/C-4a và C-6 và tương tác COSY giữa proton olefinic H-3 và H-4. H-3 H-4 H-5 H-8 2’-OH 7-OH H-8’ H-2’ H-6’ H-4’ H-5’ H-9’ H-10’ H-1’ 73 Hình 4. 9. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-7 Trên phổ 1H và 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh 2-hydroxy- 7-methyl-3-methyleneoct-6-enyl được đặc trưngbởi hai tín hiệu nhóm gem-methyl tại [(δH 1,62, H-9')/( δC 17,8, C-9'), (δH 1,70, H-10')/( δC 25,7, C-10'), bốn proton metylene (H-1', H-4', H-5', H-8'), một nhóm olefin tại (δH 5.12, H-6')/( δC 123,5, C- 6'), và (δC 132,6, C-7')] và một nhóm metin gắn với oxi tại [(δH 4,45, H-2')/( δC 77,0, C-2')] [115-116]. Cấu trúc mạch nhánh trên được khẳng định thêm nữa bằng các tương tác HMBC của H-9', H-10' và C-6'; H-4'/C-3', C-8'; H-8'/C-2'; và 2'- OH/C-2', và tương tác COSY của các proton H-5'/H-4' và H-6', và H-2'/H-1'. Hơn nữa, trên phổ HMBC xuất hiện các tương tác H-1', H-2' và C-6; H-1' và C-5, cho phép khẳng định cấu trúc dạng ghế tại vị trí C-6. Hình 4. 10. Tương tác COSY, NOESY và HMBC của hợp chất PT-7 Tuy nhiên, do lượng chất ít nên chưa xác định được cấu hình tại vị trí carbon bất đối C-2. Từ các dữ kiện trên, hợp chất PT-7 được xác định là 6-(2-hydroxy-7- methyl-3- methyleneoct-6-enyl)-7-hydroxycoumarin, và được đặt tên là ninhvanin B. Cho đến nay, hợp chất ninhvanin B là hợp chất lần đầu tiên từ tự nhiên được biết đến với cấu trúc vòng coumarin dạng 2-hydroxy-7-methyl-3-methyleneoct-6-enyl. Bảng 4. 13. Số liệu phổ hợp chất PT-7 Vị trí δC (ppm) δH (ppm) HMBC (H→C) COSY (H→H) NOESY (H→H) 2 161,62, s - 3 112,83, d 6,20, d, 9,5 Hz 2, 4a 4 4 74 4 143,35, d 7,56, d, 9,5 Hz 2, 5, 8a 3 3, 5 4a 112,24, s - 5 130,14, d 7,10, s 7, 8a, 1' 4, 1' 6 123,30, s - 5, 1' 7 159,92, s - 7-OH - 9,08, s 8 105,06, d 6,85, s 4a, 6, 7, 8a, 7-OH 8a 154,97, s - 1' 38,07, t 2,93, m 2' 5, 1' 2' 77,02, d 4,45, dd, 2 Hz 6 1' 2' 2'-OH - 2,83, s 2' 9' 3' 149,96, s - 4' 4' 110,51, t 4,94 và 5,01, s 2' 5' 26,47, t 2,17, m 6' 6' 123,48, d 5,12, t, 7 Hz, 5' 7' 132,59, s - 8' 31,92, t 2,07-2,15, m 3' 9' 17,80, q 1,63, s 6', 7', 10' 2'-OH 10' 25,70, q 1,70, s 6', 7', 9' 75 4.2.8 Hợp chất PT-8 (chất mới): paratrimer