Luận án Nghiên cứu thành phần Lipid và hoạt tính chống oxi hóa một số hạt thực vật họ đậu (Fabaceae) ở Việt Nam

ứng của chúng đối với HOO được xem xét. Năng lượng tự do Gibbs của phản ứng ( rG 0 ), năng lượng tự do Gibbs hoạt hóa ( r G # ) cũng được tính toán và bằng giá trị chênh lệch giữa tổng năng lượng của các sản phẩm và năng lượng của trạng thái chuyển tiếp so với tổng năng lượng của các chất phản ứng. Động học của các phản ứng trong pha khí và dung môi cũng được tính toán dựa trên cơ học lượng tử đối với khả năng quét gốc tự do (QM- ORSA) [98]. Tất cả các tính toán hằng số tốc độ được khảo sát bằng cách sử dụng phần mềm tính toán Eyringpy [99]. 53 Chương 3 THỰC NGHIỆM Các mẫu hạt họ Đậu được tiến hành theo sơ đồ sau: Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu chung 3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng các mẫu hạt họ Đậu Lấy 100 gam mẫu hạt đã được sấy khô, đem nghiền nhỏ trong máy nghiền bi và sau đó chiết bằng 150 ml n-hexan (chiết 2 lần) trong thiết bị đun nóng có hồi lưu chuyên dụng (Twisselman apparatus) ở nhiệt độ dưới 500C trong 6 giờ. Dịch chiết thu được đem cô cất loại dung môi trên máy quay cất chân không ở 400C và áp suất 25 tor [81]. Phần bã sau khi tách dung môi được chiết với MeOH thu được cặn MeOH, gộp cặn chiết hexan và MeOH thu được lipid tổng. Lipid tổng của hạt sau khi cân trên cân phân tích Sartorius analytic (10-4) và được tính toán theo % khối lượng so với mẫu hạt khô ban đầu (mỗi mẫu cân 3 lần, lấy giá trị trung bình). Lipid được bảo quản ở nhiệt độ -100C trong tủ lạnh sâu Panasonic MDF-U334-PE. 54 3.2. Xác định thành phần lipid trong các mẫu hạt họ Đậu 3.2.1. Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong các mẫu hạt họ Đậu Lipid tổng sau khi loại bỏ hết dung môi bằng khí argon, được hòa tan trong CHCl3 (10mg/mL) trước khi đem chấm lên bản mỏng tráng sẵn Sorbfil (6cm x 6cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga) với ba nồng độ tăng dần. Hệ dung môi triển khai thứ nhất là n-hexane/dietylether/acid acetic (85:15:1, v:v:v) để nhận biết các lớp lipid trung tính và hệ dung môi thứ hai là CHCl3/CH3OH (2:1, v:v) để nhận biết lớp lipid phân cực. Bản mỏng sau triển khai được hiện hình với thuốc thử H2SO4 10%/CH3OH và sấy ở nhiệt độ 1000C trong 10 phút. Sử dụng máy scan Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản) với độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn. Các lớp chất lipid trên bản mỏng và hàm lượng các lớp chất được nhận diện bằng độ nhạy sáng trên phần mềm phân tích Sorbfil TLC Videodensitometherr, Krasnodar, Nga. 3.2.2. Xác định thành phần và hàm lượng acid béo trong các mẫu hạt họ Đậu Lấy 100 mg lipid tổng hòa tan trong 1 mL n-hexane sau đó bổ sung 50 µL MeONa/MeOH1%, lắc kỹ trong một phút, thêm 100 µL H2O vào đem ly tâm chế độ 5000 V/phút, bổ sung 50 µL HCl 0,1N. Phần dịch dưới loại bỏ, phần dịch trên được làm khan bởi Na2SO4. Chuyển mẫu lipid tổng đã ở dạng methyl este sang ống mẫu để phân tích trên máy sắc ký khí của hãng Hewlett Packard instrument Model 5890 Series II. Các cấu trúc acid béo được xác định bằng GC-MS. Các phổ được so sánh với thư viện NIST và kho lưu trữ khối phổ acid béo. Nhận dạng các acid béo bằng phần mềm chuyên dụng tính toán chuyển đổi qua giá trị thời gian lưu tương đương ELC (Equivalent Chain- lengths of methyl ester derivaties of fatty acids) cho cột mao quản chuyên dụng CP-Sil 88, có sử dụng hệ chất chuẩn C16:0, C18:0 trên máy C-R3A theo công thức sau: 3.2.3. Xác định thành phần và hàm lượng tocopherol Hòa tan 70 mg-100 mg lipid tổng trong 100 µL n-hexane sau đó lấy 20 µL ra và đem phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC hãng Merck-Hitachi F-1000 55 Fluorescence Spectrophotometherr, 295/330 nm, D-2500. Mẫu được bơm tự động trong buồng bơm mẫu tự động Merck 655-A40, cột 25 cm x 4,6 mm ID, tốc độ: 1,3 mL/phút, hệ pha động: heptane/tert-buthyl methylether (99+1,v/v), Chromato integrator, hệ dung môi chạy heptane/tert-buthyl methylether (99:1,v/v). 3.2.4. Xác định thành phần và hàm lượng phytosterol Cân 150 mg lipid tổng, sau đó hòa tan trong 100 mL ethanol, xà phòng hóa bằng dung dịch kali hydroxide ở 70oC. Các phytosterol được phân lập khi đi qua cột nhôm oxit (Merck, Darmstadt, Đức) khi đó acid béo đươc̣ giữ lại. Phần phytosterol được tách ra từ cột được tinh chế lại bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Merck, Darmstadt, Đức) và sau đó hàm lượng và thành phần của sterol được xác định bởi GLC sử dụng betulin là chất chuẩn nội. Các hợp chất được tách ra trên cột SE 54 CB (dài 50 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày lớp phim 0,25μm) (Macherey- Nagel, Duren, Đức). Các đỉnh (peak) được xác định bằng các chất chuẩn (β- sitosterol, campesterol, stigmasterol) và bằng một hỗn hợp các sterol được phân lập từ lipid hạt cải (brassicasterol) hoặc từ lipid hạt hướng dương (Δ7-avenasterol, Δ7- stigmasterol, Δ7-campesterol). Tất cả sterol sau đó được xác định bằng cách so sánh thời gian lưu của các chất chuẩn. 3.2.5. Xác định thành phần và hàm lượng triacylglycerol. Cân 0,1 g lipid tổng, hòa tan vào 2 mL acetone và lọc qua ống tiêm kích thước lỗ 0,45 µm. 20 µL lipid tổng sau khi lọc được trực tiếp bơm tự động vào hệ thống HPLC Thermo Finnigan điều chỉnh nhiệt độ cột (Spectra System AS3000), sử dụng chất chuẩn triglyceride. 3.2.6. Xác định thành phần và hàm lượng phenolic tổng Lipid tổng được hòa tan trong MeOH, được lọc bằng màng lọc 0,45 µm, sau đó được bơm vào với thể tích 20 µL. Việc xác định các pic được thực hiện bằng cách so sánh các quan sát ở bước sóng 280 nm, đỉnh được xác định bởi thời gian lưu đồng nhất so với tiêu chuẩn. Phân tích đã được thực hiện trong ba lần. Định lượng các hợp chất phenolic đã đạt được bằng cách sử dụng một lượng acid trans-2-hydroxycinnamic đã biết làm chất chuẩn nội. 56 3.3. Phân lập và nhận dạng các phospholipid Việc phân tích các dạng phân tử lipid phân cực là một bài toán phức hợp cần phải giải quyết bằng nhiều phương pháp, trong đó phương pháp phổ khối lượng là một phương pháp quan trọng để phân tích cấu trúc lipid trong một hỗn hợp. Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC-HRMS) trên thiết bị LC/MS- IT-TOF để nghiên cứu. Ở Việt Nam chưa có nhóm nào tiến hành nghiên cứu theo hướng này. Thực nghiệm tại Phòng Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và Viện Sinh vật biển, Phân Viện Viễn đông, Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga. 3.3.1. Xác định thành phần, hàm lượng các lớp chất phospholipid Lipid tổng được hòa tan trong MeOH, và tiến hành phân tích. Sau khi chạy xong hệ dung môi A,B (Hệ A:CHCl3:MeOH:28%NH4OH (70:30:5, v:v:v), hệ B: CHCl3:MeOH:(CH3)2CO:CH3COOH:H2O (70:30:5:5:2, v:v:v:v:v).). Hiện màu bằng H2SO4/MeOH 10% hơ nóng trên bếp sấy. Xác định vị trí các lớp chất rồi cạo ra cho vào các ống nghiệm đã đánh dấu tương ứng, thêm 50 μL HClO4 rồi đun trên bếp ở nhiệt độ 180-1900C trong 20 phút. Lấy các ống nghiệm ra để nguội, thêm tiếp vào mỗi ống nghiệm 450 μL amonium molybdate, lắc kĩ, đun cách thủy ở nhiệt độ sôi của H2O trong 15 phút. Lấy ra, để nguội rồi tiến hành đo trên máy quang phổ kế UV 1800 (Shimardzu, Nhật Bản). Tiến hành đo 3 lần và lấy giá trị trung bình hàm lượng các lớp chất, tính hàm lượng phần trăm. 3.3.2. Xác định các dạng phân tử các phospholipid của lipid hạt Sưa Lipid tổng được hòa tan trong MeOH, và tiến hành phân tích dạng phân tử trên thiết bị LCMS- IT- TOF. Sau khi bơm mẫu, các lớp lipid được tách riêng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu Prominence với hai máy bơm LC-20AD, mô-đun tạo áp suất cao, lò cột CTO-20A, máy lấy mẫu tự động SIL-20A, mô-đun chuyển động CBM-20A, bộ khử nhiễu DGU-20A3. Cột hillic Develosil 100-5 Si (ID 150 mm × 2 mm ID, kích thước chất mạng 5 μm) (Nomura Chemical), sử dụng hệ thống sắc ký Nexera-e (Shimadzu, Nhật Bản), thực hiện bằng cách sử dụng cột hillic và gradient bao gồm hai dung môi, A và B. Dung 57 môi A là acetoneitril/nước (94:6, v:v) và dung môi B là nước tinh khiết. Cả hai dung môi đều chứa acid acetic 20 mM và 10 mM amoniac. Tốc độ bắt đầu từ 0% dung môi B, sau đó được tăng lên 20% trong 30 phút và duy trì ở mức 20% trong 10 phút trước khi giảm xuống 0% trong 7 phút tổng thời gian chạy là 47 phút). Tốc độ dòng là 0,2 mL/phút. Hàm lượng và cấu trúc các dạng phân tử của lipid phân cực được phát hiện bằng phép đo phổ khối có độ phân giải cao (HRMS) LC/MS-IT-TOF (Shimadzu, Nhật Bản). Các dạng phân tử riêng lẻ của lipid phân cực được phát hiện bằng cách so sánh với các tiêu chuẩn xác thực trên phần mềm xử lý Shimadzu LC-MS (v.3.60.361), mỗi mảnh ion trong MS và MS/MS đã có tính sai số tuyệt đối (difference). Sau khi kiểm tra sai số của các ion, cùng với độ bội của liên kết và dạng phân tử thỏa mãn chúng tôi sẽ chọn và xác định diacyl để từ đó xác định được dạng phân tử. Việc định lượng từ dạng phân tử riêng lẻ trong mỗi dạng thành phần của lipid phân cực được thực hiện bằng cách tính diện tích của từng peak sắc ký ion so với tổng diện tích các peak nhận diện được. 3.4. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 3.4.1. Xác định hoạt tính chống oxi hóa theo DPPH Thực nghiệm tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. Mẫu được pha trong DMSO (Dimethyl sulfoxid) 100% với nồng độ 4 mg/mL đối với lipid hạt họ Đậu. Sử dụng acid ascorbic 5 mM trong DMSO 10% làm đối chứng dương. Sau đó mẫu được nhỏ trên phiến vi lượng 96 giếng với dung dịch DPPH (được pha trong ethanol 96%) để được nồng độ cuối của mẫu thử trong phản ứng từ 200 μg/mL đến 12,5 μg/mL (đối với mẫu chiết thô) và từ 50 μg/mL đến 3,1 μg/mL (mẫu tinh sạch). Ủ ở 37oC trong 30 phút và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 515 nm trên thiết bị đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ). Khả năng trung hòa các gốc tự do (Scavenging capacity, SC %): 58 Giá trị trung bình của SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Excel theo công thức: SC(%) = [100 - ODThí nghiệm - OD DMSO x100] ± σ ODchứng(-) Độ lệch tiêu chuẩn  tính theo công thức của Ducan như sau: Xác định SC50: Giá trị IC50 là nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do, được xác định bằng phần mềm TableCurve AISN (Jandel Scientific, Mỹ) qua giá trị SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng. Kết quả các thử nghiệm là giá trị trung bình của ít nhất 3 phép thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0,05). Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC ≥ 50%) sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị SC50. Giá trị SC50 (Scavenging Concentration at 50% - nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. 3.4.2. Khảo sát tiềm năng chống oxi hóa bằng phiếm hàm mật độ (DFT) hiệu năng cao Thực nghiệm tại Phòng Hóa sinh hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Viện Nghiên cứu và Phát triển, Đại học Duy Tân, Đà Nẵng. Tất cả các tính toán được thực hiện bằng phiếm hàm LC-ωPBE kết hợp với bộ hàm cơ sở 6-311++G(d,p). Các kết quả thu được sau đó được so sánh với các kết quả khác trong tài liệu để cung cấp thêm thông tin về độ tin cậy của phiếm hàm được sử dụng. 59 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Hàm lượng lipid tổng và các lớp chất lipid của 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu 4.1.1. Hàm lượng lipid tổng Sau khi tiến hành chọn mẫu, chiết tách và loại bỏ dung môi theo sơ đồ nghiên cứu chung, chúng tôi thu được trọng lượng lipid tổng của 11 mẫu hạt họ Đậu ở hình 4.1 như sau: Hình 4.1. Hàm lượng % lipid tổng trong 11 mẫu hạt họ Đậu Hàm lượng lipid tổng của các mẫu hạt họ Đậu trong nghiên cứu dao động mạnh từ 0,99% (Muồng hoàng yến) đến 20,91% (hạt Củ đậu). Kết quả này cho thấy lượng lipid tổng trong Đậu tương leo (16,91%), hay trong hạt Củ đậu (20,91%) là cao và tương đương với hàm lượng lipid của các đối tượng thuộc nhóm các cây dinh dưỡng thuộc họ Đậu như Đậu nành (22,1%) [18]. Tuy 60 nhiên so với nghiên cứu của Augustus và Badami et al.[100, 101] chỉ tìm thấy một lượng nhỏ lipid trong hạt từ hai loài Dalbergia thuộc nhóm các cây công nghiệp thuộc họ Đậu dao động từ 4,8% (D. sissoo) đến 7,4% (D. paniculatae) thì các kết quả thu được trong các mẫu hạt Sưa (13,86%) hay trong hạt Cẩm lai (8,43%) là tương đối phù hợp. Hàm lượng của lipid tổng trong nhóm dinh dưỡng cao hơn so với một số hạt thuộc loài Dalbergia (thuộc nhóm công nghiệp) và phù hợp với công bố trước đây đối với một số loài Đậu hoang dã tại Hàn Quốc (lượng lipid tổng dao động từ 2,8% đến 18,0% và từ 1,3-2,3 g/100 g đối với một số giống Đậu lima [102]. Các loài còn lại thuộc nhóm y, dược có lượng lipid tổng thấp dao động từ 1,24% (Đậu trứng cuốc) đến 2,01% (Đậu đỏ). Từ lượng lipid tổng đã cho thấy một số mẫu hạt họ Đậu có hàm lượng này vượt trội so với các mẫu còn lại như: Sưa (13,86%), Cẩm lai (8,43%), Củ đậu (20,91%)... Đây sẽ là một trong các căn cứ để chúng tôi lựa chọn mẫu lipid hạt họ Đậu cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.1.2. Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid Kết quả bản mỏng TLC và sắc ký đồ các lớp chất lipid của 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu được thể hiện qua hình 4.2 như sau: 61 Ký hiệu Tên mẫu Bản mỏng TLC Sắc ký đồ M 9 (Đậu ngự) Phaseolus lunatus L. M12 (Đậu đỏ) Vigna angularis (Willd.) Ohwi & Ohashi M 13 (Đậu trứng cuốc) Vigna unguiculata (L.) Walp. ssp. cylindrica (L.) Verdc. - Cv. M 14 (Đậu trắng) Phaseolus vulgaris L. BH 73 (Đậu tương leo) Glycine soja Sieb. & Zucc. 62 BH 101 (Củ đậu) Pachyrhizus erosus (L.) Urb M 1 (Sưa) Dalbergia tonkinensis Prain BH 109 (Trắc bàm bàm) Dalbergia entadoides Pierre ex Prain BH 114 (Cẩm lai) Dalbergia mamosa Pierre M 8 (Muồng hoàng yến) Cassia fistula L. BH56 (Cà te) Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib Hình 4.2. Bản mỏng TLC và sắc ký đồ các lớp chất lipid một số loài họ Đậu 63 Kết quả phân tích định lượng bằng phần mềm Sorbfil TLC Videodensitometherr DV xác định được phần trăm khối lượng các lớp chất lipid chính của 11 mẫu hạt, số liệu được trình bày trong bảng 4.1: Bảng 4.1. Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid chính trong hạt 11 loài thuộc họ Đậu nghiên cứu (n=3). Mẫu Hàm lượng các lớp chất lipid (% so với lipid tổng) Pol ST DG FFA TG HW M 9 (Đậu ngự) 19,10±0,04 19,3±0,05 5,5±0,01 13,2±0,05 29,60±0,03 13,40±0,05 M12 (Đậu đỏ) 22,50±0,04 8,30±0,05 9,50±0,02 15,3±0,06 37,20±0,02 7,20±0,05 M 13 (Đậu trứng cuốc) 24,88±0,04 9,59±0,03 8,15±0,04 14,31±0,04 35,54±0,05 7,53±0,03 M 14 (Đậu trắng) 20,80±0,05 10,7±0,06 8,2±0,03 16,50±0,05 37,70±0,04 6,10±0,05 BH 73 (Đậu tương leo) 18,51±0,04 15,37±0,05 7,81±0,03 17,52±0,02 31,42±0,02 9,37±0,05 BH 101 (Củ đậu) 17,88±0,02 3.46±0,04 - 13,57±0,03 65,09±0,01 - M 1 (Sưa) 18,29±0,06 0,05±0,05 0,2±0,05 3,87±0,05 76,38±0,02 1,21±0,05 BH 109 (Trắc bàm bàm) 17,28±0,03 2,49±0,05 - 7,53±0,06 70,14±0,01 0,84±0,06 BH 114 (Cẩm lai) 16,07±0,03 3,16±0,03 4,06±0,06 4,71±0,03 69,51±0,01 2,49±0,05 M 8 (Muồng hoàng yến) 19,39±0,05 7,07±0,04 - 21,92±0,05 43,63±0,06 7,99±0,05 BH56 (Cà te) 11,56±0,03 3,65±0,03 2,6±0,02 14,12±0,02 69,94±0,003 0,15±0,05 Ghi chú: (Pol: lipid phân cực, ST: sterol, DG: Diacylglycerol, FFA: fatty acid, TG: triacylglycerol, MADG: monoalkyldiacylglycerol, HW: hydrocacbon + sáp). Kết quả phân tích cho thấy, trong lipid tổng của các mẫu hạt nghiên cứu có đầy đủ các lớp chất cơ bản: lipid phân cực (PoL), sterol (ST), acid béo tự do (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), hydrocarbon và sáp (HC + W) ( Bảng 4.1). Một số lớp chất được nghiên cứu là có tiềm năng chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học tốt như Pol, FFA, TG, ST [103]. Các lớp chất như FFA, PoL, TG được xem là lớp chất điển hình, chiếm hàm lượng lớn trong các mẫu nghiên cứu. Trong đó lớp chất triacylglycerol (TG) có mặt ở tất cả các mẫu và chiếm tỷ lệ cao nhất : từ 29,60% (Đậu ngự (M9)) đến 76,38% (Sưa). Hàm lượng TG trong các mẫu thuộc nhóm các cây công nghiệp cao hơn so 64 với các cây thuộc nhóm dinh dưỡng và y, dược. Cụ thể: trong nhóm các cây công nghiệp hàm lượng TG dao động từ 43,63% với Muồng hoàng yến đến 69,94% với Cà te hoặc 76,38% với Sưa, còn trong nhóm dinh dưỡng và y, dược hàm lượng TG dao động ở mức thấp hơn từ 29,60% với Đậu ngự đến 37,70% với Đậu trắng, riêng mẫu Củ đậu trong nhóm dinh dưỡng lại đạt ở mức cao 65,09% gần với nhóm cây cây công nghiệp. Lớp chất lipid phân cực (Pol) là lớp chất phổ biến nhất trong lipid hạt họ Đậu với 100% các mẫu đều xuất hiện với hàm lượng trung bình chiếm vị trí thứ hai trong 6 lớp chất được tìm thấy (cao nhất trong lớp chất này là lipid hạt Muồng hoàng yến (M8: 19,39%), lipid hạt Sưa (M1: 18,29%), hay trong lipid hạt Đậu trứng cuốc (M13: 24,88%..). Lớp chất này gợi ý sự tồn tại của phospholipid, một dạng lipid phân cực có hoạt tính sinh học cao và xuất hiện nhiều trong lipid của hạt Đậu nành [102, 104]. Nếu trong nhóm cây công nghiệp có hàm lượng TG cao hơn hàm lượng TG trong nhóm cây dinh dưỡng và y, dược thì ngược lại hàm lượng Pol trong nhóm cây dinh dưỡng và y, dược lại cao hơn so với hàm lượng Pol trong nhóm cây công nghiệp. Cụ thể: trong nhóm cây dinh dưỡng và y, dược hàm lượng Pol dao động từ 17,88% trong Củ đậu đến 22,50% với Đậu trắng hoặc 24,88% với Đậu trứng cuốc, thì hàm lượng Pol trong nhóm cây công nghiệp chỉ dao động từ 11,56% với Cà te đến 17,28% với Trắc bàm bàm. Riêng mẫu hạt Sưa hàm lượng Pol đạt 18,29% và Muồng hoàng yến đạt 19,39% lại tương đối cao gần với kết quả của nhóm dinh dưỡng và y, dược. Đây này là dữ liệu quan trọng trong việc lựa chọn mẫu để nghiên cứu chuyên sâu. Lớp chất sterol là lớp chất phổ biến của lipid hạt họ Đậu, tương tự như lớp chất TG và Pol thì sterol cũng xuất hiêṇ trong tất cả các mẫu với hàm lươṇg cao nhất đạt 19,30% (hạt Đậu ngự (M9)) hay 9,59% (hạt Đậu trắng (M13))Hàm lượng sterol trong nhóm dinh dưỡng, y, dược cao hơn trong nhóm công nghiệp. Cụ thể, trong nhóm dinh dưỡng, y, dược hàm lượng sterol cao nhất đạt 15,37% với Đậu tương leo hoặc 19,30% với Đậu ngự trong khi hàm lượng sterol trong nhóm công nghiệp cao nhất chỉ đạt 7,07% với Muồng hoàng yến hoặc 3,65% với Cà te. Đây là lớp chất phổ biến trong sinh vật và có chức năng sinh học quan trọng. Việc sử dụng 65 sterol thực vật sẽ giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim, mạch vành, phòng ngừa và điều trị được nhiều bệnh liên quan đến tim mạch [105]. Lớp chất acid béo tự do (FFA) là lớp chất khá phổ biến trong các mẫu hạt họ Đậu, có trong tất cả các mẫu với hàm lượng từ 3,87% (Sưa) đến 21,92% (Muồng hoàng yến). Tương tự như Pol và sterol, hàm lượng FFA trong các mẫu lipid hạt thuộc nhóm cây dinh dưỡng, y, dược cao hơn trong nhóm cây công nghiệp. Trong nhóm cây dinh dưỡng, y, dược hàm lượng FFA trung bình đạt 15,07%, còn trong nhóm cây công nghiệp hàm lượng FFA chỉ đạt trung bình 10,43%. Những kết quả phân tích trên đây là cơ sở để chúng tôi có những nghiên cứu tiếp theo. Lớp chất diacylglycerol (DG) chỉ xuất hiện 8/11 mẫu với hàm lượng trung bình đạt 5,75%, trong đó tập chung chủ yếu ở nhóm dinh dưỡng và y, dược với phần trăm dao động từ 5,5% (Đậu ngự) đến 9,5% (Đậu đỏ), còn trong nhóm cây công nghiệp thuộc họ Đậu thì hàm lượng DG cao nhất chỉ đạt 4,06% với Cẩm lai, các mẫu khác hầu như không có hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp. Lớp hydrocacbon và sáp (HW) xuất hiện khá phổ biến trong lipid hạt họ Đậu với 10/11 mẫu với hàm lượng cao nhất đạt 13,40% với Đậu ngự và tập chung chủ yếu trong nhóm dinh dưỡng và y, dược. Như vậy, qua nghiên cứu các lớp chất cơ bản từ lipid của các mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu ta thấy trong cả 11 mẫu thì thành phần chủ yếu là FFA, TG, PoL, và ST, vì vậy chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần và hàm lượng của các hợp chất này. 4.1.3. Thành phần và hàm lượng acid béo Qua quá trình làm thực nghiệm chúng tôi định lượng được thành phần các acid béo trong dầu haṭ của 11 mẫu hạt họ Đậu thu được ở bảng 4.2, đã phát hiện 20 loại acid béo và một dạng squalen. Về giá trị dinh dưỡng, lipid hạt họ Đậu là một lipid thực vật có giá trị dinh dưỡng cao với hàm lượng lớn các acid không bão hòa tốt cho sức khỏe như acid oleic, acid linoleic, acid linolenic với trung bình tổng hàm lượng các acid này 80% và các acid béo bão hòa có khả năng tăng cholesterol “xấu” trong máu ở hàm lượng thấp [106]. 66 Bảng 4.2. Thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid haṭ của 11 loài họ Đậu nghiên cứu (% so với tổng acid béo) Thành phần acid béo Mẫu M9 (Đậu ngự) Mẫu M12 (Đậu đỏ) Mẫu M13 (Đậu trứng cuốc) Mẫu M14 (Đậu trắng) Mẫu BH73 (Đậu tương leo) Mẫu BH101 (Củ đậu) Mẫu M1 (Sưa) Mẫu BH109 (Trắc bàm bàm) Mẫu BH114 (Cẩm lai) Mẫu M8 (Muồng hoàng yến) Mẫu BH56 (Cà te) 14:0 - - - - - 0,64±0.05 - - - - - 16:0 23,42±0.004 12,64±0.03 9,47±0.004 7,91±0.004 11,13±0.02 28,11±0,05 13,2±0,02 16,91±0,04 12,09±0,02 16,46 ±0.04 7,12±0.1 16:1(n-7) - 0,62±0,01 0,15±0.05 0,26±0.01 0,09±0.05 - 0,2±0,05 - 0,20±0,001 0,39±0.01 0,12±0.25 16:1(n-9) 0,17±0.03 - - - - 0,13±0,04 0,52±0,01 - - - 17:0 0,28±0.05 0,18±0.03 0,17±0.19 0,21±0.15 0,11±0.1 0,19±0,04 0,1±0,03 0,67±0,30 0,20±0,002 - 0,08±0,01 18:0 5,79±0.03 3,25±0.1 1,30±0.05 1,62±0.05 2,76±0.04 5,78±0,05 4,5±0,04 6,47±0,02 6,63±0,01 4,04±0.14 2,78±0.5 18:1(n-7) - - - - - 0,06±0,04 - - 0,94±0.03 0,7±0.14 18:1(n-9) 5,61±0.01 6,56±0.02 5,13±0.02 5,57±0.02 29,66±0.04 25,74±0,03 11,6±0,10 25,06±0,01 51,2±0,3 15,88±0.04 8,76±0.01 18:1(n-11) 1,14±0,01 0,46±0,01 2,11±0.01 2,16±0.01 0,08±0,01 - 3,6±0,20 0,5±0,004 0,60±0,002 - 0,70±0,10 18:2(n-6) 41,64±0.004 49,01±0.01 29,20±0.02 20,34±0.02 48,09±0.05 32,37±0,01 64,7±0,05 22,97±0,02 20,06±0,01 50,50±0.01 24,72±0.03 18:3(n-3) 17,77±0,02 26,10±0,02 49,53±0.01 59,39±0.01 6,76±0,01 0,79±0,04 1,5±0,03 7,30±0,03 1,20±0,02 1,37±0.05 54,4±0.02 20:0 1,01±0.03 0,48±0.05 0,38±0.05 0,39±0.05 0,38±0.05 0,99±0,04 0,1±0,004 1,44±0,05 1,90±0,03 1,00±0.04 1,0±0.04 20:1(n-9) 0,16±0,01 0,02±0,01 0,15±0.03 0,15±0.01 0,29±0,02 - 0,1±0,002 0,50±0,002 0,3±0,04 0,21±0.19 0,21±0,10 20:1(n-11) - - - - - 0,4±0,02 - - - - - 20:2(n-6) - - 0,07±0.14 - - 0,03±0,03 - - - - - 20:4(n-3) - - 0,05±0.04 - - 0,04±0,04 - - - - - 22:0 2,08±0.04 1,04±0.03 1,90±0.01 1,28±0.02 0,58±0.05 2,02±0,04 0,3±0,003 15,30±0,10 3,39±0,002 1,18±0.05 - 22:2(n-6) - 0,92±0.03 - - - 0,09±0,05 - - - - - 24:0 - - 0,51±0.01 0,72±0.01 0,07±0,01 - - 2,50±0,10 1,30±0,01 1,38±0.06 - 24:1(n-9) 0,18±0,01 - - - - - - - - 0,83±0.05 - Squalen - 0,8±0.05 - - - - - - - - - Acid béo no 33,51±0,02 17,23±0,01 13,73±0,01 12,13±0,03 15,03±0,01 37,73±0,03 18,20±0,04 43,26±0,01 25,50±0,04 24,06±0,02 10,17±0,01 Acid béo không no 82,77±0,03 66,49±0,02 86,27±0,03 87,87±0,01 84,97±0,02 59,65±0,02 81,80±0,05 56,74±0,05 74,50±0,01 70,12±0,01 88,82±0,02 Khác - - - 1,67±0.03 - 2,62±0.05 - - 1,13±0,02 - - n-3 17,77±0,03 26,10±0,02 49,58±0.01 59,39±0.01 6,76±0,01 0,83±0,04 1,5±0,03 7,30±0,03 1,20±0,02 1,37±0.05 54,4±0.01 n-6 41,64±0.01 49,93±0.01 29,27±0.02 20,34±0.02 48,09±0.04 32,49±0,01 64,7±0,04 22,97±0,02 20,06±0,01 50,50±0.01 24,72±0.03 n-9 6,12±0.02 6,58±0.02 5,28±0.02 5,72±0.02 29,95±0.04 25,87±0,03 11,7±0,10 26,08±0,01 51,5±0,3 16,92±0.04 8,97±0.01 n-3/n-6 0,43 0,52 1,69 2,92 0,14 0,026 0,023 0,32 0,06 0,03 2,2 67 Hình 4.3. Phần trăm acid béo no và không no trong 11 mẫu lipid hạt họ Đậu nghiên cứu Nhóm các acid béo no (SFA): đã xác định được 7 acid béo no với phần trăm dao động từ 10,17% (Cà te) đến 43,26% (Trắc bàm bàm). Trong các mẫu hạt nghiên cứu đều chứa các acid no thường gặp trong lipid hạt: acid palmitic (16:0) có kết quả dao động trung bình từ 11,13% (Đậu tương leo (BH73)) đến 28,11% (hạt Củ đậu (BH101)); acid stearic (18:0) có hàm lượng từ 0,04% - 6,63%, hạt Cẩm lai (BH114) có hàm lượng cao nhất đạt 6,63%... Hai mẫu Trắc bàm bàm (BH109) và hạt Cẩm lai vú (BH114) còn có acid béo no behenic (22:0) chiếm tỷ lệ 15,25% và 3,39%, trong khi các acid béo no còn lại trong các mẫu đều có tỷ lệ thấp hơn 1%. Tuy nhiên, acid margaric (14:0) hầu như không xuất hiện ở các mẫu đã nghiên cứu. Nhóm các acid béo không no: đã xác định được 13 acid béo không no có tổng hàm lượng dao động từ 56,74% đến 88,82%. Trong đó, các acid như oleic, acid linoleic và acid linolenic chiếm chủ yếu, với acid linoleic (18:2(n-6)) là acid cần thiết cho cơ thể sống, hàm lượng tương đối cao (64,7%) với hạt Sưa (M1) cao hơn Đậu nành (BH73) (trung bình 50%) và gần bằng với hạt rum (70%) [18], acid linoleic (ω-6) là acid có tác dụng ngừa tim mạch và làm giảm huyết áp [107]. Hàm lượng acid béo không no trong cả 2 nhóm dinh dưỡng, y, dược và nhóm công nghiệp đều cao. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Mẫu M9 (Đậu ngự) Mẫu M12 (Đậu đỏ) Mẫu M13 (Đậu trứng quốc) Mẫu M14 (Đậu trắng) Mẫu BH73 (Đậu tương leo) Mẫu BH101 (Củ đậu) Mẫu M1 (Sưa) Mẫu BH109 (Trắc bàm bàm) Mẫu BH114