Luận án Nghiên cứu tổng hợp và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất quinazolin

Nhiệt độ nóng chảy 242-243oC. Hiệu suất 87%. IR (KBr) 3146, 2922, 1623, 1578, 1528, 1492, 1416, 1356, 1235, 1047 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.97 (1H, s, NH), 9.57 (1H, s), 8.82 (1H, t, J = 2 Hz), 8.67 (1H, br.s), 8.63 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.50 (1H, s), 8.49 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 2 Hz), 8.36 (1H, dd, J = 1.5 Hz, J = 8 Hz), 7.97-7.93 (2H, m), 7.89 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.82 (1H, d, J = 8 Hz), 7.71 (1H, d, J = 8 Hz), 7.67 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.55 (1H, t, J = 8 Hz). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.9, 154.5, 149.7, 148.6, 147.7, 139.9, 137.2, 133.1, 131.6, 130.2, 129.2, 127.8, 126.3, 125.9, 123.1, 123.0, 122.5, 121.0, 120.1, 129.4, 115.2, 114.6. HRMS tìm thấy: 410.1361. Tính toán: C22H16N7O2: 410.1287 [M+H] + . 51 N-(3-(1-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)quinazoline-4-amine (120c) Chất rắn không màu. Nhiệt độ nóng chảy 267oC. Hiệu suất 72%. IR (KBr) 3124, 1620, 1599, 1571, 1521, 1490, 1410, 1344, 1228, 1033, 853 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.97 (1H, s, NH), 9.53 (1H, s), 8.65 (1H, s), 8.62 (1H, d, J = 7.5 Hz), 8.52-8.49 (3H, m), 8.33-8.29 (2H, m), 7.96 (1H, d, J = 8 Hz), 7.88 (1H, t, J = 8 Hz), 7.82 (1H, d, J = 8 Hz), 7.71-7.70 (2H, m), 7.55 (1H, t, J = 8 Hz). ESI-MS (m/z) tìm thấy: 410.1291. Theo tính toán: C22H16N7O2: 410.1287 [M+H] + . 5-(4-(3-(quinazolin-4-ylamino)phenyl)-1H-1,2,3-triazole-1-yl)-2 (trifluoromethyl) Benzonitrile (120d) Chất rắn không màu. Nhiệt độ nóng chảy 186oC. Hiệu suất 90%. IR (KBr) 3387, 2234, 1616, 1572, 1532, 1494, 1442, 1408, 1316, 1184, 1141, 1036, 926 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.92 (1H, s, NH), 9.53 (1H, s), 8.64 (1H, s), 8.59 (1H, d, J = 8 Hz), 8.52 (1H, d, J = 1.5 Hz), 8.45-8.46 (2H, m), 8.37 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.95 (1H, d, J = 8 Hz), 7.85 (1H, t, J = 7 Hz), 7.79 (1H, d, J = 8 Hz), 7.64 (2H, d, J = 8 Hz), 7.50 (1H, t, J = 8 Hz). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.9, 154.5, 149.7, 147.9, 139.9, 139.6, 137.4, 133.1, 132.7 (q, J = 31.3 Hz, Cq-CF3), 129.9, 129.2, 127.8, 126.3, 123.6, 123.2, 122.6, 121.0, 1209, 120.1, 119.3, 117.9, 115.2, 115.0, 107.7. HRMS tìm thấy: 458.1336. Theo tính toán: C24H15F3N7: 458.1263 [M+H] + . 2.4.2. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)-[1,3]dioxolo[4,5- g]quinazoline-8-amine (119b) 52 N-(3-(1-(2-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-[1,3]dioxolo[4,5- g]quinazoline-8-amine (121a) Chất rắn màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 285oC. Hiệu suất 85%. IR (KBr) 3134, 2916, 1615, 1580, 1532, 1494, 1467, 1440, 1386, 1346, 1213, 1036, 912 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.52 (1H, s, NH), 9.17 (1H, s), 8.50 (1H, s), 8.45 (1H, t, J = 2 Hz), 8.26 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 1 Hz), 8.04 (1H, s), 8.01-7.97 (2H, m), 7.92 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 1 Hz), 7.89-7.86 (1H, m), 7.63 (1H, d, J = 8 Hz), 7.50 (1H, t, J = 8 Hz), 7.19 (1H, s), 6.25 (2H, s, OCH2O). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.9, 153.0, 152.4, 148.5, 147.2, 147.1, 144.0, 140.2, 134.5, 131.3, 130.1, 129.2, 129.1, 127.5, 125.6, 122.8, 122.0, 120.4, 118.8, 110.2, 104.6, 102.3, 98.9. HRMS tìm thấy: 454.1529.Tính toán: C23H16N7O4: 454.1186 [M+H] + ; N-(3-(1-(3-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-[1,3]dioxolo[4,5-g] quinazoline-8-amine (121b) Chất rắn màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 290oC. Hiệu suất 85%. IR (KBr) 3440, 3027, 2914, 1615, 1581, 1527, 1465, 1439, 1393, 1349, 1227, 1036, 910 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.55 (2H, s), 8.81 (1H, t, J = 2 Hz), 8.49-8.46 (3H, m), 8.35 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 2 Hz), 8.06 (1H, s), 7.93 (2H, t, J = 8 Hz), 7.65 (1H, d, J = 8 Hz), 7.51 (1H, t, J = 8 Hz), 7.19 (1H, s), 6.25 (2H, s, OCH2O). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.9, 153.0, 152.4, 148.6, 147.7, 147.3, 140.2, 137.2, 131.6, 130.1, 129.2, 126.0, 123.1, 122.1, 120.5, 120.1, 118.9, 114.6, 104.7, 102.3, 98.9. ESI-MS (m/z) tìm thấy: 454.1228. Theo tính toán: C23H16N7O4: 454.1186 [M+H] + . 53 N-(3-(1-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-[1,3]dioxolo[4,5- g]quinazoline-8-amine (121c) Chất rắn màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 3210C. Hiệu suất 70%. IR (KBr) 3268, 2923, 1615, 1524, 1493, 1471, 1439, 1342, 1244, 1217, 1036, 911, 852 cm-1. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.53 (1H, s, NH), 9.51 (1H, s), 8.51-8.46 (4H, m), 8.31-8.28 (2H, m), 8.05 (1H, s), 7.93 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 1.5 Hz), 7.66 (1H, d, J = 8 Hz), 7.52 (1H, t, J = 8 Hz), 7.20 (1H, s), 6.25 (2H, s, OCH2). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.9, 153.1, 152.0, 148.6, 147.7, 147.3, 140.2, 137.3, 131.6, 130.1, 129.5, 126.2, 123.1, 122.1, 120.5, 120.4, 118.9, 114.6, 104.7, 102.3, 98.9. ESI-MS (m/z) tìm thấy: 454.1228. Theo tính toán: C23H16N7O4: 454.1186 [M+H] + . 5-(4-(3-([1,3]Dioxolo[4,5-g]quinazoline-8-ylamino)phenyl)-1H-1,2,3-triazole-1- yl)-2-(trifluoro-methyl)benzonitrile (121d) Chất rắn màu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy 256-257oC. Hiệu suất 90%. IR (KBr) 3282, 3132, 2238 (CN), 1615, 1580, 1529, 1493, 1470, 1439, 1386, 1315, 1271, 1242, 1217, 1183, 1135, 1030, 911, 845, 790, 688 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.60 (1H, s, H-triazole), 9.53 (1H, s, NH), 8.59 (1H, s, H- 19), 8.54 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-23), 8.49 (1H, s, H-2), 8.47 (2H, m, H-11, H-22), 8.14 (1H, s, H-5), 7.93 (1H, d, J = 8 Hz, H-15), 7.63 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-13), 7.52 (1H, t, J = 8 Hz, H-14), 7.19 (1H, s, H-9), 6.25 (2H, s, OCH2). 13 C-NMR (DMSO- d6, 125 MHz) δ 156.9 (C-4), 153.0 (C-2), 152.4 (C-6), 148.6 (C-9a), 148.0 (C-16), 147.3 (C-8), 140.3 (C-10), 139.7 (C-18), 137.5 (C-22), 132.7 (q, J = 32.5 Hz, C-21), 129.8 (C-12), 129.2 (C-14), 123.7 (C-23), 122.2 (C-15), 120.4 (C-13), 120.2 (C-17), 118.9 (C-11), 1181 (C-19), 115.0 (C≡N), 110.2 (C-4a), 107.7 (C-20), 104.6 (C-9), 54 102.3 (C-7), 98.9 (C-5). HRMS Theo tính toán: C25H15F3N7O2: 502.1161 [M+H] + ; Tìm thấy: 502.1233. 2.4.3. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)-7,8-dihydro- [1,4]dioxino[2,3-g]quinazoline-4-amine (119c) N-(3-(1-(2-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-7,8-dihydro [1,4] dioxino [2,3-g] quinazoline-4-amine (122a) Chất rắn màu vàng sáng. Hiệu suất: 80%. Nhiệt nóng chảy: 195oC. IR (KBr) 3134, 1603, 1568, 1531, 1505, 1415, 1348, 1289, 1220, 1066, 901 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.67 (1H, br.s, NH), 9.17 (1H, s), 8.49 (2H, s), 8.26 (1H, d, J = 8 Hz), 8.14 (1H, s), 8.02-7.97 (2H, m), 7.95 (1H, d, J = 8 Hz), 7.88 (1H, t, J = 8 Hz), 7.63 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.51 (1H, t, J = 8 Hz), 7.19 (1H, s), 4.42 (4H, d, J = 3.5 Hz, OCH2). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.7, 152.9, 149.2, 147.1, 145.7, 144.1, 143.7, 140.2, 134.5, 131.3, 130.1, 129.2, 129.1, 127.5, 125.6, 122.8, 122.1, 120.6, 118.9, 112.3, 110.0, 108.5, 64.5, 64.2. HRMS (ESI+) m/z tìm thấy: 468.1416. Theo tính toán: C24H18N7O4 [M+H] + 468.1342. N-(3-(1-(3-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-7,8-dihydro [1,4] dioxino [2,3-g] quinazoline-4-amine (122b) Chất rắn màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 295oC. Hiệu suất 84%. IR (KBr) 3432, 1618, 1564, 1529, 1502, 1408, 1351, 1288, 1227, 1067, 1040, 900, 795 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.62 (1H, s, NH), 9.53 (1H, s), 8.80 (1H, d, J = 2 Hz), 8.49-8.46 (3H, m), 8.34 (1H, dd, J = 1.5 Hz, J = 8 Hz), 8.14 (1H, s), 7.97 (1H, dd, J = 1.5 Hz, J = 8 Hz), 7.93 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.65 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.51 (1H, t, J = 8 Hz), 7.19 (1H, s), 4.41 (4H, d, J = 3 Hz, OCH2). 55 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.6, 153.0, 149.1, 148.6, 147.7, 146.1, 143.6, 140.2, 137.2, 131.6, 130.1, 129.2, 125.9, 123.1, 122.1, 120.5, 120.1, 118.9, 114.6, 112.5, 108.5, 64.5, 64.2. HRMS tìm thấy: 468.4461. Theo tính toán: C24H18N7O4: 468.1342 [M+H] + . N-(3-(1-(4-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-7,8-dihydro [1,4] dioxino [2,3-g] quinazoline-4-amine (122c) Chất rắn màu vàng nhạt. Nhiệt độ nóng chảy 278-279oC. Hiệu suất 73%. IR (KBr) 1600, 1568, 1524, 1507, 1428, 1413, 1342, 1291, 1222, 1034, 900, 852 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.62 (1H, s, NH), 9.49 (1H, s), 8.50- 8.48 (4H, m), 8.29 (2H, d, J = 9 Hz), 8.14 (1H, s), 7.97 (1H, d, J = 8 Hz), 7.65 (1H, d, J = 8 Hz), 7.51 (1H, t, J = 8 Hz), 7.19 (1H, s), 4.42 (4H, d, J = 3 Hz, OCH2). 13 C- NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.6, 153.0, 149.1, 147.9, 146.7, 146.0, 143.6, 140.9, 140.2, 123.0, 129.2, 125.6, 122.1, 120.6, 120.5, 120.0, 118.9, 112.5, 110.0, 108.4, 64.5, 64.2. HRMS tìm thấy: 468.4470. Theo tính toán: C24H18N7O4: 468.1342 [M+H] + . 5-(4-(3-((7,8-Dihydro-[1,4]dioxino[2,3-g]quinazoline-4-yl)amino)phenyl)-1H- 1,2,3-triazole-1-yl)-2-(trifluoromethyl)benzonitrile (122d) Chất rắn màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 240oC. HIệu suất 90%. IR (KBr) 3335, 2236, 1615, 1567, 1532, 1510, 1420, 1325, 1292, 1134, 1070, 902 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.61 (1H, s, NH), 9.58 (1H, s), 8.57 (1H, s), 8.53-8.49 (3H, m), 8.43 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.13 (1H, s), 7.97 (1H, d, J = 8 Hz), 7.61 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.51 (1H, t, J = 8 Hz), 7.18 (1H, s), 4.14 (4H, d, J = 2 Hz, OCH2). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 156.6, 152.9, 149.0, 147.9, 146.1, 143.6, 140.2, 139.6, 137.4, 132.6 (q, J = 32.5 Hz, Cq-CF3), 129.8, 129.1, 123.6, 56 123.1, 122.1, 120.9, 120.4, 120.1, 118.8, 118.0, 114.9, 112.5, 108.4, 107.7, 64.5, 64.1. HRMS tìm thấy: 516.1391. Theo tính toán: C26H17F3N7O2: 516.1318 [M+H] + . 2.4.4. Tổng hợp các hợp chất lai của N-(3-ethynylphenyl)-8,9-dihydro-7H- [1,4]dioxepino[2,3-g]quinazolin-4-amine (119d) N-(3-(1-(2-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-8,9-dihydro-7H-[1,4] dioxepino[2,3-g]quinazoline-4-amine (123a) Chất rắn không màu. Nhiệt độ nóng chảy 278oC. Hiệu suất 79%. IR (KBr) 2926, 1609, 1574, 1537, 1479, 1415, 1350, 1330, 1064, 991 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.81 (1H, s, NH), 9.17 (1H, s), 8.58 (1H, s), 8.48 (1H, s), 8.26 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 1 Hz), 8.18 (1H, d, J = 9 Hz), 8.02-7.97 (2H, m), 7.91 (1H, d, J = 8 Hz), 7.89 (1H, td, J = 8.5 Hz, J = 2 Hz), 7.65 (1H, d, J = 8 Hz), 7.51 (1H, t, J = 8 Hz), 7.26 (1H, d, J = 9 Hz), 4.36-4.31 (4H, m, OCH2), 2.24 (2H, t, J = 5.5 Hz, OCH2CH2CH2O). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.7, 154.3, 153.0, 147.2, 144.2, 140.1, 134.7, 131.5, 130.2, 129.4, 129.2, 127.6, 125.7, 122.9, 122.6, 121.1, 121.0, 119.4, 117.5, 70.8, 70.7, 30.9. HRMS tìm thấy: 482.1573. Theo tính toán: C25H20N7O4: 482.1499 [M+H] + . N-(3-(1-(3-nitrophenyl)-1H-1,2,3-triazole-4-yl)phenyl)-8,9-dihydro-7H- [1,4]dioxepino[2,3-g]quinazoline-4-amine (123b) Chất rắn màu vàng sáng. Nhiệt độ nóng chảy 259oC. Hiệu suất 80%. IR (KBr) 3088, 2957, 1615, 1569, 1530, 1477, 1407, 1351, 1328, 1264, 1049, 954 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.81 (1H, s, NH), 9.56 (1H, s), 8.82 (1H, t, J = 2 Hz), 8.58 (1H, s), 8.50 (1H, s), 8.49 (1H, s), 8.30 (1H, dd, J = 8 Hz, J = 1.5 Hz), 8.19 (1H, d, J = 9 Hz), 7.97-7.92 (2H, m), 7.68 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.53 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.27 (1H, d, J = 9 Hz), 4.37-4.31 (4H, m, OCH2), 2.25 (2H, t, J = 5.5 Hz, OCH2CH2CH2O). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.5, 154.1, 57 152.8, 148.6, 147.7, 140.0, 137.2, 131.6, 130.1, 129.1, 125.9, 123.1, 122.4, 120.9, 120.8, 120.1, 119.2, 117.3, 114.6, 111.5, 70.6, 70.5, 30.7. ESI-MS (m/z) tìm thấy: 482.1527. Theo tính toán: C25H20N7O4: 482.1499 [M+H] + . 5-(4-(3-((8,9-Dihydro-7H-[1,4]dioxepino[2,3-g]quinazoline-4-yl)amino)phenyl)- 1H-1,2,3-triazole-1-yl)-2-(trifluoromethyl)benzonitrile (123c). Chất màu vàng sáng. Hiệu suất: 90%. Nhiệt độ nóng chảy: 242oC. IR (KBr) 2964, 2231, 1617, 1532, 1473, 1328, 1316, 1190, 1140, 1053, 1024, 993 cm -1 . 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 9.81 (1H, s, NH), 9.62 (1H, s), 8.60-8.54 (3H, m), 8.48-8.46 (2H, m), 8.18 (1H, d, J = 9 Hz), 7.93 (1H, d, J = 8 Hz), 7.66 (1H, d, J = 8 Hz), 7.54 (1H, t, J = 8 Hz), 7.26 (1H, d, J = 9 Hz), 4.36-4.30 (4H, m, OCH2), 2.25 (2H, t, J = 5.5 Hz, OCH2CH2CH2O). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δ 157.5, 154.0, 152.8, 147.9, 144.9, 144.3, 140.0, 139.7, 137.6, 132.5, 129.8, 129.2, 123.7, 122.5, 120.9, 120.7, 120.2, 119.2, 118.1, 117.3, 115.0, 111.5, 107.8, 89.1, 70.6, 70.5, 30.7. HRMS (ESI+) m/z tìm thấy: 530.1548. Theo tính toán: C27H19F3N7O4 [M+H] + 530.1474. 2.5. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DẪN XUẤT QUINAZOLINE Các hợp chất tổng hợp được bao gồm erlotinib, các hợp chất lai của erlotinib, các dẫn xuất quinazoline được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm: ung thư biểu mô biểu bì miệng KB (Human epidermic carcinoma; CCL-17TM), ung thư gan Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma; HB - 8065 TM) và ung thư phổi LU-1 (Human Lung Carcinoma) bằng phương pháp MTT trên mô hình thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro [86]. Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37 0C; độ ẩm 98%; vô trùng 58 tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau mà lựa chọn thời gian cấy phù hợp. Quy trình thử độc tế bào: 200 l dung dịch tế bào được pha loãng ở nồng độ 3 x 105 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml và 0,5 g/ml. Ủ mẫu thử ở điều kiện 37oC, 5% CO2, thời gian 3 ngày, giếng điều khiển gồm 200 l dung dịch tế bào 3x10 4 tế bào/ml, ủ 37oC, 5% CO2, thời gian 3 ngày. Sau đó thêm 50 l MTT (1 mg/ml) pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 370C, 4 giờ. Tiếp theo loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều và đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN. Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được thể hiện ở Bảng 3.5. 2.6. NGHIÊN CỨU DOCKING CÁC HỢP CHẤT TỔNG HỢP ĐƢỢC Để chuẩn bị mô hình protein, chúng tôi thu thập và xử lý các cấu trúc tinh thể tia X của EGFR từ ngân hàng dữ liệu Protein (Protein Data Bank) (https://www.rcsb.org/): 1) EGFR hoạt hóa không đột biến mang mã 1M17 và 2ITX, 2) EGFR hoạt hóa mang đột biến L834R có mã 2ITV, và 3) EGFR không hoạt hóa mang mã 4HJO và 1XKK. Các hợp chất đã tổng hợp được xây dựng cấu trúc 3D sử dụng phần mềm LigPrep-Schrodinger (https://www.schrodinger.com/ligprep). Mô phỏng docking được thực hiện trên chương trình ICM-pro bản 3.8 (www.molsoft.com/icmpro). 59 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Như đã phân tích ở phần tổng quan, lớp chất quinazoline được biết đến như là chất ức chế mạnh mẽ các thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) của tyrosine kinase [87], là phối tử cho các thụ thể benzodiazepine và GABA trong hệ thống CNS [88,89] hoặc như chất kết dính DNA [90]. dẫn xuất Quinazoline đã cho thấy hoạt tính sinh học đáng kể như kháng viêm, kháng sinh [91-93, 94], kháng virus [95] và quan trọng nhất là khả năng chống lại các tế bào ung thư [96-100] giúp chúng trở thành một dược phẩm quan trọng được sử dụng rộng rãi trong các loại thuốc chống ung thư mới. Các hợp chất tiêu biểu bao gồm gefitinib, erlotinib, và lapatinib (Hình 1.1) đã được FDA chấp thuận và được áp dụng thành công trong phòng khám để điều trị nhiều bệnh ung thư, chẳng hạn như ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [101,102], ung thư tuyến tụy [102] và ung thư vú [103]. Dựa trên tầm quan trọng của các hợp chất này, sự tổng hợp các dẫn xuất quinazoline mới rất đang rất được quan tâm nghiên cứu. Trong phân tử 4-anilinoquinazoline, khung 4-anilinoquinazoline quyết định khả năng ức chế EGFR, còn các nhóm thế ở vị trí C-6 và C-7 quyết định tính chất hóa lý của hợp chất này [14-16]. Các nhóm aniline ở vị trí C-4 của khung quinazoline được lựa chọn phù hợp để tạo ra các tương tác kỵ nước quan trọng nhằm ức chế EGFR hiệu quả. Những nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (SAR) của các hợp chất quinazoline chỉ ra rằng kích thước và bản chất của gốc aniline quyết định sự ức chế chọn lọc enzym kinase, trong khi đó nhóm ưa nước ở vị trí C-6 của khung quinazoline làm cải thiện các tính chất vật lý có lợi cho tác dụng dược lý của thuốc [15, 16]. Do đó, luận án này tập trung nghiên cứu xây dựng quy trình tối ưu tổng hợp erlotinib hydrochloride (sơ đồ 3.1) nhằm đưa ra quy trình tổng hợp erlotinib hydrochloride có khả năng ứng dụng vào sản xuất ở Việt Nam, tổng hợp các dẫn xuất mới của quinazoline (sơ đồ 3.2) và các hợp chất lai giữa khung quinazoline với nhóm triazole (sơ đồ 3.3) để tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học lý thú. 60 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp erlotinib hydrocloride (93) Sơ đồ 3.2: Tổng hợp các dẫn xuất quinazoline chứa nhóm crown ether ở vị trí C-6, C-7 61 Sơ đồ 3.3: Tổng hợp các hợp chất lai của dẫn xuất quinazoline 119a-d với các azide qua cầu nối triazole. 3.2. TỔNG HỢP ERLOTINIB HYDROCLORIDE Erlotinib (tên thương mại Tarceva) ức chế mạnh sự phosphoryl hóa nội tế bào của HER1/EGFR giúp kìm hãm hoặc gây chết tế bào ung thư [48, 49]. Erlotinib đang được sử dụng trong điều trị bệnh nhân NSCLC giai đoạn hai và ba sau khi thất bại với ít nhất một phác đồ hoá trị. Phương pháp điều trị NSCLC bằng erlotinib có tỷ lệ đáp ứng thuốc cao và giúp kéo dài thời gian thêm cũng như nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân [50]. Đây là thuốc sắp hết hạn quyền bảo hộ nên được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm nghiên cứu tổng hợp, nhằm ứng dụng vào sản xuất thương mại. Xây dựng quy trình tối ưu cho tổng hợp thuốc erlotinib hydrochloride vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Do đó, luận án nghiên cứu xây dựng, cải tiến quy trình tổng hợp erlotinib hydrochloride với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Từ các phương pháp tổng hợp erlotinib hydrochloride được đề cập trong tài liệu tham khảo như mô tả trong các sơ đồ 1.15-1.23 và các kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm tác giả, chúng tôi thấy rằng, mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm nhất định. Hai khó khăn lớn nhất của các phương pháp là khử hóa nhóm nitro thành nhóm amine và phản ứng tổng hợp chất trung gian 4- chloroquinazoline. Để lựa chọn con đường tổng hợp thuốc này phù hợp với điều kiện ở Việt Nam, chúng tôi đã nghiên cứu kỹ các ưu và nhược điểm của từng phương pháp kết hợp với những nghiên cứu bước đầu đã lựa chọn phương pháp phù hợp để nghiên cứu, cải tiến tổng hợp erlotinib hydrochloride như trong sơ đồ 3.1. 62 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp erlotinib hydrocloride (93) (a) BrCH2CH2OCH3, K2CO3, Bu4NHSO4, DMF, 110°C; (b) H2O, CH3OH, KOH, 30 o C; (c) Urea, 210-220°C; (d) P2O5, xylene, đun hồi lưu; (e) HNO3, acid acetic băng, 0°C; (f) Na2S2O4, H2O, HCl; (g) DMF-DMA, acid acetic, toluene, 105°C; (h) 3-ethynylaniline, acid acetic, toluene, 60- 110 oC; (i) khí HCl, CH3OH, 15-20°C. Sơ đồ 3.1 được cải tiến so với các công trình nghiên cứu trước ở chỗ: sử dụng nhiều bước one-pot 2 steps hơn. Hợp chất trung gian chìa khóa 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile 108 được tổng hợp bằng phản ứng one-pot gồm 2 bước amid hóa và tách nước trong phân tử amid. Hợp chất acid 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzoic 107 được amid hóa bằng tác nhân urea ở nhiệt độ 210-220oC trong 2 giờ tạo thành hợp chất trung gian 3,4-bis(2-methoxyethoxy)- benzamid. Phản ứng tách nước tiếp theo được thực hiện trong cùng một bình phản ứng với sự có mặt của tác nhân loại nước P2O5 trong dung môi xylene ở nhiệt độ sôi 142oC. Hiệu suất của quá trình one-pot tổng hợp 3,4-bis(2-methoxyethoxy)-benzonitrile 108 là 80%. Phản ứng nitro hóa hợp chất 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzonitrile 108 với tác nhân ái điện tử là ion nitronium, ion này được tạo in situ bởi quá trình proton hóa ion nitrat trong môi trường acid acetic. Kết quả khảo sát cho thấy, nhiệt độ làm thay đổi tốc độ và hiệu suất của phản ứng. Ở 0oC phản ứng gần như không xảy ra, ở nhiệt độ phòng phản ứng kéo dài trong 24 giờ, tuy nhiên khi tăng nhiệt độ lên 50oC phản ứng kết thúc sau 2 giờ với hiệu suất trên bản mỏng TLC khoảng 90-95%. Sản phẩm nitro hoá 4,5-bis(2-methoxy-ethoxy)-2-nitro-benzonitrile 102 được sử dụng trực tiếp cho phản ứng tiếp theo mà không cần xử lý làm sạch. 63 Nhóm nitro được khử amino bằng tác nhân khử natri dithionite trong môi trường nước [116] [117]. So với các phương pháp khử truyền thống như sử dụng khí hydro trong áp suất cao hoặc tác nhân ammonium format với xúc tác Pd/C, đây là phương pháp khử đơn giản với tác nhân khử dễ tìm, phản ứng thân thiện với môi trường và hiệu suất chuyển hoá cao (> 90%). Sản phẩm khử hoá 103 được đánh giá cấu trúc bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR và IR. Erlotinib 105 được tổng hợp từ hợp chất trung gian chìa khoá 2-amino-4,5- bis(2-methoxy-ethoxy)benzonitrile 103 bằng phản ứng one-pot qua 2 giai đoạn. Hợp chất 103 phản ứng với lượng dư dimethylformamid dimethylacetal (DMF- DMA) trong hỗn hợp dung môi toluene và acid acetic tạo thành hợp chất trung gian 104 (sơ đồ 3.4). Sau đó, hợp chất 104 được đóng vòng tạo khung quinazoline bằng tác nhân 3-ethynylaniline trong môi trường acid. Để tránh tạo thành nhiều sản phẩm phụ, nhiệt độ phản ứng cần được giữ ở 60oC để phản ứng tạo thành sản phẩm trung gian benzamidin 109 xảy ra hoàn toàn, sau đó tăng nhiệt độ lên 110oC để đóng vòng và tạo thành erlotinib 105 [6]. Sản phẩm tạo thành được kết tinh 2 lần trong methanol thu được erlotinib 105 có độ sạch > 90%. Muối erlotinib hydrocloride 93 nhận được bằng cách cho khí HCl đi qua dung dịch của erlotinib trong methanol. Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của sản phẩm erlotinib. Cụ thể các proton của khung quinazoline và của nhóm aniline xuất hiện ở trường thấp: 8,63 (s, 1H, H-Ar), 7,86 (s, 1H, H-Ar), 7,76 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-Ar), 7,33 (m, 1H, H-Ar), 7,26 (m, 1H, H-Ar) và 7,20 (s, 1H, H-Ar); tín hiệu của nhóm methyn ở 3,09 ppm (s, 1H, C≡CH). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước [5-9]. Từ các dữ liệu phổ trên, khẳng định sản phẩm erlotinib được tổng hợp thành công với độ tinh khiết cao. 64 Sơ đồ 3.4: Tổng hợp erlotinib 105 từ 2-amino-4,5-bis(2-methoxy- ethoxy)benzonitrile (103) 3.2.1. Tổng hợp 3,4-bis(2-methoxyethoxy)-benzoic acid (107) Hợp chất 3,4-bis(2-methoxyethoxy)-benzoic acid 107 được tổng hợp từ nguyên liệu đầu 3,4-dihydroxybenzoic acid 106 theo sơ đồ 3.5. Sơ đồ 3.5: Tổng hợp 3,4-bis(2-methoxyethoxy)benzoic acid (107) Phản ứng O-alkyl hóa nguyên liệu đầu acid 3,4-dihydroxybenzoic 106 bằng 1- bromo-2-methoxyethan hoặc 1-chloro-2-methoxyethan với sự có mặt của kali cacbonat và xúc tác chuyển pha tetrabutyl ammonium hydrosulfat Bu4NHSO4. Ba nhóm hydroxyl của acid 3,4-hydroxybenzoic chuyển về dạng phenolat và ester nhờ xúc tác chuyển pha Bu4NHSO4 và tham gia phản ứng SN2 với 1-bromo-2- methoxyethan. Các quy trình khảo sát điều kiện phản ứng của 3,4-dihydroxybenzoic acid 106 và tác nhân alkyl hóa được miêu tả chi tiết ở bảng 3.1. Phản ứng ankyl hóa không xảy ra trong dung môi aceton ở nhiệt độ hồi lưu 56oC, trong khi đó xảy ra tốt khi thực hiện trong dung môi DMF ở nhiệt độ từ 85oC đến 110oC. Đồng thời, sử 65 dụng 1-bromo-2-methoxyethan và kali carbonate cho hiệu suất phản ứng tốt hơn so với 1-chloro-2-methoxyethan và natri carbonate. Bảng 3.1: Khảo sát phản ứng tổng hợp hợp chất 110 Quy trình Dung môi Nhiệt độ, o C Tỷ lệ acid 110 và 1-bromo-2- methoxyethane Bazơ Hiệu suất, % 1 Aceton 56 1 : 3 K2CO3 - 2 DMF 85 1 : 3 K2CO3 37 3 DMF 85 1 : 5 K2CO3 50 4 DMF 110 1 : 5 K2CO3 83 5 DMF 110 1 : 5 Na2CO3 66 6 DMF 110 1 : 5 (sử dụng 1-chloro-2-ethoxy- ethane) K2CO3 54 Dựa vào kết quả khảo sát ở bảng 3.1, thấy rằng phản ứng tổng hợp 2- methoxyethyl 3,4-bis(2-methoxyethoxy) benzoat 110 từ 3,4-dihydroxy benzoic acid 106 và 1-bromo-2-methoxyethan (tỷ lệ 1:5) với sự có mặt của xúc tác kali carbonate (4 đương lượng) và xúc tác chuyển pha tetrabuthyl ammonium hydrosunfat (0,1 đương lượng) được thực hiện trong dung môi DMF ở 110oC trong 20 giờ cho hiệu suất cao nhất 83%. Phản ứng thủy phân ester 110 được thực hiện trong hỗn hợp dung môi methanol/nước (tỷ lệ thể tích 3:1) trong môi trường kiềm KOH ở nhiệt độ phòng để tạo thành 3,4-bis(2-methoxyethoxy)-benzoic acid 107. Sau khi khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ xúc tác bazơ KOH và ester 110 đến hiệu suất phản ứng thủy phân, nhận thấy rằng tỷ lệ KOH/110 = 1/3 cho hiệu suất phản ứng cao nhất