Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo (docynia indica (wall.) decne) ở Việt Nam

ủa TM7 trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho các tín hiệu cộng hưởng tương tự với hợp chất naringenin. Cụ thể trên phổ 1H-NMR của hợp chất này xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho 2 proton ghép cặp meta của vòng A tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 6.13 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) và 6.15 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8). Các tín hiệu cộng hưởng của các proton của vòng B có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 7.32 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2’, H-6’) và 6.80 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3’, H-5’). Vòng C xuất hiện tín hiệu cộng hưởng doublet của nhóm oxymethine ở độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 5.50 (1H, dd, J=3.0, 12.5 Hz, H-2) và 1 nhóm methylene (- CH2) có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 2.74 (1H, dd, J=3.0, 17.0 Hz, H-3b) và 3.35 (overlap, H-3b). còn trên phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho tín hiệu của 15 nguyên tử carbon, bao gồm 1 nhóm carbonyl tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) (197.2, C- 4), 6 nhóm methine (-CH) thơm thuộc vòng B và A. 1 tín hiệu oxymethine (-OCH)của vòng C tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 80.5 (C-2). 5 tín hiệu carbon không liên kết với hydro của vòng thơm và 1 nhóm methylene (-CH2) cho tín hiệu cộng hưởng chuyển dịch về phía trường cao tại δC (ppm) 42.1 (C-3). Dựa vào dữ kiện phổ có thể khẳng định phần aglycon của TM17 là naringenin. Trên phổ HMBC cho thấy tương tác của proton anomeric có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) với nguyên tử carbon C (ppm) 165.3 (C-7) chứng tỏ phần đường gắn vào phần aglycon tại vị trí carbon C-7. Trên phổ 13C-NMR 64 cho tín hiệu cộng hưởng của 6 proton tại C (ppm) 60.6 (-CH2), 77.1 (-CH), 69.5 (- CH), 76.3 (-CH), 72.9 (-CH) và 99.6 (-CH) gợi ý đến đường β-D-glucose hoặc β-D- galactose. Tiến hành thủy phân và sử dụng sắc ký lớp mỏng để so sánh, xác định được cấu tử đường là β-D-glucose. Dựa trên các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất TM7 được xác định là naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside [82]. Hình 4.1.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside Bảng 4.1.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM7 và chất tham khảo TT Naringenin-7-O- β-D- glucopyranoside [82] (DMSO-d6) TM7 (DMSO-d6) Vị trí C H (ppm) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 2 5.51 (1H, dd, J= 12.7, 3.0 Hz ) 78.6 5.44 (1H, dd, J= 12.5, 3.0 Hz ) 78.6 3 3.35 (1H, dd, J= 17.1, 12.7 Hz, H-3a) 2.76 (1H, dd, J= 17.1, 3.0 Hz, H-3b ) 42.0 3.35 (overlap, H-3a) 2.74 (1H, dd, J= 17.0, 3.0 Hz, H-3b) 42.1 4 197.2 197.2 5 12.06 (-OH) 162.9 12.04 (-OH) 162.9 6 6.14 (1H, d, J= 2.1 Hz) 96.5 6.13 (1H, d, J=2.0 Hz) 97.5 7 165.3 165.3 8 6.16 (1H, d, J= 2.1 Hz) 95.4 6.15 (1H, d, J=2.0 Hz) 95.4 9 162.7 162.7 10 103.2 103.2 1’ 128.6 128.6 2’ 7.33 (1H, d, J=8.5 Hz) 128.4 7.32 (1H, d, J=8.5 Hz) 128.4 3’ 6.81 (1H, d, J=8.5 Hz) 115.2 6.80 (1H, d, J=8.5 Hz) 115.2 4’ 9.61 (-OH) 157.8 9.59 (-OH) 157.8 5’ 6.81 (1H, d, J=8.5 Hz) 115.2 6.80 (1H, d, J=8.5 Hz) 115.2 6’ 7.33 (1H, d, J=8.5 Hz) 128.4 7.32 (1H, d, J=8.5Hz) 128.4 1’’ 4.97 (1H, d, J= 7.7 Hz) 99.6 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) 99.6 2’’ 3.23 (1H, dd, J=7.7, 9.2 Hz) 72.9 3.23 (1H, m) 72.9 3’’ 3.28 (1H, t, J=9.2 Hz) 76.3 3.27 (1H, t, J=9.2 Hz) 76.3 65 4’’ 3.16 (1H, dd, J=9.2, 9.1 Hz) 69.5 3.16 (1H, m) 69.5 5’’ 3.39 (1H, m) 77.0 3.39 (1H, m) 77.1 6’’ 3.68 (1H, dd, J=11.8, 3.3 Hz, H-6’’a) 3.46 (1H, dd, J=11.8, 5.8 Hz, H-6’’b) 60.5 3.66 (1H, d, J=11.0, H- 6’’a) 3.46 (1H, m, H-6’’b) 60.6 4.1.9. Hợp chất TM30 (2R/S)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D glucopyranosie) Hợp chất TM30 phân lập dưới dạng chất rắn màu vàng. Phổ UV của hợp chất TM30 xuất hiện 3 tín hiệu hấp thụ cực đại tại bước sóng lần lượt là 225, 280 và 320 nm, kết hợp cùng với một số tín hiệu đặc trưng trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân gợi ý TM30 là một flavonoid glycoside. Điều này được minh chứng cụ thể trên phổ 1H- NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho 2 proton ghép cặp meta của vòng A tại độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 6.13 (1H, d, J=2.0, H-6) và 6.14 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8). Về phía trường cao hơn thấy xuất hiện 2 tín hiệu cộng hưởng của vòng B lần lượt tại δH (ppm) 6.75 (2H, br s) và 6.88 (1H, br s), điều này chứng tỏ vòng B bị thế ở 3 vị trí. Kết hợp với phổ HMBC và HSQC có thể xác định vòng B bị thế tại 3 vị trí là C-1’, C3’ và C-5’. Vòng C xuất hiện tín hiệu cộng hưởng doublet của nhóm oxymetin ở độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 5.44 (1H, dt, J= 12.5, 3.5 Hz, H-2) và 1 nhóm methylene (-CH2) có độ chuyển dịch hóa học δH (ppm) 3.23 (1H, m, H-3a) và 2.73 (1H, dd, J= 17.0, 3.0 Hz, H-3b ) Trên phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy sự xuất hiện của 21 tín hiệu carbon, trong đó có 6 tín hiệu carbon của nhóm methine (-CH) có độ chuyển dịch hóa học lần lượt tại C (ppm) 99.6; 72.9; 76.3 ; 69.5 ; 77.1 và 60.5 gợi ý trong phân tử TM30 có 1 cấu tử đường. Trên phổ HMBC xác định được cấu tử đường gắn vào vị trí carbon C-7 của phần aglycon khi xuất hiện sự tương tác của proton anomeri δH (ppm) 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) tương tác với carbon C (165.3 ppm, C-7). Đường này có cấu dạng beta khi hằng số tương tác Janome = 7.5 Hz. Tiến hành thủy phân TM30 và sử dụng sắc ký lớp mỏng, cấu tử đường được xác định là đường β-D-glucose. Trên phổ 13C-NMR, tín hiệu phổ tại nhiều vị trí carbon đều cho thấy sự trùng lặp gần sát nhau của các tín hiệu C-2 (78.70/ 78.66), C-4 (197.14/ 197.11), C-5 (162.89/ 162.86), C-7 (165.25/ 165.16), C-9 (162.71/ 162.66), C-1’’ (129.18/ 129.16). Điều này gợi ý hợp chất TM30 thực chất là 1 cặp đồng phân bất đối quang (R/S) với carbon bất đối C-2. 66 Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu đã được công bố, hợp chất TM30 được khẳng định chính là 1 hỗn hợp đồng phân bất đối quang (2R/S)-5,7,3’,5’- tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D glucopyranosie [83]. Hình 4.1.9. Cấu trúc hóa học của hỗn hợp chất (2S/R)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy- flavanone 7-O-β-D glucopyranosie) Bảng 4.1.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM30 và chất tham khảo Vị trí C (2S/R)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy- flavanone 7-O-β-D glucopyranosie [83] (DMSO-d6) TM30 (DMSO-d6) H (ppm) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 2 5.44 (1H, dd, J= 12.8, 3.2 Hz ) 78.7 5.44 (1H, dt, J= 12.5, 3.5 Hz ) 78.70/ 78.66 3 3.23 (1H, m, H-3a) 2.72 (1H, dd, J= 17.2, 3.2 Hz, H-3b ) 42.1 3.23 (1H, m, H-3a) 2.73 (1H, dd, J= 17.0, 3.0 Hz, H-3b ) 42.13 4 197.2 197.14/ 197.11 5 12.05 (-OH) 162.9 162.89/ 162.86 6 6.13 (1H, d, J= 2.0 Hz) 96.4 6.13 (1H, d, J= 2.0 Hz) 96.39 7 165.2 165.25/ 165.16 8 6.14 (1H, d, J= 2.0 Hz) 95.4 6.14 (1H, d, J= 2.0 Hz) 95.40 9 162.7 162.71/ 162.66 10 103.2 103.23 1’ 129.2 129.18/ 129.16 2’ 6.75 (br s) 118.1 6.75 (br s) 118.04/ 188.05 3’ 9.09 (-OH) 145.8 9.09 (-OH) 145.78/ 145.77 4’ 6.88 (br s) 114.4 6.88 (br s) 114.39 5’ 9.03 (-OH) 145.2 9.03 (-OH) 147.17 67 6’ 6.75 (br s) 115.3 6.75 (br s) 115.31 1’’ 4.97 (1H, d, J= 7.6 Hz) 99.5 4.97 (1H, d, J= 7.5 Hz) 99.57/ 99.45 2’’ 3.13-3.25 (m) 73.0 3.12-3.25 (m) 72.98 3’’ 3.13-3.25 (m) 76.3 3.12-3.25 (m) 76.28 4’’ 3.13-3.25 (m) 69.5 3.12-3.25 (m) 69.47 5’’ 3.13-3.25 (m) 77.0 3.12-3.25 (m) 77.05 6’’ 3.65 (1H, dd, J=10.4, 5.2 Hz, H-6’’a) 3.40 (1H, m, H-6’’b) 60.6 3.66 (1H, d, J=11.5 Hz, H-6’’a) 3.39 (1H, m, H-6’’b) 60.54 4.1.10. Hợp chất TM33 (Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside)) Hợp chất TM33 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phân tích dữ kiện phổ một chiều 1H, 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất TM33 là một chalcone glycoside. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất TM33 xuất hiện tín hiệu của 26 carbon, bao gồm 6 carbon methine thơm (C 94.6-129.1 ppm), 6 carbon methine của đường (C 69.3-103.8 ppm), 2 carbon methylene bão hòa [C-α (C 44.8), và C-β (C 28.9)], 2 carbon methylene của đường (C 65.6 và 67.9), 9 carbon không liên kết hydro của vòng thơm (C 105.6-165.3 ppm), và một nhóm carbonyl (C 205.5 ppm). Tương ứng, phổ 1H-NMR của hợp phần chalcone cho thấy tín hiệu proton của một nhóm phenyl thế hai lần [H (ppm) 6.64 (2H, d, J= 8.5 Hz, H-2, H-6) và 7.02 (2H, d, J= 8.5 Hz, H-3, H-5)], một nhóm phenyl thế bốn lần [H (ppm) 6,19 (1H, d, 2,0 Hz, H-3') và 5,91 (1H, d, 2.0 Hz, H-5')], và cầu nối -CH2-CH2-CO- [H (ppm) 3.35 (overlap, α- CH2), và 2.78 (β-CH2)]. Trong khi đó, tín hiệu đặc trưng ở H 4.89 (1H, d, J= 7.5 Hz), H 4.18 (1H, d, J= 7.5 Hz), và H 3.00-3.96 ppm trong phổ 1H-NMR cho phép xác định hợp phần đường là β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside. Cấu trúc hợp chất TM33 còn được khẳng định bởi dữ kiện phổ hai chiều HSQC và HMBC. Nhân phenyl thế 1,4 xuất hiện các tương tác HMBC đặc trưng H-2, H-3, H-4, H-5, và H-6/C-4, nhân phenyl thế 1,2,4,6 cho các tương tác HMBC như H-3'/C-1', C-2', C-4', và C-5', và H-5'/C-1', C-4', và C-6'. Hai nhân phenyl liên kết qua cầu nối (- CH2CH2CO-). Tương tác H-6''/C-1''' trên phổ HMBC còn cho phép xác định tương tác giữa hai đơn vị đường xylopyranosyl và glucopyranosyl theo kiểu liên kết 16. Hợp phần glucopyranosyl liên kết trực tiếp với carbon C-2' được khẳng định bởi tương tác HMBC H-1''/C-2'. Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố [84], hợp chất TM33 được xác định là một chalcone glycoside có tên là phloretin-2’-O-(β-D- xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside. 68 Hình 4.1.10. Cấu trúc hóa học hợp chất phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O- β-D glucopyranoside Bảng 4.1.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM33 và chất tham khảo TT Phloretin-2’-O-(β-D- xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside [84] (DMSO-d6) TM33 (DMSO-d6) Vị trí C H (ppm) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 1 131.6 131.5 2 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 129.2 7.02 (1H, d, J= 8.5 Hz) 129.1 3 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 115.0 6.64 (1H, d, J= 8.5 Hz) 114.9 4 155.3 155.2 5 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 115.0 6.64 (1H, d, J= 8.5 Hz) 114.9 6 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 129.2 7.02 (1H, d, J= 8.5 Hz) 129.1 1’ 105.3 105.1 2’ 160.8 160.7 3’ 6.2 (1H, d, J= 1.9 Hz) 94.6 6.19 (1H, d, J= 2.0 Hz) 94.6 4’ 165.3 165.3 5’ 5.93 (1H, d, J= 1.9 Hz) 96.9 5.91 (1H, d, J= 2.0 Hz) 96.9 6’ 164.4 164.2 7’ 204.7 204.5 α 3.35 (2H, m) 44.9 3.35 (overlap) 44.8 β 2.78 (2H, t, J= 7.2 Hz) 28.95 2.78 (2H, t, J= 7.0 Hz) 28.9 1’’ 4.89 (1H, d, J= 7.0 Hz) 101.1 4.89 (1H, d, J= 7.5 Hz) 100.9 2’’ 3.30 (m) 73.2 3.30 (overlap) 73.1 3’’ 3.30 (m) 76.6 3.30 (overlap) 76.6 4’’ 3.30 (m) 69.4 3.30 (overlap) 69.3 5’’ 3.55 (m) 76.0 3.54 (m) 75.9 6’’ 3.6 (1H, m, H-6’’a) 3.96 (1H, d, J= 1.1 Hz, H- 6’’b) 68.1 3.61 (1H, m, H-6’’a) 3.96 (1H, d, J= 1.0 Hz, H- 6’’b) 67.9 1’’’ 4.18 (1H, d, J= 7.3 Hz) 103.9 4.18 (1H, d, J= 7.5 Hz) 103.8 2’’’ 3.00 (m) 73.4 2.76 - 3.12 (m) 73.4 3’’’ 3.15 (m) 76.3 3.14 - 3.16 (m) 76.3 4’’’ 3.28 (m) 69.6 3.26 3.28 (overlap) 69.5 5’’’ 3.00 (1H, m, H-5’’’a) 3.7 (1H, m, H-5’’’b) 65.6 3.00 (1H, m, H-5’’’a) 3.69 (1H, m, H-5’’’b) 65.6 69 4.1.11. Hợp chất TM8 (phlorizin) Hợp chất TM8 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 106 – 1080C. Phân tích dữ kiện phổ một chiều 1H, 13C-NMR và DEPT cho thấy hợp chất TM8 là một chalcone glycoside. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất TM8 xuất hiện tín hiệu của 21 carbon bao gồm 6 carbon methine thơm (C 95.4-130.4 ppm), 5 carbon methine của đường (C 71.0-102.0 ppm), 2 carbon methylene bão hòa [C-α (C 46.9), và C-β (C 30.7)], 1 carbon methylene của đường (C 62.4 ppm), 6 carbon bậc không liên kết với hydro của vòng thơm (C 106.8-167.6 ppm), và một nhóm carbonyl (C 206.7 ppm). Các dữ kiện phổ này cho thấy có sự tương đồng với dữ kiện phổ của hợp chất TM33. Tuy nhiên, hợp chất TM8 có số ít hơn 5 nguyên tử carbon so với hợp chất TM33, gợi ý cho ta hợp chất TM8 chỉ có 1 phân tử đường glucose gắn vào khung chalcone. Điều này một lần nữa được khẳng định khi trên phổ HMBC chỉ xuất hiện 1 tín hiệu proton anomeric H ppm 4.94 (overlap) tương tác với nguyên tử carbon C-2’ (C 162.4 ppm). Trên phổ proton 1H-NMR của hợp chất TM8 cũng cho các tín hiệu cộng hưởng tương đương với tín hiệu cộng hưởng của hợp chất TM33. Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo được công bố, hợp chất TM8 được xác định là Phloretin-2’-O-β-D glucopyranoside (phlorizin) [84]. Hình 4.1.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất phlorizin Bảng 4.1.11. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM8 và chất tham khảo TT Phlorizin [84] (DMSO-d6) TM8 (DMSO-d6) Vị trí C H (ppm) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 1 131.5 133.9 2 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 129.1 7.01 (1H, d, J= 8.5 Hz) 130.4 3 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 114.9 6.63 (1H, d, J= 8.5 Hz) 116.1 4 155.2 156.4 5 6.64 (1H, d, J= 8.4 Hz) 114.9 6.63 (1H, d, J= 8.5 Hz) 116.1 6 7.03 (1H, d, J= 8.4 Hz) 129.1 7.01 (1H, d, J= 8.5 Hz) 130.4 1’ 105.1 106.8 2’ 160.8 162.4 3’ 6.13 (1H, d, J= 2.1 Hz) 94.3 6.12 (1H, d, J= 2.2 Hz) 95.4 4’ 165.3 167.6 5’ 5.93 (1H, d, J= 2.1 Hz) 96.8 5.90 (1H, d, J= 2.2 Hz) 98.4 6’ 164.4 165.9 70 7’ 204.7 206.7 α 3.2 – 3.73 (2H, m) 44.9 3.2 – 3.8 (2H, m) 46.9 β 2.79 (2H, t, J= 7.3 Hz) 28.9 2.82 (2H, t, J= 7.5 Hz) 30.7 1’’ 4.93 (1H, d, J= 7.3 Hz) 100.8 4.94 (overlap) 102.0 2’’ 4.58 – 5.27 (m) 73.2 4.6 – 5.0 (overlap) 74.7 3’’ 4.58 – 5.27 (m) 76.7 4.6 – 5.0 (overlap) 78.4 4’’ 4.58 – 5.27 (m) 69.4 4.7 – 5.0 (overlap) 71.0 5’’ 4.58 – 5.27 (m) 77.2 4.7 – 5.0 (overlap) 78.4 6’’ 3.2 – 3.73 (m) 60.5 3.2 – 3.8 (m) 62.4 4.1.12. Hợp chất TM37 (2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone) Hợp chất TM37 phân lập được ở dạng tinh thể hình kim màu đỏ cam, điểm nóng chảy ở ở 121-1230C. Trên phổ 13C-NMR xuất hiện 17 tín hiệu cộng hưởng của 17 nguyên tử carbon. Trong đó có 12 tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển dịch hóa học nằm trong vùng thơm (δC 100 – 160 ppm), điều này gợi ý cấu trúc hóa học của hợp chất TM37 có 2 vòng thơm, 2 cặp tín hiệu cộng hưởng tại δC 130.4 và 129.3 ppm, chứng tỏ có 2 cặp nguyên tử carbon tương đương. Trên phổ DEPT cho thấy, có 2 nhóm oxymethyl (-OCH3) tại δC 60.9 và 56.5 ppm, 7 carbon không liên kết với hydro trong đó có 1 nhóm carbonyl tại δC 194.4 ppm, 8 nhóm methine (-CH). Trên phổ 1H-NMR thấy xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 4 proton chia làm 2 cặp tương đương nhau có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 7.64 – 7.66 (2H, m, H- 2,H-6) và 7.41 – 7.45 (2H, m, H-3, H-5). Một tín hiệu singlet tại δH (ppm) 6.01 (1H, s, H-5’) gợi ý vòng A bị thế ở 5 vị trí. Đặc biệt trên phổ 1H-NMR có sự tương tác của 1 cặp proton có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 7.92 (1H, d, J= 16.0 Hz) và 7.73 (1H, d, J= 16.0 Hz) gợi ý cho ta 1 cầu nối 2 vòng thơm có dạng trans vinyl (α, β – keton không no). Kết hợp với phổ HSQC và HMBC có thể xác định vị trí C- α và C- β ứng với độ chuyển dịch hóa học là δH (ppm) 7.92 (1H, d, J= 16.0 Hz, H- α) và 7.73 (1H, d, J= 16.0 Hz, H- β). Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất TM37 được xác định là 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone [85]. Hình 4.1.12. Cấu trúc hợp chất 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone 71 Bảng 4.1.12. Dữ liệu phổ của hợp chất TM37 và chất tham khảo TT 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone [85] (CDCl3) TM37 (CD3OD-d4) Vị trí C δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 135.6 - 136.8 2 7.35 – 7.65 (1H, m) 128.8 7.64 – 7.66 (1H, m) 130.4 3 7.35 – 7.65 (1H, m) 128.5 7.41 – 7.45 (1H, m) 129.3 4 7.35 – 7.65 (1H, m) 126.9 7.41 – 7.45 (1H, m) 131.2 5 7.35 – 7.65 (1H, m) 128.5 7.41 – 7.45 (1H, m) 129.3 6 7.35 – 7.65 (1H, m) 128.8 7.64 – 7.66 (1H, m) 130.4 1’ 104.4 - 106.9 2’ 151.0 - 158.7 3’ 128.1 - 130.0 4’ 163.1 - 160.5 5’ 6.36 (1H, s) 92.9 6.09 (1H, s) 92.2 6’ 158.4 - 160.2 α 7.9 (1H, d, J= 16.0 Hz) 130.2 7.92 (1H, d, J= 16.0 Hz) 128.8 β 7.81 (1H, d, J= 16.0 Hz) 143.3 7.73 (1H, d, J= 16.0 Hz) 143.2 7’ 192.4 - 194.4 MeO-3’ 3.93 (3H, s) 61.4 3.92 (3H, s) 60.9 MeO-4’ 3.96 (3H, s) 55.9 3.80 (3H, s) 56.5 4.1.13. Hợp chất TM24 (ursolic acid) Hợp chất TM24 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở 279 – 2810C Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 30 nguyên tử carbon đặc trưng của 1 triterpenoid, bao gồm 7 nhóm methyl (-CH3), 9 nhóm methylene (-CH2), 7 nhóm methine (-CH) và 7 carbon không liên kết với hydro. trong đó có 1 tín hiệu đặc trưng của carbon carboxyl tại độ chuyển dịch hóa học δC 180.04 ppm và 2 carbon olefin tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 126.1 và 139.7. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 proton olefine có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 5.52 (1H, br s), sáu tín hiệu của nhóm methyl lần lượt 1.27 (3H, s); 1.01 (3H, s); 0.91 (3H, s); 1.03 (3H, s); 1.25 (3H, s); 0.99 (3H, br s) và 0.91 (3H, br s) cùng với 1 proton của 1 nhóm oxymethine tại δH (ppm) 3.49 (1H, m). Từ dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR gợi ý hợp chất TM24 là một triterpene acid có cấu trúc khung ursan. 72 Trên phổ HMBC, các tương tác giữa H-24 (δH 1.01) với C-3 (δC 78.6), C4 (δC 39.8) và C-5 (δC 56.3) đã chứng minh nhóm hydroxy liên kết với C-3. Các tương tác giữa H-27 (δH 1.25) với C-8 (δC 40.4), C-13 (δC 139.7), C-14 (δC 43.0) và C-15 (δC 29.2); Giữa H-12 (δH 5.52) với C-9 (δC 48.5), C-14 (δC 43.0) và C-18 (δC 54.0) đã khẳng định liên kết đôi tại vị trí C-12 và C-13. Từ những dữ kiện phổ kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất TM24 được xác định chính là ursolic acid [86]. Hình 4.1.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất ursolic acid Bảng 4.1.13. Dữ liệu phổ của hợp chất TM24 và chất tham khảo Vị trí C Ursolic acid [86] (pyridin-d5) Chất TM24 (pyrindin-d5) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 39.8 38.6 2 28.6 28.2 3 3.48 (1H, dd, J = 9.5, 6.5 Hz) 78.6 3.49 (1H, m) 78.6 4 39.5 39.8 5 56.3 56.3 6 19.2 19.2 7 34.0 34.0 8 40.4 40.4 9 48.2 48.5 10 37.7 37.8 11 24.1 23.3 12 5.52 (1H, br s) 126.1 5.52 (1H, br s) 126.1 13 139.7 139.7 14 43.0 43.0 15 1.23 (1H, m, H-15a) 2.35 (1H, dt, J= 4.3, 11.5 Hz, H-15b) 29.1 1.2 (1H, m, H-15a) 2.33 (1H, t, H-15b) 29.2 16 25.4 25.4 73 17 48.1 48.5 18 2.67 (1H, d, J= 11.6 Hz) 54.0 2.66 (1H, d, J= 11.0 Hz) 54.0 19 39.9 39.9 20 39.9 39.8 21 31.5 31.5 22 37.8 37.9 23 1.28 (3H, s) 29.3 1.27 (3H, s) 29.3 24 1.05 (3H, s) 17.0 1.01 (3H, s) 17.0 25 0.92 (3H, s) 16.1 0.91 (3H, s) 16.1 26 1.08 (3H, s) 17.5 1.03 (3H, s) 17.9 27 1.27 (3H, s) 24.1 1.25 (3H, s) 24.4 28 180.0 180.04 29 1.03 (3H, d, J= 7.6 Hz) 18.0 0.99 (3H, d, J= 7.5 Hz) 18.0 30 0.98 (3H, d, J= 7.6 Hz) 21.9 0.91 (3H, d, J= 7.5 Hz) 21.9 4.1.14. Hợp chất TM23 (23-hydroxy ursolic acid) Hợp chất TM23 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 280 – 2820C. Các dữ kiện phổ 13C-NMR và 1H-NMR cho thấy có sự tương đồng về cấu trúc hóa học giữa hợp chất TM23 và TM24 (ursolic acid). Trên phổ 13C-NMR của TM23 cho tín hiệu cộng hưởng của 30 nguyên tử carbon đặc trưng của 1 triterpenoid. Trong đó có 6 nhóm methyl (-CH3), 9 nhóm methylene (-CH2), 8 nhóm methine (-CH) và 7 carbon không liên kết với hydro trong đó có 1 tín hiệu đặc trưng của carbon carboxyl tại độ chuyển dịch hóa học δC 180 ppm và 2 carbon olefin tại độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 126.1 và 139.7. Trên phổ 1H-NMR cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 1 proton olefin có độ chuyển dịch hóa học tại δH (ppm) 5.51 (1H, br s), tuy nhiên chỉ có sáu tín hiệu của nhóm methyl lần lượt 1.07 (3H, s); 0.97 (3H, s); 1.06 (3H, s); 1.16 (3H, s); 0.97 (3H, br s) và 0.95 (3H, br s) chứng tỏ 1 nhóm methyl đã bị thế bới 1 nhóm thế khác. Trên phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu cộng hưởng của 3 proton oxymethine tại δH (ppm) 4.21 (1H, m, H-3), 4.21 (1H, d, H-23a) và 3.74 (1H, d, H-23b). Từ dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR gợi ý hợp chất TM23 cũng là một triterpene acid có cấu trúc khung ursan và tại vị trí C-23, một proton đã bị thay thế bởi 1 nhóm hydroxyl. Phổ HMBC của TM23 cũng cho thấy các tương tác tương đồng với hợp chất TM24 (ursolic acid) Từ các dữ kiện phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất TM23 được xác định có tên là 23-hydroxy ursolic acid [87]. 74 Hình 4.1.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất 23-hydroxyursolic acid Bảng 4.1.14. Dữ liệu phổ của hợp chất TM23 và chất tham khảo Vị trí C 23-hydroxyursolic acid [87] (DMSO-d6) Chất TM23 (pyridin-d5) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 38.4 39.9 2 27.2 28.2 3 4.22 (1H, dd, J= 9.6, 6.0 Hz) 78.0 4.21 (1H, m) 73.9 4 42.4 43.4 5 48.0 49.0 6 18.1 19.0 7 30.6 30.6 8 39.5 40.5 9 47.5 48.5 10 36.6 37.6 11 23.2 24.1 12 5.48 (1H, s) 124.5 5.51 (1H, s) 126.1 13 138.4 139.7 14 42.0 43.0 15 2.35 (1H, t, H-15b) 28.2 2.33 (1H, t, H-15b) 28.2 16 24.5 24.4 17 47.5 48.5 18 2.67 (1H, d, J= 11.6 Hz) 53.1 2.64 (1H, J= 11.5 Hz) 53.1 19 39.0 39.9 20 38.9 39.2 21 37.0 37.6 22 32.8 33.7 23 4.18 (1H, d, J= 10.4 Hz, H-23a) 3.72 (1H, d, J= 10.4 Hz, H-23b) 64.6 4.21 (1H, d, H-23a) 3.74 (1H, d, H-23b) 68.3 24 1.04 (3H, s) 12.7 1.07 (3H, s) 13.6 75 25 0.96 (3H, s) 15.7 0.97 (3H, s) 16.6 26 1.06 (3H, s) 17.1 1.06 (3H, s) 18.0 27 1.17 (3H, s) 23.4 1.16 (3H, s) 24.1 28 178.5 180.0 29 0.98 (3H, d, J= 6.4 Hz) 17.1 0.97 (3H, d, J= 6.5 Hz) 18.0 30 0.92 (3H, d, J= 6.4 Hz) 20.9 0.95 (3H, d, J= 6.5 Hz) 21.9 4.1.15. Hợp chất TM20 (pomolic acid) Hợp chất TM20 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng. Điểm nóng chảy ở 301 - 3030C Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất TM20 cho các tín hiệu tương đồng với hợp chất TM24 (ursolic acid), chứng tỏ hợp chất này có bộ khung tương tự với cấu trúc của ursolic acid. Tuy nhiên dữ kiện phổ của hợp chất TM20 cũng có một số điểm khác với hợp chất TM24 cụ thể như trên phổ 13C-NMR xuất hiện thêm tín hiệu của 1 carbon không liên kết với hydro thay thế cho 1 tín hiệu của carbon nhóm methine có độ chuyển dịch hóa học δC 72.7 ppm, chứng tỏ đã có 1 nhóm hydroxyl đã thay thế 1 proton ở vị trí này. Vị trí carbon này chính là C-19, điều này đã được chứng minh bằng phổ 2 chiều HMBC qua các tương tác H-29 (δC 1.28) và C-18 (δC 53.2), C-19 (δC 71.7) và C- 20 (δC 41.4). Từ các dữ liệu phổ kết hợp với tài liệu tham khảo đã được công bố, hợp chất TM20 được xác định có tên là pomolic acid [88]. Hình 4.1.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất pomolic acid Bảng 4.1.15. Dữ liệu phổ của hợp chất TM20 và chất tham khảo Vị trí C Pomolic acid [88] (Pyridine-d5 ) Chất TM20 (CD3OD+CDCl3) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 39.4 39.3 2 28.1 28.0 3 3.44 (1H, dd, J= 10.8, 5.5 Hz) 78.2 3.40 (1H, dd, J=10.5, 5.0 Hz) 78.2 4 39.4 39.4 76 5 55.8 55.9 6 18.5 18.9 7 33.4 33.6 8 40.1 40.3 9 47.9 47.8 10 37.5 37.3 11 24.0 24.0 12 5.4 (1H, m) 128.0 5.34 (1H, m) 128.5 13 140.0 138.5 14 42.1 42.1 15 29.2 29.3 16 3.10 (1H, td, J = 12.6, 4.4 Hz) 26.4 3.12 (1H, td, J=12.8, 4.4 Hz) 26.4 17 48.2 48.4 18 3.06 (1H, s) 54.5 3.02 (1H, s) 54.6 19 5.09 (1H, s. –OH) 71.8 5.12 (1H, s, -OH) 72.7 20 42.0 42.4 21 26.6 26.9 22 37.0 37.3 23 1.20 (3H, s) 28.8 1.22 (3H, s) 28.8 24 1.01 (3H, s) 16.4 1.01 (3H, s) 16.8 25 0.91 (3H, s) 16.5 0.9 (3H, s) 16.5 26 1.1 (3H, s) 17.2 1.11 (3H, s) 17.4 27 1,72 (3H, s) 24.8 1.70 (3H, s) 24.7 28 180.0 180.8 29 1,44 (3H, s) 27.2 1.42 (3H, s) 27.1 30 1,1 (3H, d, J = 6.4 Hz) 16.5 1.09 (3H, d, J= 6.5 Hz) 16.0 4.1.16. Hợp chất TM22 (euscaphic acid) Hợp chất TM22 phân lập được ở dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy ở 278 – 2800C Cũng giống như TM20, hợp chất TM22 cũng có các tín hiệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR tương tự như hợp chất TM24 (ursolic acid). Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 1 tín hiệu proton olefin tại δH (ppm) 5.12 (1H, br s) và bảy nhóm methyl lần lượt 1.04 (3H, s); 0.69 (3H, s); 0.82 (3H, s); 1.97 (3H, s); 1.45 (3H, s); 1.28 (3H, br s) và 0.98 (3H, br s). Trên phổ 13C-NMR cũng chỉ ra tín hiệu của 30 nguyên tử carbon trong đó có 1 carbon carboxyl δC 179.2 ppm, 2 carbon olefin C-12 và C-13 được xác định qua các tương tác trên phổ 2 chiều HMBC có độ chuyển dịch hóa học lần lượt tại δC (ppm) 126.9 và 138.8. Đây cũng là 1 triterpen acid khung ursan. Tuy nhiên so với hợp chất TM24, hợp chất TM22 xuất hiện thêm 2 nhóm thế hydroxyl tại các vị trí là C-19 và C- 2. Vị trí nhóm thế hydroxyl tại C-19 được thể hiện trên phổ HMBC qua các tương tác 77 H-29 (δC 1.28) và C-18 (δC 53.2), C-19 (δC 71.7) và C-20 (δC 41.4). Vị trí nhóm thế hydroxyl tại C-2 được thể hiện trên phổ HMBC qua các tương tác H-1 (δH 1.28) H-3 (δH 3.75) và C-2 (δC 64.9). Từ các dữ liệu phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố, hợp chất TM22 được xác định có tên là euscaphic acid [89]. Hình 4.1.16. Cấu trúc hóa học hợp cất euscaphic acid Bảng 4.1.16. Dữ liệu phổ của hợp chất TM22 và chất tham khảo Vị trí C Euscaphic acid (pyridin-d5) [89] Chất TM22 (CD3OD) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 42.0 40.2 2 4,27 (1H, dt, J= 1