Luận án Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của Alphitonin, Maesopsin và một số dẫn xuất của chúng

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN . i

LỜI CẢM ƠN . ii

MỤC LỤC. iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN. vii

DANH MỤC CÁC BẢNG.x

DANH MỤC CÁC HÌNH. xi

MỞ ĐẦU.1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.3

1.1. Các hợp chất flavonoid .3

1.1.1. Hợp chất flavonoid.3

1.1.2. Flavonoid glycoside .5

1.2. Hoạt tính sinh học của aurone và auronol.6

1.2.1. Aurone trong hóa học trị liệu ung thư.6

1.2.1.1. Aurone như là chất điều chỉnh sự kháng đa thuốc qua protein Pgp .6

1.2.1.2. Sự ức chế của Cyclin-Dependent Kinases (CDK).8

1.2.1.3. Tương tác của các aurone với thụ thể adenosine .9

1.2.1.4. Aurone chống ung thư thông qua sự phân chia DNA.10

1.2.1.5. Aurone ức chế hình thành mạch máu khối u .11

1.2.1.6. Aurone như những tác nhân chống oxi hóa.12

1.2.2. Aurone và auronol kháng kí sinh trùng.13

1.2.3. Aurone và auronol như tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm.14

1.2.4. Aurone như tác nhân chống virus .16

1.2.5. Aurone trong điều trị bệnh về da .17

1.2.6. Aurone trong điều trị bệnh tiểu đường.18

1.2.7. Hệ miễn dịch và ảnh hưởng của thực vật đối với hệ miễn dịch.18

1.3. Tổng hợp aurone .19

1.3.1. Giới thiệu aurone.19iv

1.3.2. Cơ sở phương pháp tổng hợp aurone.20

1.3.2.1. Phản ứng Houben - Hoesch .20

1.3.2.2. Phản ứng theo Friedel - Crafts.21

1.3.2.3. Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt .21

1.3.3. Tổng hợp aurone từ benzofuranone .22

1.3.3.1. Tổng hợp tiền chất benzofuranone .22

1.3.3.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ benzofuranone.25

1.3.4. Tổng hợp aurone từ chalcone.30

1.3.4.1. Tổng hợp tiền chất chalcone .30

1.3.4.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ chalcone .32

1.4. Tổng hợp auronol.33

1.4.1. Phương pháp tổng hợp auronol theo I.G. Sweeny.33

1.4.2. Phương pháp tổng hợp auronol theo Kiehlmann and Li.34

1.4.3. Phương pháp tổng hợp auronol theo Reik Löser .34

1.4.4. Phương pháp tổng hợp auronol theo Srikrishna và Mathews.35

1.4.5. Phương pháp bán tổng hợp auronol theo GS. Trần Văn Sung .35

1.5. Các phương pháp tổng hợp glycoside.36

1.5.1. Giới thiệu chung về glycoside .36

1.5.2. Một số phương pháp tổng hợp O-glucoside .37

1.5.2.1. Phản ứng Michael .37

1.5.2.2. Phản ứng Fischer.37

1.5.2.3. Phản ứng Koenigs-Knorr .38

1.6. Hợp chất chứa nitrile trong hóa dược và phương pháp tổng hợp dẫn xuấtnitrile .39

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.41

2.1. Đối tượng nghiên cứu .41

2.2. Mục tiêu .41

2.3. Phương pháp nghiên cứu.41

2.3.1. Phương pháp phân lập các hợp chất.41v

2.3.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm .42

2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học .43

2.3.4. Khảo sát hoạt tính ức chế miễn dịch và hoạt tính độc tế bào của các chất

tổng hợp được .43

2.3.4.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympo.43

2.3.4.2. Hoạt tính độc tế bào .44

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .46

3.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside.46

3.1.1. Phân lập các auronol glucoside từ lá cây Chay Bắc Bộ (A. tonkinensis) và

điều chế maesopsin .46

3.1.1.1. Phân lập maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (TAT2); alphitonin-

4-O-β-D-glucopyranoside (TAT6) .46

3.1.1.2. Điều chế maesopsin .48

3.1.2. Bán tổng hợp alphitonin.49

3.1.2.1. Phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh (Smilax glabra Wall ex Roxb.).50

3.1.2.2. Thủy phân astilbin điều chế taxifolin .52

3.1.2.3. Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin.53

3.1.3. Tổng hợp toàn phần các auronol alphitonin và maesopsin.54

3.1.3.1. Tổng hợp các aurone.56

3.1.3.2. Tổng hợp auronol từ aurone.61

3.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)65

3.1.5. Tổng hợp các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin, alphitonin và

maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside.67

3.1.5.1. Tổng hợp các auronol mang một nhóm thế nitrile (chất 126 và 127).68

3.1.5.2. Tổng hợp các auronol mang hai nhóm thế nitrile (chất 128 và 129).69

3.1.5.3. Tổng hợp auronol glucoside mang 1 nhóm thế nitrile (chất 130) .71vi

3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được .71

3.2.1. Hoạt tính kích thích lympho bào.71

3.2.2. Hoạt tính độc tế bào .73

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.75

4.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside.75

4.1.1. Hai hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside

(116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) .75

4.1.1.1. Điều chế auronol maesopsin (98) .83

4.1.2. Bán tổng hợp auronol alphitonin (82).86

4.1.2.1. Kết quả khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ thổ phục linh.86

4.1.2.2. Quy trình phân lập astilbin từ rễ Thổ phục linh.87

4.1.2.3. Điều chế taxifolin từ astilbin.89

4.1.2.4. Phản ứng đồng phân hóa taxifolin tổng hợp alphitonin.91

4.1.3. Nghiên cứu phương pháp tổng hợp toàn phần của các auronol.97

4.1.3.1. Nghiên cứu phương pháp tổng hợp các aurone .97

4.1.3.2. Nghiên cứu tổng hợp các auronol từ aurone.112

4.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside .126

4.1.5. Tổng hợp một số dẫn xuất nitrile của auronol 82 và 98 .131

4.1.6. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của auronol glucoside 116.144

4.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được .148

4.2.1. Hoạt tính kích thích tế bào lympho.150

4.2.2. Hoạt tính độc tế bào .151

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.154

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .156

pdf189 trang | Chia sẻ: lavie11 | Ngày: 15/12/2020 | Lượt xem: 262 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của Alphitonin, Maesopsin và một số dẫn xuất của chúng, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
cho dần vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy tiếp ở 0°C trong 30 phút rồi được cho thêm dần TBAF (2 eq) trong khoảng 30 phút sau đó đưa dần đến nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra SKLM), hỗn hợp đã được chiết với EA, dịch chiết được 65 rửa với NaHCO3 5% rồi với nước, sau đó được làm khô với Na2SO4 , được quay cất loại dung môi và tinh chế qua SKC thu được 0,076 g chất 122 (hiệu suất 21%) hoặc 0,083 g chất 93 (hiệu suất 25%). Chất 122 là chất rắn trắng. 1H-NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm) 6,63 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′); 6,53 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′); 6,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′); 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5) và 6,05 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7); 3,93, 3,77, 3,74, 3,65 (12H, 4 × s, 4 × OCH3), 3,11 (1H, d, J = 13,0 Hz, Ha-10) và 3,04 (1H, d, J = 13,0 Hz, Hb-10). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 194,6 (C=O), 174,6 (C-8), 171,1 (C-6), 157,6 (C-4), 148,4 và 148,0 ( C-3′, 4′), 126,1 (C-1′), 122,0 (C-6′), 112,6 (C-2′), 110,9 (C-5′), 106,1 (C-2), 104,6 (C-9), 94,6 và 89,4 (C-5, 7), 55,7 , 55,67 , 55,61 , 55,5 (4 × OCH3), 42,1 ( C-10). Chất 93 1H-NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,16 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,73 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,07 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5) và 5,90 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,86 , 3,85 và 3,74 (9H, 3 × s, 3-OCH3), 3,16 và 3,06 ( 2H, d, J = 14,5 Hz, Ha-10, Hb-10) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 193,4 (C=O), 173,6 và 170,7 (C-8, 6), 158,9 và 158,5 (C-4, 4′), 131,7 (C-2′, 6′), 125,5 ( C-1′), 113,4 (C-3′, 5′), 109,5 (C- 2), 104,6 (C-9), 92,8 và 88,5 (C-5, 7), 56,1 , 56,0, 55,1 (3 × OCH3), 40,5 (C-10). 3.1.4. Tổng hợp auronol glucoside alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) Phản ứng glucosyl hóa alphitonin (82) dựa trên nguyên tắc của phản ứng Koenigs-Knorr sử dụng glucopyranosyl halogenua với thử nghiệm ở các điều kiện xúc tác khác nhau như ZnCl2, CdCO3, HgI2 hoặc Ag2CO3 với K2CO3 (Bảng 4.8). Các kết quả phản ứng cho thấy sản phẩm trung gian alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124) thu được khi có mặt hỗn hợp chất xúc tác và chất xúc tiến 66 K2CO3/Cs2CO3. Sau khi loại bỏ các nhóm bảo vệ của sản phẩm đã thu được alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) theo sơ đồ Hình 3.8 Hình 3.8. Sơ đồ tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125)  Tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124) Trong một bình kín hai cổ đã được bơm hút chân không và nạp đầy khí N2, dung dịch của alphitonin (82, 912 mg; 3 mmol) trong dimethylformamid (15 mL) được làm lạnh xuống nhiệt độ 0°C, các hợp chất 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D- glucopyranosyl bromide (123, 1,36 g; 3,3 mmol), K2CO3 (912 mg; 6,6 mmol) và Cs2CO3 (1,08 g; 3,3 mmol) được lần lượt cho vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy 130 phút ở 0°C, sau đó đưa về nhiệt độ phòng và khuấy thêm 4 h cho phản ứng hết (kiểm tra bằng SKLM). Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được trung hòa bằng HCl 0,1N đến pH 6-7 và được chiết với EtOAc (2 × 30 mL). Dịch chiết EtOAc được kết hợp lại và làm khan qua Na2SO4, quay cất chân không loại dung môi. Phần cặn được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo (H2O / MeOH gradient) thu được 741 mg hợp chất 124, hiệu suất 39%. Alphitonin-4-O-β-D-tetraacetyl glucopyranoside (124): 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,66/6,64 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,57/6,53 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,52/6,48 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,02/6,01 (1H, d, J = 67 1,5 Hz, H-5), 5,96/5,93 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 5,35 (1H, t, J = 9,0 Hz, H-3′′), 5,32/5,22 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 5,23 (1H, dd, J = 8,0 , 9,0 Hz, H-2′′), 5,11 (1H, m, H-4′′), 4,33/4,31 (1H, dd, J = 5,0, 12,0 Hz, Hb-6′′), 4,18/4,11 (1H, dd, J = 1,7, 12,0 Hz, Ha-6′′), 4,09/4,02 (1H, m, H-5′′), 3,02 (2H, m, H-10), 2,00 - 2,10 (12H, 4 × OAc). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 194,9 (C=O), 174,3 (C-8), 173,5 (C- 6), 172,4, 71,6, 171,4 và 171,3 (4 × OAc), 157,7/157,5 (C-4), 145,6 (C-3′), 145,1 (C-4′), 126,5 (C-1′), 123,1/122,9 (C-6′), 118,8/118,7 (C-2′), 115,9/115,7 (C-5′), 107,4/107,1 (C-2), 103,0/102,9 (C-9), 100,1/99,4 (C-5), 99,8 (C-1′′), 94,6/94,5 (C- 7), 74,1 (C-3′′), 73,2/73,1 (C-5′′), 72,4/72,3 (C-2′′), 69,7/69,6 (C-4′′), 63,0/62,9 (C- 6′′), 42,3/42,2 (C-10), 20,8 , 20,7 , 20,6 và 20,5 (4 × OAc).  Tổng hợp alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) Trong một bình cầu 3 cổ có lắp phễu nhỏ giọt và nhiệt kế được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của 124 (634 mg; 1 mmol) trong methanol (20 mL) được làm lạnh xuống 0°C, dung dịch của NaOH/MeOH/H2O (176,0 mg, 4,4 mmol)/5 mL/5 mL được nhỏ dần vào. Hỗn hợp phản ứng được khuấy trong 30 phút ở 0°C, sau đó được trung hòa với HCl 0,1N đến pH 6-7 rồi được chiết với EtOAc (3 × 30 mL). Dịch chiết EtOAc được kết hợp lại và làm khan qua Na2SO4, quay cất chân không loại dung môi. Phần cặn được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi rửa giải (H2O/MeOH gradient) thu được 210 mg hợp chất 125 ở hiệu suất 45%. Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) có số liệu phổ trùng với số liệu phổ của chất TAT6 phân lập từ lá cây chay Bắc Bộ (Bảng 4.1 và Bảng 4.2). 3.1.5. Tổng hợp các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin, alphitonin và maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside Các dẫn xuất nitrile của auronol maesopsin (98), alphitonin (82) và maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) được tổng hợp theo sơ đồ Hình 3.9 và Hình 3.10. 68 Hình 3.9. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất nitrile của chất 82 và 98 Hình 3.10. Tổng hợp dẫn xuất nitrile của chất 116 3.1.5.1. Tổng hợp các auronol mang một nhóm thế nitrile (chất 126 và 127) Trong một bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế và được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của chất 82 (hoặc chất 98) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,069 mL; 1,1 mmol) trong dimethylacetamide (10 mL) được cho dần NaOH (44 mg; 1,1 mmol) vào. Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0°C và 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh đến 0°C và được trung hòa bằng axit HCl 1N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn 69 thô được tách trên cột silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 1 nhóm thế: chất 126 (hiệu suất 37,5%) hoặc chất 127 (39,8%). Chất 126 Alphitonin-4-O-acetonitrile ESI-MS (negative): m/z = 342 [M-H]ˉ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8,65 (2H, br s, OH), 7,51 (1H, br s, OH), 6,54 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,49 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,36 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′), 5,98 (1H, br s, H-5), 5,96 (1H, br s, H-7), 5,19 và 5,13 (2H, 2 × d, J = 16,0 Hz, OCH2-CN), 2,90 và 2,82 (2H, 2 × d, J = 14,0 Hz, CH2-10). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 192,4 (C=O), 172,3 (C-8), 169,4 (C-6), 155,5 (C-4), 144,4 (C-3′), 143,8 (C-4′), 124,6 (C-1′), 121,2 (C-6′), 117,8 (C- 2′), 116,0 (CN), 115,0 (C-5′), 105,9 (C-2), 101,3 (C-9), 94,4 (C-5), 92,3 (C-7), 53,5 (O-CH2-CN), 40,7 (C-10). Chất 127: Maesopsin-4-O-acetonitrile ESI-MS (negative): m/z = 326 [M-H]-. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 9,12 (1H, br s, OH), 7,49 (1H, br s, OH), 6,91 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,53 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 5,91 (1H, br s, H-5), 5,87 (1H, br s, H-7), 5,17 và 5,12 (2H, 2 × d, J = 16,5, O-CH2-CN), 2,93 và 2,87 (2H, 2 × d, J = 13,5 Hz, CH2-10). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 191,8 (C=O), 172,2 (C-8), 170,5 (C-6), 155,8 (C-4′), 155,5 (C-4), 131,2 (C-2′, C-6′), 124,1 (C-1′), 116,1 (CN), 114,6 (C-3′, C-5′), 105,8 (C-2), 100,6 (C-9), 94,9 (C-5), 92,4 (C-7), 53,4 (O-CH2-CN), 40,5 (C-10). 3.1.5.2. Tổng hợp các auronol mang hai nhóm thế nitrile (chất 128 và 129) Trong một bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, nhiệt kế và được nạp đầy khí N2, hỗn hợp dung dịch của chất 82 (hoặc chất 98) (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,138 mL; 2,2 mmol) trong dimethylacetamide (20 mL) được cho dần NaOH (88 70 mg; 2,2 mmol) vào. Sau đó, hỗn hợp được khuấy trong 10 phút tại 0°C và 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), hỗn hợp được làm lạnh đến 0°C và được trung hòa bằng acid HCl 1N đến pH = 6 rồi chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được kết hợp lại, được làm khan bằng Na2SO4, được cô quay dưới chân không thấp loại dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên cột silica gel pha đảo (H2O/MeOH gradient) thu được dẫn xuất nitrile 2 nhóm thế: chất 128 (hiệu suất 37%) hoặc chất 129 ( 39%). Chất 128: Alphitonin-4,6-di-(O-acetonitrile) ESI-MS (negative): m/z = 417 [M+2H2O-H]ˉ , 381 [M-H]ˉ . 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 6,64 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,55 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,51 (1H, dd, J = 2,0 , 8,0 Hz, H-6′), 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5), 5,00 – 5,12 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,10 và 3,06 (2H, d, J = 13,5, CH2-10). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,6 (C=O), 174,7 (C-8), 168,4 (C- 6), 157,0 (C-4), 145,6 (C-3′), 145,2 (C-4′), 125,9 (C-1′), 123,1 (C-6′), 118,7 (C-2′), 116,0, (CN), 115,9 (C-5′, CN), 108,1 (C-2), 106,1 (C-9), 95,9 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 42,2 (C-10). Chất 129: Maesopsin-4,6-di-(O-acetonitrile) ESI-MS (negative): m/z = 365 [M-H]ˉ . 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,58 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,39 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-5), 5,00 – 5,10 (4H, m, 2 × O-CH2-CN), 3,16 và 3,11 (2H, d, J = 14,0 Hz, CH2-10). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 196,5 (C=O), 174,6 (C-8), 168,4 (C- 6), 157,3 (C-4′), 157,0 (C-4), 132,5 (C-2′, C-6′), 125,2 (C-1′), 115,9 (CN), 115,8 (C- 71 3′, C-5′, CN), 108,1 (C-2), 106,1 (C-9), 96,01 (C-5), 92,7 (C-7), 55,0 (O-CH2-CN), 54,8 (O-CH2-CN), 41,9 (C-10). 3.1.5.3. Tổng hợp auronol glucoside mang 1 nhóm thế nitrile (chất 130) Trong bình cầu 2 cổ đã được lắp sinh hàn và nạp khí N2 cho hỗn hợp maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (1,0 mmol) và cloroacetonitrile (0,069 mL; 1,1 mmol) được hòa trong dimethylacetamide (10 mL), khuấy đều hỗn hợp và cho thêm NaOH (44 mg; 1,1 mmol) vào. Hỗn hợp được khuấy tiếp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, phản ứng được đun cách thủy ở 40°C trong 5h. Kết thúc phản ứng hỗn hợp được làm lạnh đến 0°C và trung hòa bằng acid HCl 1N cho đến khi pH =6. Tiến hành chiết với EtOAc (3 × 20 mL). Dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4, cô cạn hết dung môi thu được sản phẩm thô. Phần cặn thô được tách trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2 / MeOH = 15/1 và cột silica gel pha đảo với hệ MeOH / H2O = 4/1 cho dẫn xuất nitrile 1 nhóm thế với hiệu suất là 22%. Chất 130: Maesopsin-6-O-cyanomethyllene-4-O-β-D-glucopyranoside 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,00 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′, H-6′), 6,57 (2H, dd, J = 3,5 , 8,5 Hz, H-3′, H-5′), 6,31 (1H, br s, H- 5), 6,29 (1H, br s, H-7), 5,04 (2H, s, O-CH2- CN), 4,97 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′′), 3,90 (1H, br d, J = 12 Hz, Ha-6′′), 3,66 (1H, m, Hb-6′′), 3,59 – 3,42 (4H, m, H-2′′, 5′′, 3′′, 4′′), 3,15 và 3,11 (2H, 2 × d, J = 15,5 Hz, CH2-10). 13C-NMR (125 MHz, , CD3OD): δ (ppm) 197,7 (C=O), 174,3 (C-8), 168,8 (C- 6), 158,1/158,0 (C-4), 157,3 (C-4′), 132,5 (C-2′, C-6′), 125,2 (C-1′), 116,1 (CN), 115,8 (C-3′, C-4′), 108,0 (C-2), 106,0/105,8 (C-9), 101,8 (C-1′′), 97,1/96,8 (C-5), 92,7 (C-7), 78,6/78,5 (C-5′′), 77,5/77,4 (C-3′′), 74,1 (C-2′′), 71,3 (C-4′′), 62,4/62,3 (C-6′′), 54,7 (O-CH2-CN), 42,1/41,9 (C-10). 3.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được 3.2.1. Hoạt tính kích thích lympho bào Phân lập tế bào lympho tổng số: 72 5mL máu được lấy từ tĩnh mạch thỏ khỏe mạnh, chống đông bằng heparin và phủ lên thể tích ficoll paque tương đương. Sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng / phút trong 30 phút. Tách, thu lấy lớp giữa, loại bỏ hồng cầu còn lại bằng NH4Cl. Sau khi ly tâm, cặn tế bào được hòa lại trong HBSS. Số tế bào được đếm bằng buồng đếm neubaurer. Tế bào lympho sau khi thu nhận được hòa lại trong môi trường nuôi cấy RPMI có bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) với nồng độ tế bào 2 × 106 tế bào/mL. Xác định khả năng kích thích miễn dịch thông qua tăng sinh tế bào lympho Phép thử được thực hiện như sau: Tế bào lympho (180 L ) được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2 × 106 tế bào/mL. Các chất thử 82, 98, 116, 125 (phân lập và tổng hợp), 126, 127, 128, 129, 130 (20 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ là 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL. Concavalin A được sử dụng làm đối chứng với nồng độ là 5 g/mL, 2,5 g/mL, 1,25 g/mL và 0,625 g/mL. Mẫu được ủ trong 48h ở 37 °C, 5% CO2. 3 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (180 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng âm. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, thêm vào mỗi giếng 50 L MTT 1 mg/mL. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37° C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 100 L DMSO. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm. Chỉ số kích thích (SI – stimulate index) được tính theo công thức: Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào có SI > 1,2 sẽ được xem là có khả năng kích thích miễn dịch. Nồng độ kích thích 50% sự phát 73 triển của tế bào (SD50 – Stimulate Dose at SI= 1,5) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 3.2.2. Hoạt tính độc tế bào Nuôi cấy tế bào in vitro Các dòng tế bào được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, 1% PSF (Penicilline-Streptomycine-Fungizone), ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3 - 5 ngày với tỉ lệ (1/3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37°C, 5% CO2. Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: Chất thử 82, 98, 116, 125 (phân lập và tổng hợp), 126, 127, 128, 129, 130 (20 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/mL; 20 g/mL; 4 g/mL; 0.8 g/mL. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 L môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 °C. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của 74 chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: % ức chế = 100% - % sống sót Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2DV4. Chất thử nào có IC50 < 20 g/mL (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/mL (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT. 75 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và tổng hợp các auronol và auronol glucoside 4.1.1. Hai hợp chất auronol glucoside maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) Maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside 116 Alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside 125 Hai hợp chất maesopsin 4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β- D-glucopyranoside (125) đã được phân lập từ lá cây Chay Bắc bộ bằng các phương pháp thường quy sử dụng SKC trên diaion, silica gel pha thường, pha đảo và sephadex. Theo phương pháp đã được công bố quy trình phân lập hai auronol glucoside (chất 116 và 125) sử dụng dung môi chiết là butanol [6]. Khi tiến hành phân lập 2 hợp chất 116 và 125, từ lượng lớn mẫu lá Chay (10 kg), quy trình phân lập đã được thay đổi để không phải sử dụng butanol là một hóa chất độc hại (có mùi rất sốc và khi tiếp xúc nhiều gây đau đầu). Cao chiết ethanol thu được từ dịch chiết ethanol của lá Chay được pha loãng với nước rồi được chiết với n-hexan để loại các chất kém phân cực. Dịch nước còn lại được phân lập qua sắc ký cột trên diaion HP- 20 với hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ 0/100 50/50 và 100/0 (v/v) thu được 3 phân đoạn PA1, PA2, PA3. Trong đó, phân đoạn PA1 là các hợp chất tan trong nước bao gồm đường và các muối vô cơ, phân đoạn PA2 là hỗn hợp gồm các chất chính là chất 116 và chất 125 ngoài ra còn các chất khác là đường và một số chất kém phân cực hơn chất 116, phân đoạn PA3 là gồm các chất có độ phân cực kém hơn chất 116. Phân đoạn PA2 được phân lập bằng SKC trên silica gel với hệ dung môi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được 4 phân đoạn PB1, PB2, PB3, PB4. Phân đoạn PB2 giàu chất 116 được phân lập tiếp bằng SKC trên silica gel với 76 hệ dung môi rửa giải EA/MeOH/H2O (13/7/1, v/v/v) thu được PC1 (10 g), PC1 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9) thu được 7 g TAT2 sạch (hiệu suất tách > 0,07% so với trọng lượng mẫu khô). Phân đoạn PB3 giàu chất 125, được phân lập bằng SKC trên sephadex 2 lần với dung môi MeOH thu được PC2 (0,5 g), sau đó PC2 được phân lập tiếp bằng SKC pha đảo với hệ dung môi MeOH/H2O ở các tỉ lệ (1/4, 1/7, 1/9), quá trình được lặp lại 3 lần thu được TAT6 sạch (0,03 g, hiệu suất tách 0,0003% so với trọng lượng mẫu khô). Các số liệu phổ của chất 116 và 125 cho các tín hiệu phù hợp với cấu trúc phân tử và các dữ liệu phổ đã được công bố Bảng 4.1 và Bảng 4.2. Phổ khối ESI-MS của chất 116 và 125 cho các pic ion âm giả phân tử m/z = 449 [M-H]ˉ và 465 [M-H]ˉ phù hợp với công thức phân tử của mỗi chất C21H22O11 và C21H22O12 tương ứng. Các số liệu phổ NMR của chất 116 thể hiện chất này là một auronol glucoside, phân tử gồm có phần aglycone maesopsin gắn với phần đường glucopyranoside. Trên phổ NMR của chất 116 ta thấy có rất nhiều cặp tín hiệu rất gần nhau về độ chuyển dịch hóa học (tín hiệu kép), điều này có thể có 2 giả thiết: 1, hoặc do trong phân tử có phần aglycone có trung tâm bất đối C*-2 kết hợp với 4 trung tâm bất đối của phần đường tạo nên các diasteromer tách được trong từ trường đo; 2, hoặc do phân tử đường cồng kềnh bị cản trở bởi nhóm ketone (3- C=O) không quay tự do được mà chỉ có khả năng quay về 2 phía của mặt phẳng benzofuranone (A và C) cũng tạo nên các tín hiệu kép trong phổ NMR. Phổ 1H- NMR của chất 116 (Hình 4.1) cho các tín hiệu tù rộng của các proton OH ở vùng trường thấp với δH 9,1 và δH 7,6/7,5. Ở vùng trường thơm là các cặp tín hiệu doublet của các proton methine thơm vòng B hệ AA′XX′ ở H 6,93 (2H, H-2′, H-6′) và 6,56 (2H, H-3′, H-5′) với hằng số tương tác Jortho = 8,5 Hz, như vậy, nhóm OH thế ở vị trí C-4′. Cũng ở vùng trường thơm nhưng ở trường cao hơn là các cặp tín hiệu doublet của các proton thơm meta vòng A ở δH 6,00/6,04 và δH 5,93/5,92 (H-5, H-7) với hằng số tương tác Jmeta = 1,5 Hz, Ở vùng trường cao hơn là các tín hiệu proton OH ở δH 5,20/5,13, 5,06/ 5,01, tiếp theo là cặp tín hiệu doublet của proton methine anomeric H-1′′ của phân tử đường ở H 4,97/4,90 với hằng số tương tác J = 7,5 Hz 77 cho thấy đây là đường -D-glucopyranoside, ở trường cao hơn là cặp tín hiệu proton OH ở H 4,59/4,50 và H 3,38. Phần đường còn cho các tín hiệu của các proton methylene ở H 3,64/3,63 (br m, Ha-6′′) và ở H 3,48 (m, Hb-6′′), các tín hiệu multiplet ở vùng từ 3,29 - 3,20 ppm là tín hiệu của 4 proton methine H-3′′, H-5′′, H- 2′′ và H-4′′. Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của chất 116 (DMSO- d6) Phổ 13C-NMR (Hình 4.2) của chất 116 cũng cho các tín hiệu kép của 21 carbon bao gồm 15 tín hiệu carbon của phần aglycone thuộc khung auronol và 6 tín hiệu carbon thuộc phần đường glucopyranoside. Ở vùng trường thấp là tín hiệu của carbon carbonyl (3-C=O) ở C 192,8/192,4, tiếp theo là các tín hiệu của 4 carbon thơm liên kết với oxy ở C 171,9 (C-8), C 168,5 (C-6), C 156,8/156,7 (C-4), và C 155,9 (C-4′); sáu carbon methine thơm bao gồm 4 carbon của vòng B ở C 131,3 (C-2′, C-6′) và C 114,7, 114,6 (C-3′, C-5′) và 2 carbon methine thơm của vòng A ở 78 C 95,8/95,3 và C 91,7/91,6 (C-5 và C-7). Ở vòng A, B còn có hai carbon thơm bậc 4 của C-1′ ở C 124,2/124,17 và của C-9 ở C 102,0/101,8 và cụm tín hiệu của các carbon thuộc phần đường gồm có tín hiệu của carbon hemiacetal C-1′′ ở C 99,4/99,3, tiếp theo là các cặp tín hiệu của 4 carbon methine liên kết với oxy ở C 77,19/77,15 (C-5′′); 76,84/76,74 (C-3′′); 72,95/72,91 (C-2′′); 69,32/69,23 (C-4′′) và cặp tín hiệu của carbon methylene liên kết với oxy ở C 60,45/60,32/59,8 (C-6′′). Cuối cùng là tín hiệu của carbon methylene ở C 40,5/40,1 (CH2-10). Kết hợp với phổ HSQC (phụ lục 14), phổ HMBC (phụ lục 14) cho các tương tác xa của proton methylene nhóm CH2-10 (2,9 ppm) với C-1′ (124,20/124,17 ppm)/C-2′, C-6′ (131,3 ppm)/3-CO (192,7/192/4). Proton H-1′′ (4,90/4,97 ppm) cho tương tác xa với C-4 (156,8/156,7 ppm) chứng tỏ phần đường gắn vào C-4 của aglycone (maesopsine) cùng với độ chuyển dịch thấp bất thường của carbon C-8 (173,9 ppm) do sức căng của vòng C chứng minh cấu trúc khung auronol của chất 116. Hình 4.2. Phổ 13C-NMR của chất 116 (DMSO- d6) 79 Các số liệu phổ của chất 125 cũng khẳng định hợp chất này là một auronol glucoside, phân tử gồm có phần aglycone alphitonin gắn với phần đường glucopyranoside. Pic ion âm giả phân tử của chất 125 lớn hơn chất 116 một nhóm OH, điều này cũng thể hiện trên phổ NMR của chúng. Cũng giống chất 116, các tín hiệu trên phổ NMR (Hình 4.3; Hình 4.4) của chất 125 cũng xuất hiện các cặp tín hiệu kép. Ở vùng trường thơm, phổ 1H-NMR cho tín hiệu kép của 5 proton methine thơm gồm 3 proton thơm hệ ABX vòng B ở H 6,66/6,67 (d, J = 2,5 Hz, H-2′), H 6,57/6,55 (d, J = 8,5 Hz, H-5′) và H 6,52/6,51 (dd, J = 2,5, 8,5 Hz, H-6′); và 2 proton thơm meta vòng A ở H 6,00/5,98 (d, J = 1,2 H, H-5) và ở H 5,88/5,87 (d, J= 1,2 Hz, H-7); Ở trường cao cho tín hiệu của nhóm methylene ở H 3,04 (m, CH2- 10). Hình 4.3. Phổ 1H-NMR của chất 125 (CD3OD) Phổ 13C-NMR cho 15 tín hiệu của 15 carbon khung auronol: gồm 12 carbon thơm 2 vòng A và B, trong đó 5 tín hiệu của 5 carbon thơm liên kết với oxy ở C 174,9/174,7 (C-8), ở C 174,8/174,6 (C-6), ở C 158,4/158,3 (C-4), ở C 145,6/145,5 80 (C-3′) và ở C 145,1 (C-4′); 5 tín hiệu của 5 carbon methine thơm ở C 123,1/123,0/(C-6′), ở C 118,7/118,6 (C-2′), ở C 115,9/115,8 (C-5′); 2 carbon thơm bậc 4 ở C 126,5/126,4 (C-1′) và ở C 101,7/101,5 (C-9); Vòng C cho tín hiệu của carbon carbonyl ở C 196,0/195,8 (3-C=O) và carbon hemicetal ở C 107,6/107,5 (C-2). Các tín hiệu của phần đường cũng tương tự như phần đường của chất 116. Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu của proton hemiacetal ở H 4,88 ppm bị che phủ bởi tín hiệu rộng của nước. Ở trường cao là các tín hiệu 2 proton của nhóm methylene liên kết với oxy ở 3,88 ( br d, J =12,5 Hz, Hb-6′′) và ở 3,70 (m, Hb-6′′); ở 3,53 (dd, J = 8,0 , 9,0 Hz, H-2′′); từ 3,48-3,43 ppm là các multiplet của H-3′′, H-4′′ và H-5′′. Phổ HSQC (phụ lục 22) cho các tương tác C-H trực tiếp và HMBC (phụ lục 22) cho các tương tác xa phù hợp với cấu trúc phân tử được trình bày trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2. Hình 4.4. Phổ 13C-NMR của chất 125 (CD3OD) 81 Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-NMR của maesopsin-4-O-β-D-glucopyranoside (116) và alphitonin-4-O-β-D-glucopyranoside (125) [500MHz, CD3OD, giá trị  (ppm), J (Hz)] H Chất 125 (TAT6) Chất 116 (TAT2) (Tài liệu)# (Phân lập) (Tài liệu)# (Phân lập)*** 5 6,07 d (1,7) [6,09 d (1,7)]* 6,0/5,98 d (1.2) 6,00 br s (8 Hz) 6,00 d (1,7 Hz) 7 5,96 d (1,7) [5,98 d (1,7)] 5.88/5.87 d (1.2) 5,88 br s (≈5 Hz) 5,93 d (1,7 Hz) 10 3,05 s [3,04 d (13,9)/3,06d (14,1)] 3,04 m 3,10 s [3,09 d (14,1)/3,11 d (14)]* 2,96 và 2,90 2 × d (13,5 Hz) 2′ 6,65 d (2,0) [6,66 d (2,0)] 6,66/6,67 d (2,5) 7.01 d (8,4) 6,93/6,91 d (8,5) 3′ 6,59 d

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdftv_nghien_cuu_tong_hop_va_khao_sat_hoat_tinh_sinh_hoc_cua_alphitonin_maesopsin_va_mot_so_dan_xuat_cu.pdf
Tài liệu liên quan