Luận án Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas Paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm - Nguyễn Thị Hồng Hà

LỜI CẢM ƠN.i

LỜI CAM ĐOAN.ii

MỤC LỤC .iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.vii

DANH MỤC CÁC BẢNG.viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ . x

MỞ ĐẦU. 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN. 4

1.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL . 4

1.1.1. Cấu tạo . 4

1.1.2. Tính chất. 4

1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel . 5

1.1.4. Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan . 7

1.1.4.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. 7

1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp gellan . 8

1.1.4.2. Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S. paucimobilis. 9

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL . 11

1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan. 11

1.2.1.1. Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống . 11

1.2.1.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men . 11

1.2.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí . 14

1.2.1.4. Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan . 15

1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men. 18

1.2.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl . 20

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL. 21

1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây. 21

1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm. 23

1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác . 25

1.4. VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN. 26

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 29

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ TRANG THIẾT BỊ . 29

2.1.1. Chủng giống, nguyên liệu chuối . 29

2.1.2. Môi trường . 29

2.1.3. Hóa chất . 30

2.1.4. Thiết bị, dụng cụ . 30

2.2. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH . 31iv

2.2.1. Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl. 31

2.2.2. Phân tích cấu trúc gellan và gellan khử acyl (phổ MNR) . 32

2.2.3. Xác định khối lượng phân tử của gellan . 33

2.2.4. Xác định mức độ deacyl hóa (ĐĐA) của gellan khử acyl . 34

2.2.5. Xác định độ bền gel của gellan khử acyl . 35

2.2.6. Xác định khả năng tạo gel với các ion Ca+2 và Na+ . 35

2.2.7. Phân tích các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của gellan. 35

2.2.8. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn. 36

2.2.9. Xác định hàm lượng protein.36

2.2.10. Xác định hàm lượng màu carotenoid.36

2.2.11. Phương pháp xử lí số liệu . 36

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 36

2.3.1. Nhân giống và điều kiện bảo quản giống. 36

2.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL4. 36

2.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng

S. paucimobilis GL12. 37

2.3.3.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ . 37

2.3.3.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung axit amin . 37

2.3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2. 37

2.3.4. Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp gellan cho chủng S. paucimobilis GL12 . 38

2.3.5. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít . 40

2.3.5.1. Xác định tốc độ khuấy . 40

2.3.5.2. Xác định thời gian thu gellan. 40

2.3.6. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men . 40

2.3.6.1. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ. 40

2.3.6.2. Loại màu khỏi kết tủa gellan . 41

2.3.7. Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột . 41

2.3.7.1. Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột . 41

2.3.7.2. Nghiên cứu lựa chọn bao bì. 42

2.3.7.3. Xác định chế độ bảo quản. 42

2.3.8. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl . 42

2.3.8.1. Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl . 42

2.3.8.2. Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl. 43

2.3.8.3. Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl . 43

2.3.8.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl . 43

2.3.9. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối 43

2.3.9.1. Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan. 44

2.3.9.2. Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan. 44v

2.3.9.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng . 47

2.3.10. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa . 48

2.3.10.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch. 48

2.3.10.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa. 48

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 50

3.1. LỰA CHỌN CHỦNG CHO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GELLAN CAO . 50

3.1.1. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4. 50

3.1.2. So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 và

S. paucimobilis GL12. 53

3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ CHỦNG S. PAUCIMOBILIS GL12 .54

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan . 54

3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ . 54

3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin . 55

3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2. 56

3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan . 57

3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12 .58

3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít . 61

3.2.3.1. Xác định tốc độ khuấy . 61

3.2.3.2. Xác định thời gian thu hồi gellan. 62

3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men . 63

3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối . 63

3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ. 65

3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan . 66

3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột. 68

3.2.6. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan. 70

3.2.6.1. Nghiên cứu lựa chọn bao bì thích hợp cho chế phẩm. 70

3.2.6.2. Xác định điều kiện bảo quản . 72

3.2.7. Đề xuất qui trình thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12.74

3.3. CHUYỂN HÓA GELLAN THÀNH GELLAN KHỬ ACYL. 76

3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl. 76

3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan . 76

3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl . 78

3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol. 80

3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl . 81

3.3.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl . 82

3.3.5. Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl. 83

3.4. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CÁC CHẾ PHẨM. 85

3.4.1. Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis GL12. 85

3.4.1.1. Xác định cấu trúc gellan . 85vi

3.4.1.2. Xác định khối lượng phân tử gellan . 87

3.4.1.3. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan. 88

3.4.2. Đánh giá chất lượng gellan khử acyl. 90

3.4.2.1. Xác định cấu trúc gellan khử acyl . 90

3.4.2.2. Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl90

3.5. THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL. 91

3.5.1. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối. 91

3.5.1.1. Xác định hàm lượng gellan thích hợp trong công thức dung dịch tạo màng. 91

3.5.1.2. Xác định thông số kỹ thuật của màng bao gellan lựa chọn . 93

3.5.1.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản chuối của màng bao gellan. 93

3.5.2. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa . 97

3.5.2.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho trong công thức thạch . 97

3.5.2.2. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan sản phẩm thạch. 98

3.5.2.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch . 100

4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 102

4.1. KẾT LUẬN . 102

4.2. KIẾN NGHỊ . 1

pdf128 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 332 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas Paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm - Nguyễn Thị Hồng Hà, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
3 - 5 CĐ 6 6 - 12 - 18 - 24 - 28 2 - 2 - 3 - 4 - 4 2.3.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng sinh tổng hợp gellan cho chủng S. paucimobilis GL12 (bình tam giác) Phương pháp tối ưu ở đây được áp dụng theo phương pháp bề mặt đáp ứng [69], quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken và phần mềm Design Expert 7.15. Hàm mục tiêu (Y) ở đây là hàm lượng gellan thu được tối đa. Ba yếu tố độc lập có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan với các khoảng chạy tương ứng của chúng được cho ở bảng 2.3. Bảng 2.3. Các yếu tố và các mức củ yếu tố trong thí nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gell n từ chủng S. p usimobilis G 12 Yếu tố thí nghiệm Mức yếu tố Mức dưới (-1) Mức giữa (0) Mức trên (+1) Nồng độ glucose (X1 - %) 3,0 3,5 4,0 Nồng độ bột đậu tương (X2 - %) 1,5 2,0 2,5 Nồng độ L-threonine (X3 - %) 0,03 0,05 0,07 Ma trận thực nghiệm được thiết kế theo Box–Behnken, với 17 thí nghiệm trong đó có 5 thí nghiệm tại tâm cho ở bảng 2.4. 39 Bảng 2.4. M trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gell n từ chủng S. p usimobilis G 12 Mô hình toán học biểu diễn mối tương tác đồng thời của các yếu tố thí nghiệm tới khả năng sinh tổng hợp gellan có dạng sau: Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 + B11X1 2 + B22X2 2 + B33X3 2 Trong đó, B1, B2, B3 là các hệ số bậc 1; B11, B22 và B33 là hệ số bậc 2; B12, B13 và B23 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố Số liệu được phân tích bằng phần mềm Design Expert, kiểm tra mức độ phù hợp của mô hình đã xây dựng và sự có nghĩa của các hệ số hồi qui. Thí nghiệm Biến mã Biến thực Y thực nghiệm x1 x2 x3 Hàm lượng glucose (X1 - %) Hàm lượng bột đậu tương (X2 - %) Hàm lượng L-threonine (X3 - %) Hàm lượng gellan (g/l) 1 1 -1 0 4,0 1,5 0,05 2 0 -1 1 3,5 1,5 0,07 3 -1 -1 0 3,0 1,5 0.05 4 0 0 0 3,5 2,0 0,05 5 0 0 0 3,5 2,0 0,05 6 1 1 0 4,0 2,5 0,05 7 0 0 0 3,5 2,0 0,05 8 -1 1 0 3,0 2,5 0,05 9 0 -1 -1 3,5 1,5 0,03 10 0 0 0 3,5 2,0 0,05 11 0 0 0 3,5 2,0 0,05 12 0 1 -1 3,5 2,5 0,03 13 -1 0 1 3,0 2,0 0,07 14 -1 0 -1 3,0 2,0 0,03 15 1 0 1 4,0 2,0 0,07 16 1 0 -1 4,0 2,0 0,03 17 0 1 1 3,5 2,5 0,07 40 Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm mong đợi để xác định các giá trị tối ưu của các yếu tố khảo sát cho hàm lượng gellan cao nhất. Các thực nghiệm được tiến hành trong bình tam giác với lượng 150 ml môi trường/bình, pH 7 ± 0,2, khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Lượng giống 8%, lên men ở 30 o C và với các thông số ứng với mỗi thực nghiệm. Sau 66 giờ lên men, mẫu được lấy đi đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan ở mỗi thực nghiệm. 2.3.5. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít 2.3.5.1. Xác định tốc độ khuấy Tiến hành lên men gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 trên bình lên men sục khí 10 lít với dung tích làm việc 7 lít/mẻ. Thành phần môi trường lên men (%): glucose (3,6), bột đậu tương (2,1), L- threonine (0,06) và muối khoáng; pH 7,0 ± 0,2, tỷ lệ giống 8%, nồng độ H2O2 bổ sung là 2, 2, 3 và 4 mM/lít tương ứng ở các thời điểm 6, 12, 18 và 24 giờ. Thiết bị lên men được cài đặt chế độ nhiệt độ 30oC, tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph và với tốc độ khuấy khác nhau là 200; 225, 250, 275 và 300 vòng/phút. Sau 66 giờ lên men, mẫu được lấy đi đánh giá khả năng tạo gellan. 2.3.5.2. Xác định thời gian thu gellan Thử nghiệm được tiến hành với tốc độ khuấy thích hợp tìm ra ở trên và sau các mốc thời gian nuôi khác nhau từ 0 - 72 giờ (cứ 12 giờ lấy mẫu 01 lần), mẫu được lấy đi đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan. 2.3.6. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 2.3.6.1. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ Tiến hành theo phương pháp của Fialho và cộng sự năm 1999. Mỗi phương án thử nghiệm được tiến hành với 1 lít dịch lên men gellan. Tiền xử lý dịch lên men Dịch sau lên men được nâng nhiệt lên ở các mốc 75, 85, 90, 95, 100oC trong 15 phút, tiếp đến làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút để loại xác tế bào. Dịch nổi được lấy đi xác định hàm lượng gellan và protein để đánh giá hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại protein. Song song làm mẫu kiểm chứng không nâng nhiệt. Lựa chọn dung môi kết tủa Dịch nổi chứa gellan sau khi đã loại xác tế bào được bổ sung ethanol, acetone, methanol, isopropyl alcohol theo tỉ lệ 1:3 (v/v). Quá trình tủa được để 10 giờ, sau đó tiến 41 hành ly tâm ở 4500 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa gelan. Xác định hiệu suất thu hồi gelan theo lượng gelan trước và sau kết tủa. Xác định tỷ lệ dịch lên men và dung môi Dịch nổi chứa gellan được bổ sung với các tỉ lệ dịch lên men: ethanol 95o là 2:1; 1:1; 1:2; 1:3 (v/v). Gellan được thu nhận tương tự như trên và đánh giá hiệu suất thu hồi gellan của bước kết tủa. 2.3.6.2. Loại màu khỏi kết tủa gellan Kết tủa gellan thu được ở trên được hòa lại bằng nước khử ion (tỷ lệ tủa: nước là 1:2 (v/v) và được kết tủa lại với ethanol 95o, sau 10 giờ kết tủa, đem ly tâm 4500 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi, lặp lại các bước kết tủa 2, 3 và lần 4 (tỉ lệ dịch tủa/dung môi = 1/2) sau đó đánh giá hiệu suất thu hồi gellan cho công đoạn làm sạch và khả năng loại bỏ lượng màu carotenoid khỏi kết tủa. 2.3.7. Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột 2.3.7.1. Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột Các thí nghiệm sấy tiến hành với lượng kết tủa thu được từ 10 lít dịch lên men. Quá trình này được thực hiện trên máy sấy Memmert của Đức, có điều chỉnh nhiệt độ sấy, tốc độ thổi khí, hẹn giờ tự động. Xác định nhiệt độ sấ Kết tủa được sấy với nhiệt độ của tác nhân sấy biến thiên 60, 70, 80, 90 và 100oC. Cố định các thông số khác của quá trình sấy như tốc độ thổi khí 1 m/s, thời gian sấy 24 giờ, độ dày khối sấy 7,5 cm. Dàn đều chế phẩm, dùng que sắt nhọn kẻ thành các ô vuông có cạnh 1,5 cm, khi bề mặt khối sấy khô se tiến hành đảo để khối ô vuông gellan rời ra, rồi dàn đều, sau đó cứ 2 giờ lặp lại 01 lần. Sau 24 giờ thu được sản phẩm gellan đem đi nghiềm thành bột và xác đinh trọng lượng gellan. Xác định tốc độ thổi khí Các thông số sấy được giữ cố định ở nhiệt độ 70oC, độ dày lớp sấy 5 cm. Tốc độ thổi khí 0,50; 0,75; 1,00 và 1,25 m/s. Sau 24 giờ sấy thu hồi và xác định trọng lượng gellan. Xác định thời gian sấy Các thông số sấy được giữ cố định ở nhiệt độ 70oC, tốc độ thổi khí 1 m/s, độ dày lớp sấy 5 cm. Thời gian sấy khảo sát ở 12, 16, 20, 24 và 28 giờ. Xác định độ dày vật liệu sấy 42 Các thông số sấy được giữ cố định nhiệt độ 70oC, tốc độ thổi khí 1 m/s, thời gian sấy 24 giờ. Độ dày vật liệu sấy thay đổi lần lượt là 2,5; 5,0; 7,5 và 10 cm. 2.3.7.2. Nghiên cứu lựa chọn bao bì Bột gellan được bảo quản bằng các loại màng như sau: - Màng 01 lớp: Polyethylene, PVDC (polyvinylidende cloride), Al-Foil (lá nhôm mỏng), MDPE và HDPE. - Màng 02 lớp: Ny/PE, BOPP/PE, AL/PE - Màng 03 lớp: BOPP/AL/PE và PET/AL/PE - Màng 04 lớp: POPP/PE/AL/PE - Màng 05 lớp: PET/PE/Al/PE/LLDPE Tất cả các mẫu được bảo quản ở điều kiện thường. Lựa chọn loại màng bảo quản dựa vào kết quả đánh giá độ ẩm và độ nhớt của sản phẩm sau 06 tháng bảo quản. 2.3.7.3. Xác định chế độ bảo quản Chế phẩm gellan được đóng túi trong màng Al/PE, được nghiên cứu bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4 - 10oC và nhiệt độ phòng. Đánh giá chỉ tiêu độ ẩm và độ nhớt sau 1 và 3 tháng bảo quản. Sau khi đã chọn được điều kiện bảo quản, chế phẩm tiếp tục được theo dõi sau 6 tháng bảo quản, rồi đánh giá chỉ tiêu hóa lý và ATTP. 2.3.8. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl 2.3.8.1. Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl Gellan được chuyển hóa thành gellan khử theo phương pháp của Nampoothiri và cộng sự (2003) có cải tiến [65]. Mỗi phương án thử nghiệm được tiến hành với 10 lít dịch lên men gellan đã loại xác tế bào (theo mục 2.3.6.1. Tiền xử lý dịch lên men) Xác định pH thích hợp Điều chỉnh pH của dịch lên men gellan bằng NaOH 2M đạt bốn mốc pH: 8; 9; 10 và 11. Nâng dịch lên 80oC ủ trong 8 phút, làm nguội và điều chỉnh pH các mẫu xuống 7,0 bằng dung dịch HCl (giữ trong 10 phút). Ethanol 95o được thêm vào dịch với tỉ lệ dịch : ethanol là 1:2, đảo đều, kết tủa gellan khử acyl ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ. Sau đó tiến hành đánh giá mức độ deacyl (ĐĐA) của các mẫu. Xác định thời gian deacyl của gellan 43 Thử nghiệm deacyl được tiến hành như trên với các khoảng thời gian phản ứng thay đổi từ 4; 6; 8; 10 đến 12 phút. Sau đó tiến hành đánh giá mức độ deacyl của chế phẩm gellan nghiên cứu. 2.3.8.2. Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl Dịch nổi chứa gellan khử acyl được bổ sung với các tỉ lệ dịch lên men: ethanol 95o là 2:1; 1:1; 1:2; 1:3 (v/v). Quá trình tủa được để 10 giờ, sau đó tiến hành ly tâm ở 4500 vòng trong 15 phút thu tủa gelan khử acyl. Xác định hiệu xuất thu hồi gelan khử acyl. 2.3.8.3. Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl Dịch tủa thu được từ 10 lít dịch lên men chứa gellan khử acyl được sấy đối lưu với nhiệt độ của tác nhân sấy 80oC, tốc độ thổi khí 1 m/s, dàn đều khối sấy và có độ dày là 5cm, dùng que sắt nhọn kẻ thành các ô vuông có cạnh 1,5 cm, khi bề mặt khối sấy khô se tiến hành đảo để khối ô vuông gellan rời ra, rồi dàn đều, sau đó cứ 2 giờ lặp lại 01 lần. Sau 24 giờ thu được sản phẩm gellan đem đi nghiền thành bột, rồi đóng trong bao bì. Thí nghiệm được lặp lại 03 lần, sau mỗi lần thu gellan khử acyl và đánh giá hiệu suất thu hồi. 2.3.8.4. Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl Chế phẩm gellan được đóng túi trong màng Al/PE, được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4 ± 1oC và nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian 1, 3 và 6 tháng mẫu được lấy đi đánh giá các chỉ tiêu hóa lý và an toàn thực phẩm. 2.3.9. Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối Nguyên liệu chuối Chuối tiêu được thu mua tại vùng Đông tảo, Khoái Châu, Hưng Yên, vụ 2017 ở độ chín 2 (bảng 2.5). Chuối phải được lựa chọn kỹ để loại bỏ những nải xấu, bị tổn thương, bị bệnh. Rửa sạch các nải chuối bằng nước thường, xử lý vi sinh vật bằng clorin 100 ppm trong 3 phút, xếp chuối lên giá, để ráo ở nhiệt độ thường rồi được chia thành các lô thí nghiệm. Bảng 2.5. Chỉ số màu chuẩn cho chuối (CSIRO, 1971) Độ chín Màu vỏ Độ chín Màu vỏ 1 Xanh lá cây 5 Vàng, có chỉ xanh 2 Xanh lá cây, có vết vàng 6 Vàng hoàn toàn 3 Nhiều màu xanh hơn vàng 7 Vàng, đốm nâu nhẹ 4 Nhiều màu vàng hơn xanh 8 Vàng, nhiều đốm nâu đậm 44 2.3.9.1. Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan Pha chế dung dịch tạo màng gellan được tiến hành theo phương pháp của Rojas và cộng sự năm 2007 có cải tiến [72]. Gellan được cân và hòa tan trong nước cất để đạt nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4% (w/v). Dung dịch này tiếp tục được khuấy đều ở 70oC cho đến khi tạo thành dung dịch trong suốt. Bổ sung 0,5% glycerol vào các dung dịch gellan ở trên, khuấy cho tan đều cùng lúc với sự gia nhiệt. Dung dịch tạo màng này được nhũ hóa bằng cách bổ sung axit oleic 0,2% và dầu hướng dương với nồng độ 0,025%. Hỗn dịch tiếp tục được làm phân tán đều bằng máy đồng hóa trong 5 phút ở 24 500 vòng/phút để tạo thành nhũ tương. Các dung dịch tạo màng và nhũ tương này được sử dụng cho màng bao chuối. Công thức các dung dịch tạo màng thử nghiệm được cho ở bảng 2.6. Bảng 2.6. Tỷ lệ thành phần trong các công thức dung dịch tạo màng gellan Công thức Gellan (%) Glycerol (%) Axit oleic (%) Dầu hƣớng dƣơng (%) CT 1 0,1 0,5 0,2 0,025 CT 2 0,2 CT 3 0,3 CT 4 0,4 CT 5 (Đối chứng) 0 Chuối đủ tiêu chuẩn làm thí nghiệm sẽ được bố trí ngẫu nhiên theo 05 công thức. Mỗi công thức gồm 15 quả, lặp lại 03 lần. Nhúng chuối vào dung dịch tạo màng gellan. Phân tích các chỉ tiêu hao hụt khối lượng tự nhiên, cảm quan sản phẩm và tiến hành bảo quản trong 15 ngày ở nhiệt độ phòng (20ºC ± 2). 2.3.9.2. Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan Xác định độ nhớt và pH Độ nhớt của dung dịch tạo màng gellan (Cp) được xác định bằng nhớt kế Brookfield DV-II+ Pro (USA). Giá trị pH được đo bằng thiết bị đo HANNA instruments pH213 Microprocessor pH Meter (USA). Xác định hàm lượng chất khô Xác định bằng chiết quang kế ATAGO N-1α (Nhật Bản), đơn vị đo là oBx ở 20oC. 45 Xác định thời gian khô của màng gellan Lấy 1 ml dung dịch màng gellan phủ lên đĩa petri có đường kính 10 cm. Sau đó theo dõi thời gian khô trong điều kiện phòng thí nghiệm nhiệt độ 20 ± 2oC. Khi bề mặt chế phẩm hết dính, cân định kỳ đến khi khối lượng đĩa petri không thay đổi. Thời gian khô được tính từ lúc bắt đầu phủ xong dịch lên đĩa petri đến khi khối lượng các đĩa petri không đổi. Khoảng cách mỗi lần cân là 5 phút [7]. Xác định thời hạn sử dụng dung dịch tạo màng Thời hạn sử dụng dung dịch tạo màng được xác định thông qua độ bền nhũ tương trong chế phẩm. Nếu vì lý do nào đó như thất thoát chất nhũ hóa khi dụng cụ chứa đựng hở hay thay đổi pH do vi sinh vật xảy ra sự phân tách lớp hay phân tách pha... Lấy 100ml dung dịch tạo màng cho vào các bình tam giác nút nhám 250ml. Đậy kín rồi xếp trong tủ tối thời gian 06 tháng (mẫu được giữ ở nhiệt độ phòng, để nơi thoáng, mát). Quan sát hiện tượng phân lớp của các mẫu hàng tháng và mẫu được coi là bị tách pha nếu xảy ra hiện tượng phân lớp [7]. Xác định độ bám dính của màng gellan: Xác định theo TCVN 2097 : 1993 Xác định tính chất thẩm thấu hơi nước của màng trên quả Xác định gián tiếp theo phương pháp giảm khối lượng tự nhiên của quả [3]. Coi sự mất nước của quả không phủ màng là 100%. Tính thấm hơi nước của màng cao thì tỷ lệ mất nước cao và ngược lại quả chỉ bị mất nước nhỏ khi có màng cản thấm nhiều. Chọn mẫu quả có kích thước đều nhau để có diện tích bề mặt tương đối như nhau. Sau khi xử lý vi sinh vật như nhau, chuối được để khô trong không khí rồi phủ màng. Bảo quản trong điều kiện phòng thí nghiệm. Cân khối lượng của từng quả ở mỗi công thức trước khi bảo quản và ở mỗi lần lấy mẫu bằng cân phân tích. Hao hụt khối lượng tự nhiên được tính theo công thức: Xi = (Mo-Mi)/Mo x 100 Trong đó: Xi(%): Hao hụt khối lượng tự nhiên tại thời điểm phân tích thứ i; Mi (g): Khối lượng quả tại thời điểm phân tích thứ i; Mo (g): Khối lượng quả trước bảo quản. Xác định mức độ ngăn cản trao đổi khí Được xác định theo phương pháp đo kín bằng máy đo CO2 phần trăm trong môi trường tiểu khí hậu trong bình [3]. Nồng độ CO2 được tính toán theo công thức: X= A.V.10/m.t 46 Trong đó: X (ml/kg.h): Nồng độ CO2; A (%): Tỷ lệ % CO2 đo được trong máy; m (kg): Khối lượng mẫu đưa vào thí nghiệm; t (giờ - h): Thời gian; 10: Hệ số; V(ml): thể tích của bình chứa. Phương pháp xác định sự biến đổi màu sắc Xác định sự biến đổi màu sắc vỏ quả qua từng giai đoạn bằng máy đo màu Color Meter của hãng Color Tec PCM/PSM, Mỹ. Kết quả hiện ra trên máy là các chỉ số màu L, a, b và được đối chiếu với biểu đồ màu. Trong đó: L là chỉ số thể hiện độ sáng của vỏ quả có giá trị từ 0 - 100; a là chỉ số thể hiện dải màu từ xanh lá cây đến đỏ, có giá trị từ - 60 đến + 60; b là chỉ số thể hiện dải màu từ xanh da trời đến vàng, có giá trị từ - 60 đến + 60 Độ biến đổi màu sắc của quả được xác định bằng công thức: ∆E = [(Li- Lo) 2 + (ai - ao) 2 + (bi - bo) 2 ] 1/2 Trong đó: - Li , ai, bi là kết quả đo màu ở lần phân tích thứ i - Lo , ao, bo là kết quả đo màu của nguyên liệu đầu vào Phương pháp đánh giá cảm quan - Đánh giá các chỉ tiêu về trạng thái, màu sắc của các nhóm quả nghiên cứu sau cùng thời gian bảo quản. Thành lập hội đồng đánh giá gồm 05 người. - Đánh giá theo phương pháp cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm (TCVN 3215-79). Từ đó xác định được công thức thích hợp cho tạo màng bao gellan ứng dụng trong bảo quản chuối. Số liệu được phân tích theo ANOVA. Bảng 2.7. Các chỉ tiêu đánh giá cảm qu n chuối Điểm chƣa có trọng lƣợng Chỉ tiêu cảm quan Màu sắc vỏ quả Độ cứng thịt quả Mùi thịt quả Vị của thịt quả 5 Vỏ quả màu vàng tươi, sáng đặc trưng của chuối chín tự nhiên, sáng đều, không có vết nâu. Có độ bóng của màng bảo quản Cứng đặc trưng của chuối chín tới tự nhiên. Ăn cảm giác cứng quả chuối xanh Mùi thơm đặc trưng của chuối chín tự nhiên Ngọt dịu đặc trưng của chuối chín, vẫn có vị hơi chát của chuối xanh. 47 4 Màu vàng đặc trưng của chuối chín tự nhiên, vàng sáng nhưng không đều, không có vết nâu, có độ bóng của màng bảo quản Cứng đặc trưng của chuối chín tới tự nhiên, ăn cảm giác mềm Mùi thơm đặc trưng của chuối chín, nhưng mùi hơi nồng Vị ngọt đặc trưng của chuối chín, có vị chát nhẹ 3 Màu vàng sáng tự nhiên của chuối chín, bắt đầu xuất hiện một số vết nâu Thịt quả hơi mềm, nhưng vẫn đặc trưng cho chuối chín tới Thơm đặc trưng của chuối chín, mùi hơi nồng nhiều mùi của rượu Vị ngọt đặc trưng của chuối chín, hoặc pha vị cay của rượu 2 Vỏ màu vàng nâu, xuất hiện nhiều vết màu nâu Thịt quả hơi nhũn, thịt quả mềm. Mùi hơi chua nhưng vẫn có mùi thơm của qủa chín Vị ngọt, chua mùi rượu và axit 1 Vỏ màu vàng nâu, bắt đầu có nốt thâm đen Thịt qủa nát Mùi rượu nồng, chua Vị ngọt lẫn cay của rượu, chua của axit 0 Vỏ mốc Thịt quả nhũn, có nốt mốc Mùi rượu nồng, chua Vị ngọt lẫn cay của rượu, chua của axit Hệ số trọng lượng màu sắc: 1,2; mùi: 0,8; vị: 0,8 và trạng thái 1,2. Bảng 2.8. Phiếu cho điểm củ phép thử cảm qu n Mức Điểm Mức Điểm Tốt 18,6-20,0 Kém 7,2-11,1 Khá 15,2-18,5 Rất kém 4,0-7,1 Trung bình 11,2-15,1 Hỏng 0,0-3,9 2.3.9.3. Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng Mỗi công thức gồm 45 quả (trong đó có 15 quả được phân tích cơ lý và cảm quan, 30 quả phân tích hóa sinh và đo độ cứng quả). Lặp lại 03 lần. Chuối được nhúng vào dung dịch tạo màng. 48 Phân tích các chỉ tiêu cơ lý và hóa sinh định kỳ 3 ngày/lần và tiến hành trong 18 ngày, ở nhiêt độ phòng (20 ± 2oC). Các thông số cần xác định: Xác định mức độ hao hụt khối lượng tự nhiên của quả chuối, xác định sự biến đổi màu sắc, xác định cường độ hô hấp của quả chuối, xác định hàm lượng chất rắn hòa tan, đo độ cứng quả và đánh giá cảm quan chuối. 2.3.10. Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa 2.3.10.1. Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch Sử dụng gellan khử acyl thay thế agar trong các sản phẩm thạch bằng cách hòa tan gellan khử acyl với nước theo tỷ lệ lần lượt là 0,50%; 055%; 0,60% ; 0,65% và 0,70%. Sau đó đun sôi dung dịch trong khoảng 5 phút. Tắt bếp, tiếp tục khuấy cho đến khi hết bong bóng. Đổ từ từ hỗn hợp vào khuôn. Đợi tới khi hỗn hợp trong khuôn nguội, để vào tủ lạnh trong vòng 3 giờ đồng hồ hoặc qua đêm. Đánh giá chỉ tiêu cảm quan của gel tạo thành. 2.3.10.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa Hòa tan gellan với tỷ lệ 0,60% thay thế chất tạo cấu trúc trong thành phần nguyên liệu làm thạch là agar 1,4% (các thành phần khác giữ nguyên như công thức sản xuất thạch dứa (đường, màu, hương liệu, axit...). Sau đó đánh giá khả năng hình thành gel và cảm quan sản phẩm thạch thí nghiệm và sản phẩm thạch đối chứng (dùng bằng agar). Đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm Các chỉ tiêu (màu sắc, cấu trúc độ giòn, mùi vị) của thạch thành phẩm được hội đồng gồm 05 thành viên đánh giá. Phép thử được chọn : phép thử so hàng thị hiếu đánh giá mức độ ưa thích theo thang điểm 5. Người thử được yêu cầu quan sát từ trái sang phải 5 mẫu và đánh giá vào thang cho điểm từ 1 đến 5. Các mẫu thử được mã hóa bằng các dãy số khác nhau. Bảng 2.9. Bảng điểm cảm qu n củ sản phẩm thạch dứ Tên chỉ tiêu Điểm chƣa có trọng lƣợng Yêu cầu Màu 5 Sản phẩm có màu vàng đặc trưng, sáng trong,đồng nhất. 4 Sản phẩm có màu vàng đặc trưng, đồng nhất nhưng ít trong. 3 Màu vàng của sản phẩm tương đối đặc trưng, đồng nhất, hơi tối. 2 Màu sản phẩm khá tối, khá nhạt, khá đậm, sản phẩm kém sự đồng nhất. 1 Sản phẩm có màu khác lạ. 0 Màu của sản phẩm hư hỏng. 49 Cấu trúc, độ giòn 5 Độ giòn vừa phải, không nhớt và rất mịn 4 Độ giòn vừa phải, không nhớt, ít mịn 3 Độ giòn kém, ít mịn và ít đồng nhất. 2 Hơi giòn, không mịn, chảy nước và không đồng nhất. 1 Sản phẩm không giòn, không đồng nhất và nhão 0 Biểu hiện của sản phẩm hư hỏng Mùi 5 Mùi thơm đặc trưng, hài hòa của mùi dứa và mùi phải bền 4 Mùi thơm đặc trưng, dịu, bền nhưng ít hài hòa. 3 Mùi thơm yếu, ít bền 2 Mùi thơm yếu, không bền 1 Sản phẩm có mùi thơm yếu, có lẫn mùi lạ 0 Mùi gây khó chịu của sản phẩm hư hỏng Vị 5 Vị béo, ngọt êm dịu, hòa hợp hoàn toàn, đặc trưng cho sản phẩm 4 Chưa có sự hài hòa hoàn toàn về vị của sản phẩm 3 Sản phẩm béo hoặc quá ngọt, ít có sự hài hòa về vị 2 Sản phẩm quá béo hoặc ngọt gắt, không có sự hài hòa 1 Sản phẩm có vị không đặc trung và xuất hiện vị lạ 0 Vị của sản phẩm hư hỏng Bảng 2.10. Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình củ thành viên trong hội đồng cảm qu n Cấp chất lƣợng Điểm chất lƣợng Tốt 18,6 – 20 Khá 15,2 – 18.3 Trung bình 11,2 – 15,1 Kém 7.2 – 11.1 Không sử dụng được 0 – 3,9 Đánh giá độ ổn định của sản phẩm: theo dõi sản phẩm trong vòng 03 tháng bảo quản, đánh giá chất lượng sản phẩm. 50 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. LỰA CHỌN CHỦNG CHO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GELLAN CAO Như trong phần tổng quan đã đề cập, trong hai chủng thu được của đề tài mới chỉ có chủng S. paucimobilis GL12 được nghiên cứu đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan. Trong phần này chủng S. paucimobilis GL4 sẽ được đưa ra thử nghiệm, đánh giá khả năng sinh tổng hợp làm cơ sở cho việc so sánh lựa chọn chủng thích hợp cho các nghiên cứu của luận án. 3.1.1. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4 Tương tự như tiến hành với chủng S. paucimobilis GL12 [7], nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới khả năng sinh tổng hợp gellan chủng S. paucimobilis GL4 được khảo sát với 05 nguồn cacbon (glucose, tinh bột tan, maltose, saccarose, lactose), 04 nguồn nitơ (trypton, cao nấm men, NaNO3 và (NH)2SO4). Các mẫu thí nghiệm đều thực hiện với 150ml dịch, tỷ lệ giống cấp 8% (ở tuổi giống 20 giờ), quá trình lên men ở 30oC; pH 7, lắc 200 vòng/phút. Sau 72 giờ nuôi, dịch lên men được nâng nhiệt lên 95oC trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi và đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan được miêu tả chi tiết ở mục 2.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Kết quả ở hình 3.1 cho thấy, hàm lượng gellan tạo thành trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. paucimobilis GL4 sử dụng các nguồn nitơ khác nhau có sự chênh lệch khá nhiều. Khi bổ sung nguồn nitơ hữu cơ là trypton 0,6% đã thu được hàm lượng gellan cao nhất, sau đó đến cao nấm men và khi sử dụng các nguồn nitơ là NaNO3 và (NH)2SO4 hàm lượng gellan thu được thấp. Hình 3.1. Ảnh hưởng củ các nguồn nit tới khả năng sinh tổng hợp gell n củ S. paucimobilis GL4 17,6 18,5 12,1 11,3 0 5 10 15 20 25 Cao nấm men Trypton NaNO3 (NH)2SO4 H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /L ) Nguồn nitơ (%) 51 Trong điều kiện thử nghiệm nồng độ trypton 0,6% bổ sung vào môi trường lên men là đủ để đảm bảo thu được lượng gellan cao. Kết quả này cũng giống với chủng S. paucimobilis GL12 có khả năng sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất là 27 g/l khi môi trường bổ sung 0,6% trypton [7]. Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả năng sinh tổng hợp gell n củ S. paucimobilis GL4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon Như đã biết, vi khuẩn S. paucimobilis có khả năng đồng hóa được nhiều nguồn cacbon khác nhau cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng chỉ ra, với mỗi chủng, các nguồn cacbon khác nhau cũng sẽ ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp gellan. Kết quả thu được ở hình 3.3. cho thấy, khi chủng S. paucimobilis GL4 được nuôi cấy trong môi trường với nguồn cacbon khác nhau, hàm lượng gellan thu được cũng khác nhau. Theo đó, glucose cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao nhất (18,3 g/l), tiếp đến lần lượt là tinh bột tan, sucrose, lactose và thấp nhất là maltose. Điều này cũng dễ nhận thấy do glucose là một tiền chất quan trọng tạo ra glucose- 1-P, tiếp đến tạo thành dTDP-D-glucose, dTDP-L-rhamnose và UDP-D-glucuronic acid là các tiền chất đường của phân tử gellan tổng hợp [29]. 16,2 18,5 20,3 20,4 0 5 10 15 20 25 0,4 0,5 0,6 0,7 H à m l ƣ ợ n g g el la n ( g /L ) Nồng độ trypton (%) 52 Hình 3.3. Ảnh hưởng củ các nguồn c cbon tới khả năng sinh tổng hợp gell n củ S. paucimobilis GL4 Kết quả ở hình 3.4 nhận thấy, nồng độ glucose bổ sung vào môi trường trong khoảng 3,5% - 4% cho hàm lượng gellan cao nhất tương ứng là 22,5 - 22,8 g/l. Do hàm lượng gellan thu được ở nồng độ glucose 4% chênh lệch không đáng kể so với ở nồng độ 3,5 %, do đó nồng độ glucose 3,5 % đượ

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thu_nhan_gellan_tu_sphingomonas_paucimobi.pdf
Tài liệu liên quan