Luận án Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus Thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera) - Phạm Thùy Dương

LỜI CAM ĐOAN .ii

MỤC LỤC. iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.vi

DANH MỤC BẢNG. viii

DANH MỤC HÌNH .x

MỞ ĐẦU.1

1. Đặt vấn đề .1

2. Mục tiêu nghiên cứu.2

2.1. Mục tiêu chung.2

2.2. Mục tiêu cụ thể.2

3. Nội dung nghiên cứu .3

4. Những đóng góp mới của luận án.3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .4

5.1. Ý nghĩa khoa học .4

5.2. Ý nghĩa thực tiễn.4

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.5

1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis .5

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis .5

1.1.2. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis .7

1.1.3. Đặc điểm phân loại.9

1.1.4. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis.10

1.1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng.11

1.1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp độc tố của vi

khuẩn B. thuringiensis.21

1.1.7. Nhu cầu dinh dƣỡng của Bacillus thuringiensis .23

1.1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn B. thuringiensis ở Việt Nam 26

1.2. Gen cry2.28

1.3. Hệ biểu hiện Escherichia coli .29

1.4. Côn trùng thử nghiệm .31iv

1.4.1. Ruồi nhà .31

1.4.2. Muỗi .34

1.5. Thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis .35

1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT .35

1.5.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis .38

1.5.3. Ảnh hƣởng của thuốc trừ sâu sinh học BT đến môi trƣờng và con ngƣời40

1.5.4. Tồn dƣ của thuốc trừ sâu BT.42

1.6. Bã malt bia .44

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .46

2.1. Vật liệu .46

2.1.1.Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu.46

2.1.2. Chủng vi sinh vật .46

2.1.3. Cặp mồi khuếch đại gen cry2A và hệ vector.46

2.1.4. Hóa chất .47

2.1.5. Thiết bị .47

2.1.6. Môi trƣờng nuôi cấy.48

2.1.7. Dung dịch .48

2.2. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm.49

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.49

2.3.1. Phƣơng pháp vi sinh.49

2.3.2. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học.50

2.3.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử.53

2.3.4. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men theo phƣơng pháp đáp ứng bề mặt.60

2.4. Sơ đồ nghiên cứu .64

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.66

3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các

chủng Bacillus thuringiensis.66

3.1.1. Phân lập các chủng Bacillus.66

3.1.2. Nghiên cứu protein tinh thể.69

3.1.3. Phân loại dƣới loài các chủng Bacillus thuringiensis phân lập .

3.1.4. Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập .73v

3.2. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ

hai cánh ở các chủng phân lập.74

3.2.1. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết

thanh bằng phƣơng pháp PCR .74

3.2.2. Tách dòng và đọc trình tự gen cry2A.76

3.2.3. Biểu hiện gen.84

3.2.4. Nghiên cứu tối ƣu điều kiện biểu hiện gen .88

3.2.5. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin .91

3.2.6. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8.4.92

3.3. Lựa chọn môi trƣờng và tối ƣu lên men làm tăng khả năng hình thành

protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8.4từ bã bia.94

3.3.1. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8.4 .94

3.3.2. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dƣỡng bổ sung vào dịch

thủy phân bã bia đến sinh trƣởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8.4. .100

3.3.3. Tối ƣu hóa môi trƣờng lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia.107

3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm .114

3.4.1. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men đến sinh trƣởng,hình thành bào tử và

sinh tinh thể độc của chủng MSS8.4.114

3.4.2. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà.119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.126

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƢỢC CÔNG BỐ.128

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.128

TÀI LIỆU THAM KHẢO.129

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: 305 (G-A), 500 (G-A), 783 (T-G), 1054 (T-G), 1303 (G-A), 1575 (C-T) ( chi tiết tại Hình 3.11), chủng LNT7.12 có độ tƣơng đồng 100% với chủng công bố.Trình tự nucleotide của gen cry2Aa từ chủng MSS8.4 đƣợc đƣa lên Genbank với mã số là KM588296. AJ132465.1_Cry2Aa6 AF047038.1_Cry2Aa4 M31738.1_cry2Aa1 M23723.1_Cry2Aa2 LNT7.12 MSS8.4 AJ132464.1_Cry2Aa5 D86064.1_Cry2Aa3 M23724.1_Cry2Ab1 X55416.1_Cry2Ab2 X57252.1_Cry2Ac1 M11250.1_Cry1Aa M13898.1_Cry1ab M11068.1_Cry1ac J02978.1_Cry3aa U31633.1_Cry3bb Y00423.1_Cry4aa1 D00248.1_Cry4aa2 D00247.1_Cry4ba4 X07423.1_Cry4ba1 X07082.1_Cry4ba2 M20242.1_Cry4ba3 93 100 100 60 71 100 100 94 82 100 100 62 100 99 99 0.1 80 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 A T G A A T A A T G T A T T G A A T A G T G G A A G A A C A A C T A T T T G T G A T G C G T A T A A T G T A G T A G C C C A T G A T C C A T T T A G T T T T G A A C A T A A A T C A T T A G A T A C C A T C C A A A A A G A A T G G A T G G A G M31738.1_cry2Aa1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23723.1_Cry2Aa2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D86064.1_Cry2Aa3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . A . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . G . . T . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . AF047038.1_Cry2Aa4 . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AJ132464.1_Cry2Aa5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AJ132465.1_Cry2Aa6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23724.1_Cry2Ab1 . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C G . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . G . A . . . . . G . . . . . . . C . . . . X55416.1_Cry2Ab2 . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C G . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . G . A . . . . . G . . . . . . . C . . . . X57252.1_Cry2Ac1 . . . . . . . C . . . . . . . . . . . A C . . . . . . . A T . . . . C . . . . C . . . . A C . . . . . . . . . . T . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . A G . . . . . . . . . . . . A A . . A 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 T G G A A A A G A A C A G A T C A T A G T T T A T A T G T A G C T C C T G T A G T C G G A A C T G T G T C T A G T T T T T T G C T A A A G A A A G T G G G G A G T C T T A T T G G A A A A A G G A T A T T G A G T G A A T T A T G G G G G A T A M31738.1_cry2Aa1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23723.1_Cry2Aa2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D86064.1_Cry2Aa3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . AF047038.1_Cry2Aa4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AJ132464.1_Cry2Aa5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AJ132465.1_Cry2Aa6 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23724.1_Cry2Ab1 . . . . . . . A . . A T A . . . . . . . . . . . . . C C . . . A . . . . A . T . . T . . . . . . . . . G . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . C . A . . . . . G . . . C . . A A T T . . X55416.1_Cry2Ab2 . . . . . . . A . . A T A . . . . . . . . . . . . . C C . . . A . . . . A . T . . T . . . . . . . . . G . . . . . . . . C . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . C . A . . . . . G . . . C . . A A T T . . X57252.1_Cry2Ac1 . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . A . T . . G . . . . . . . . . G G . . . . . . . C . A T . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . G . . . C A . A A T T . . 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 A T A T T T C C T A G T G G T A G T A C A A A T C T A A T G C A A G A T A T T T T A A G G G A G A C A G A A C A A T T C C T A A G T C A A A G A C T T A A T A C A G A T A C C C T T G C T C G T G T A A A T G C A G A A T T G A T A G G G C T C M31738.1_cry2Aa1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23723.1_Cry2Aa2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D86064.1_Cry2Aa3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G A . . . . . . . AF047038.1_Cry2Aa4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AJ132464.1_Cry2Aa5 . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AJ132465.1_Cry2Aa6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23724.1_Cry2Ab1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . A . . . . . . . G . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . C . . . . . . . . . . . G . . . . . . . C . . . . . . G X55416.1_Cry2Ab2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . A . . . . . . . G . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . C . . T . . . . . C . . . . . . . . . . . G . . . . . . . C . . . . . . G X57252.1_Cry2Ac1 . . T . . . . . . . . . . . . . . . . T . G . . T . . . . . . . . . . G . . . . . . . . A . C . . . . . . . . . . . . . A . . . A . . . . . . G . . . . . . G . . . . C . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G C . . . T . . T 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | MSS8.4 C A A G C G A A T A T A A G G G A G T T T A A T C A A C A A G T A G A T A A T T T T T T A A A C C C T A C T C A A A A C C C T G T T C C T T T A T C A A T A A C T T C T T C G G T T A A T A C A A T G C A G C A A T T A T T T C T A A A T A G A M31738.1_cry2Aa1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M23723.1_Cry2Aa2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D86064.1_Cry2Aa3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . AF047038.1_Cry2Aa4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 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