Luận án Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử DNA trong chӑn tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá

* Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm excel. 2.4.1.2. Đánh giá khả nĕng chống chịu với bệnh bạc lá trong điều kiện nhân tạo Phưѫng pháp lơy bệnh theo Furuya et al. (2003. Đánh giá mức kháng nhiễm theo chiều dƠi vết bệnh: Kháng (R): Chiều dƠi vết bệnh < 8cm; Nhiễm vừa (M): Chiều dƠi vết bệnh từ 8 - 12cm; Nhiễm nặng (S): chiều dƠi vết bệnh > 12cm. 2.4.1.3. Phân tích di truyền bằng sử dụng chỉ thị phân tử DNA * Tách chiết DNA: DNA được tách chiết vƠ tinh sạch theo phưѫng pháp CTAB của Doyle and Doyle (1990). * Phản ứng PCR: Theo phưѫng pháp của Chen et al. (2006) có cải tiến tùy theo chỉ thị. * Điện di sản phẩm PCR: được điện di trên gel polyacrylamide. Soi vƠ chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It. * Xử lí số liệu trong phân tích đa dạng di truyền: - Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo 6 công thức của Weir et al. (1996): PIC=1- Pi2. Trong đó Pi lƠ tần số xuất hiện của alen thứ i. - Phơn tích hệ số tưѫng đồng di truyền vƠ xơy dựng cơy quan hệ di truyền theo chưѫng trình NTSYSpc 2.1 2.4.2. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định mùi thơm và tính kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá 2.4.2.1. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen qui định mùi thơm Sử dụng các chỉ thị RG28, RM223, RM342, L06 vƠ BADH2 (4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP). Kiểm tra di truyền của các chỉ thị vƠ độ chính xác của các chỉ thị liên kết với gen thѫm fgr vƠ mùi thѫm trên quần thể phơn ly F2 của một số tổ hợp lai giữa các giống lúa thѫm vƠ không thѫm để từ đó đưa ra kết luận cho lựa chọn 2.4.2.2. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh bạc lá Sử dụng một số chỉ thị liên kết với các gen kháng với các chủng vi khuẩn gơy bệnh ӣ Việt Nam: Npb 181 vƠ RM224 (gen Xa4), RG556 vƠ RM122 (gen xa5), P3 vƠ RM5509 (gen Xa7). Kiểm tra di truyền vƠ độ chính xác của các chỉ thị liên kết với gen kháng vƠ tính kháng trên quần thể phơn ly F2 của một số tổ hợp lai giữa giống lúa kháng vƠ nhiễm để từ đó đưa ra kết luận. 2.4.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phơn phối khi bình phưѫng (2) để kiểm định kiểu gen phơn ly trong quần thể F2 theo tỷ lệ phơn ly mong đợi - Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen mùi thѫm fgr = số cá thể hạt có mùi thѫm trong số cá thể được chọn kiểu gen thѫm/tổng số cá thể hạt có mùi thѫm - Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen kháng bệnh bạc lá = số cá thể mang tính kháng trong số cá thể được chọn kiểu gen kháng/tổng số cá thể mang tính kháng. 2.4.3. Lai tạo các tổ hợp lai định hướng tạo vật liệu cho chọn lọc dòng lúa mới theo mục tiêu * Phép lai đơn: Sử dụng các dòng, giống lúa thѫm lai với các dòng, giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá (Xa4, xa5 vƠ Xa7). * Lai kép (lai nhiều bố mẹ): Tạo ra F1 tiếp tục lai với nhau để tổng 7 hợp nhiều tính trạng của nhiều giống vƠo con lai. * Lai lại (backcross): Các dòng, giống lúa thѫm đang được trồng phổ biến nhưng thiếu gen kháng bệnh bạc lá (thể nhận) lai với dòng mang gen kháng bệnh bạc lá (thể cho). Sử dụng chỉ thị phơn tử xác định gen mục tiêu để xác định cơy nhận để hỗ trợ trong phép lai. 2.4.4. Sử dụng chỉ thị phân tử chọn cá thể mang kiểu gen thơm và gen kháng bệnh bạc lá từ các thế hệ phân ly, kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo mục tiêu - Chọn lọc theo phưѫng pháp phả hệ, kết hợp với sử dụng chỉ thị phơn tử chọn gen mục tiêu ӣ các thế hệ sớm. Đối chứng lƠ giống lúa thѫm hiện trong sản xuất như HDT8, BT7. - Sử dụng chỉ thị phơn tử chọn các thể mang gen mục tiêu ӣ trạng thái đồng hợp tử từ thế hệ sớm F2 – F3 vƠ kiểm tra lại ӣ thế hệ F6 - Đánh giá vƠ chọn lọc kiểu hình theo mục tiêu ӣ các thế hệ phơn ly từ F3 – F6. Chѭѫng 3. KӂT QUҦ VÀ THҦO LUҰN 3.1. Lựa chọn chӍ thӏ phơn tử liên kӃt với gen qui đӏnh mùi thѫm vƠ tính kháng với các chӫng vi khuẩn gơy bӋnh bҥc lá lúa ӣ các tӍnh phía Bắc 3.1.1. Lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen thơm ở cây lúa 3.1.1.1. Nhận diện gen thơm fgr trong tập đoàn vật liệu lúa thơm bằng các chỉ thị liên kết Một số chỉ thị phơn tử RG28, RM223, RM342, L06 vƠ BADH2 (4 mồi ESP, IFAP, INSP vƠ EAP) đã được công bố có liên kết với gen fgr qui định tổng hợp chất 2AP tạo mùi thѫm trong cơy lúa. Sử dụng các chỉ thị nƠy để nhận diện gen mùi thѫm fgr trong các mẫu giống lúa thѫm, kết quả cho thấy: Trong 33 giống lúa có mùi thѫm, kiểu gen thѫm fgr đồng hợp tử được nhận diện bằng chỉ thị RG28 lƠ 18 giống, chỉ thị RM342 lƠ 11 giống, chỉ thị RM223 lƠ 15 giống, chỉ thị L06 lƠ 21 giống vƠ chỉ thị BADH2 lƠ 33 lƠ giống. 3.1.1.2. Phân ly tính trạng mùi thơm ở thế hệ F2 của các tổ hợp lai giữa giống lúa thơm và không thơm Kết quả cho thấy: chỉ thị L06 vƠ BADH2 có độ tin cậy cao, cho tỷ 8 lệ phơn ly nhận dạng kiểu gen thѫm fgr trên quần thể phơn ly F2 ӣ cả 2 tổ hợp lai BT7 x Q5 vƠ HT1 x KD18 với được đưa ra được gần đúng với tỷ lệ phơn ly theo lý thuyết lƠ 1 : 2: 1. Kết quả phơn tích kiểu gen kết hợp với đánh giá mùi thѫm trong hạt của quần thể phơn ly F2 ӣ mỗi tổ hợp lai được đưa ra trong bảng 3.1. Những giống có mùi thѫm vƠ mùi thѫm nhẹ được xếp vƠo nhóm thѫm. Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen mùi thѫm fgr được tính bằng số cá thể hạt có mùi thѫm trong số cá thể được chọn kiểu gen thѫm trên tổng số cá thể hạt có mùi thѫm. Kết quả cho thấy: độ chính xác của chỉ thị RG28 lƠ 64% - 74%, chỉ thị RM342 lƠ 48% - 59%, chỉ thị RM223 lƠ 43% - 47%, chỉ thị L06 lƠ 78% - 79%, chỉ thị BADH2 lƠ 91% vƠ 94%. Như vậy, chỉ thị BADH2 có độ chính xác cao nhất trong nhận diện gen thѫm frg vƠ ổn định ӣ cả 2 tổ hợp lai BT7 x Q5 vƠ HT1 x KD18. Bҧng 3.1. Phơn tích gen thѫm fgr bằng chӍ thӏ phơn tử kӃt hợp vѫi đánh giá mùi thѫm trong hҥt ӣ quҫn thể phơn ly F2 ChӍ thӏ Kiểu gen Số cá thể Thѫm Thѫm nhẹ Không thѫm Chính xác (%) BT7 x Q5 160 24 10 126 RG28 FgrFgr 53 3 1 49 64 Fgrfgr 68 1 7 60 fgrfgr 39 20 2 17 RM342 FgrFgr 62 2 3 57 59 Fgrfgr 58 5 4 49 fgrfgr 40 17 3 20 RM223 FgrFgr 47 5 4 38 47 Fgrfgr 65 3 6 56 fgrfgr 48 16 0 32 L06 FgrFgr 52 0 1 51 79 Fgrfgr 67 2 4 61 fgrfgr 41 22 5 14 BADH2 FgrFgr 50 0 0 50 95 9 ChӍ thӏ Kiểu gen Số cá thể Thѫm Thѫm nhẹ Không thѫm Chính xác (%) Fgrfgr 77 0 2 75 fgrfgr 33 24 8 1 HT1 x KD18 160 31 15 114 RG28 FgrFgr 37 2 5 30 74 Fgrfgr 70 4 1 65 fgrfgr 53 25 9 19 RM342 FgrFgr 25 3 3 19 48 Fgrfgr 85 11 7 67 fgrfgr 50 17 5 28 RM223 FgrFgr 58 8 6 44 43 Fgrfgr 75 10 2 63 fgrfgr 27 13 7 7 L06 FgrFgr 47 1 0 46 83 Fgrfgr 65 3 4 58 fgrfgr 48 27 11 10 BADH2 FgrFgr 30 0 2 28 92 Fgrfgr 80 1 1 78 fgrfgr 50 30 12 8 3.1.2. Nghiên cứu lựa chọn chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh bạc lá lúa 3.1.2.1. Phản ứng của các mẫu giống lúa vật liệu với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc Đánh giá phản ứng của các mẫu giống lúa vật liệu với 4 chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá, kết quả được đưa ra như sau: Đối với 33 mẫu giống lúa thѫm, phần lớn ӣ mức nhiễm đến nhiễm nặng với các chủng vi khuẩn gơy bệnh lơy nhiễm. Trong đó có 17 mẫu giống có phổ kháng nhiễm tưѫng tự với IR24 (nhiễm nặng), 16 mẫu giống còn lại có mức độ nhiễm thấp hѫn so với giống IR24. 10 Đối với các dòng lúa đẳng gen mang gen xa5, Xa7, Xa21 vƠ các tổ hợp 2 gen của những gen nƠy đều thể hiện tính kháng cao với các chủng vi khuẩn gơy bệnh. Mẫu giống mang gen Xa4 thể hiện mức nhiễm nhẹ với cả 4 chủng vi khuẩn. Giống IR24 ӣ mức nhiễm cao với vi khuẩn chủng 2B, chủng 3, chủng 4 vƠ ӣ mức trung bình với chủng 5A. 3.1.2.2. Mức đa hình của một số chỉ thị trên giống lúa nhiễm và kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá Kiểm tra mức đa hình của các chỉ thị liên kết với gen kháng Xa4, xa5 vƠ Xa7 trên các mẫu giống lúa kháng vƠ nhiễm với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá, kết quả cho thấy: chỉ thị Npb181 cho đa hình phơn biệt được các giống lúa nhiễm nặng (IR24, BT7) vƠ giống kháng cao (IRBB4); Chỉ thị RG556 cho đa hình phơn biệt các mẫu giống nhiễm nặng vƠ giống kháng cao (IRBB5); Đối với gen kháng Xa7, cả 2 chỉ thị chỉ thị P3 vƠ RM5509 cho đa hình phơn biệt phơn biệt được các mẫu giống nhiễm nặng (IR24, BT7) vƠ giống kháng cao (IRBB7). 3.1.2.3. Kiểm tra độ chính xác của chị thị liên kết với gen Xa4, xa5 và Xa7 ở quần thể F2 Chỉ thị Nbp181 được kiểm tra liên kết với gen kháng Xa4 ӣ tổ hợp lai BT7 x IRBB4 vƠ IR24 x IRBB4; Chỉ thị RG556 vƠ RM122 được kiểm tra liên kết với gen kháng xa5 trên tổ hợp lai HDT2 x IRBB5 vƠ IR24 x IRBB5; Chỉ thị P3 vƠ RM5509 được kiểm tra liên kết với gen kháng Xa7 trên tổ hợp lai D68-10 x IRBB7 vƠ IR24 x IRBB7. Phơn tích 160 cá thể F2 ӣ mỗi tổ hợp lai, sử dụng phưѫng pháp kiểm định “Khi bình phưѫng” (2 ) giữa tỷ lệ phơn ly kiểu gen theo lý thuyết vƠ tỷ lệ phơn ly kiểu gen thực tế được xác định bằng các mồi của chỉ thị. Kết quả cho thấy: Chỉ thị Nbp181 trong nhận diện gen Xa4, chỉ thị RG556 vƠ RM122 trong nhận dạng gen xa5, chỉ thị P3 trong nhận dạng gen kháng Xa7 trên quần thể phơn ly F2 của các tổ hợp lai có độ tin cậy cao, đưa ra tỷ lệ phơn ly kiểu gen gần đúng với tỷ lệ 1 : 2 : 1. Kết hợp với đánh giá mức kháng nhiễm của từng cá thể F2 ӣ mỗi tổ hợp lai, được trình bƠy trong bảng 3.2. 11 Bҧng 3.2. Kiểu gen kháng vƠ mӭc kháng/nhiӉm với vi khuẩn gơy bӋnh bҥc lá ӣ thӃ hӋ F2 cӫa các tә hợp lai ChӍ thӏ Kiểu gen Số cá thể Mӭc kháng/ nhiӉm Chính xác (%) R M S Nbp181 - Xa4 BT7 x IRBB4 160 84 30 46 97 RR 46 34 10 2 Rr 70 49 18 3 rr 44 1 2 41 IR24 x IRBB4 160 93 26 41 96 RR 50 38 8 4 Rr 70 55 13 2 rr 40 0 5 35 RG556 - xa5 HDT2 x IRBB5 160 47 16 97 76 RR 35 2 6 27 Rr 75 3 4 68 rr 50 42 6 2 IR24 x IRBB5 160 29 22 109 65 RR 33 0 6 27 Rr 90 2 10 78 rr 37 27 6 4 RM122 – xa5 HDT2 x IRBB5 160 47 16 97 73 RR 32 3 4 25 Rr 78 5 5 68 rr 50 39 7 4 IR24 x IRBB5 160 29 22 109 61 RR 51 3 5 43 Rr 72 3 9 60 rr 37 23 8 6 P3 - Xa7 D68-10 x IRBB7 160 111 21 28 92 RR 47 41 3 3 Rr 82 67 11 4 rr 31 3 7 21 IR24 x IRBB7 160 98 32 30 82 RR 34 27 7 0 12 ChӍ thӏ Kiểu gen Số cá thể Mӭc kháng/ nhiӉm Chính xác (%) R M S Rr 75 68 4 3 rr 51 3 21 27 RM5509 - Xa7 D68-10 x IRBB7 160 111 21 28 89 RR 53 41 9 3 Rr 72 63 5 4 rr 35 7 7 21 IR24 x IRBB7 160 96 34 30 84 RR 48 27 14 7 Rr 85 60 8 17 rr 27 9 12 6 Trên quần thể phơn ly F2, những cá thể kháng (R) vƠ nhiễm vừa (M) đều được đánh giá lƠ có tính kháng. Độ chính xác của chỉ thị liên kết với gen kháng được tính bằng số cá thể có tính kháng trong số cá thể được chọn kiểu gen kháng trên tổng số cá thể có tính kháng trong quần thể. Chỉ thị Nbp181 nhận diện gen Xa4 chính xác từ 96 - 97%; Chỉ thị RG556 nhận diện gen xa5 chính xác từ 65 - 76%; Chỉ thị RM122 nhận diện gen xa5 chính xác từ 61 – 73%; Chỉ thị P3 nhận diện gen Xa7 chính xác 82 - 92%; Chỉ thị RM5509 nhận diện gen Xa7 cũng có độ chính cao từ 84 – 89%. 3.1.2.4. Sử dụng các chỉ thị phân tử kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá trên các mẫu giống lúa vật liệu Trong vụ mùa 2011, các chỉ thị Nbp181, RG556 vƠ P3 được sử dụng để phát hiện gen kháng tưѫng ứng lƠ Xa4, xa5 vƠ Xa7 cùng với kết quả đánh giá khả nĕng kháng/nhiễm trên 51 dòng giống giống lúa vật liệu. Kết quả cho thấy: Chỉ thị Nbp181 xác định được 15 mẫu giống lúa mang gen Xa4, trong đó có 6 mẫu giống được đánh giá lƠ kháng cao, 8 mẫu nhiễm vừa vƠ 1 mẫu (chiếm 5%) được đánh giá lƠ nhiễm nặng. Với chỉ thị RG556 đã xác định được 4 mẫu giống lúa mang gen kháng xa5 ӣ trạng thái đồng hợp tử, trong đó có 3 mẫu giống được đánh giá lƠ nhiễm vừa vƠ 2 mẫu giống lƠ kháng cao. Chỉ thị P3 xác định được 4 mẫu giống lúa mang gen kháng Xa7, trong đó 2 mẫu giống được đánh giá lƠ nhiễm vừa vƠ 2 mẫu lƠ kháng cao. Như vậy, phần lớn các mẫu giống lúa mang 13 gen kháng được phát hiện bằng chỉ thị Nbp181, RG556 vƠ P3 đã thể hiện khả nĕng kháng cao vƠ nhiễm vừa với chủng vi khuẩn gơy bệnh. Đối với những kiểu gen kháng được phát hiện bằng những chỉ thị nƠy thì tỷ lệ kháng thực tế lƠ rất cao đạt từ 95 – 100%. Do vậy, sử dụng các chỉ thị nƠy để nhận diện gen kháng trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá sẽ cho độ chính xác cao. 3.2. Đánh giá đa dҥng di truyền tұp đoƠn vұt liӋu lúa thѫm kháng bӋnh bҥc lá 3.2.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học, mùi thơm và khả nĕng kháng bệnh bạc lá của các mẫu giống trong tập đoàn vật liệu 3.2.1.1. Thời gian sinh trưởng Các mẫu giống lúa có TGST trong vụ mùa tập trung trong khoảng từ 98 ngƠy đến 113 ngƠy, được phơn vƠo 2 nhóm: 4 mẫu giống thuộc nhóm cực ngắn ngƠy (TGST <100 ngƠy) vƠ 47 mẫu giống thuộc nhóm ngắn ngƠy (TGST từ 100 – 115 ngƠy). 3.2.1.2. Khả nĕng đẻ nhánh Số nhánh hữu hiệu của các mẫu giống dao động từ 4,0 nhánh đến 5,2 nhánh trong vụ xuơn vƠ từ 4,0 nhánh đến 6,9 nhánh trong vụ mùa. Trong vụ xuơn, có 37 mẫu giống thuộc nhóm đẻ nhánh ít (< 5 nhánh), 14 mẫu giống đẻ nhánh trung bình (5-8 nhánh). Trong vụ mùa, có 28 mẫu giống thuộc nhóm đẻ nhánh thấp, 23 mẫu giống thuộc nhóm đẻ nhánh trung bình. 3.2.1.3. Chiều cao cây Chiều cao cơy của các mẫu giống lúa phần lớn thuộc nhóm có chiều cao cơy thấp vƠ trung bình: từ 87,7cm đến 112,8 cm trong vụ xuơn vƠ từ 92,4cm đến 115,5 cm trong vụ mùa 3.2.1.4. Các yếu tố cấu thành nĕng suất và nĕng suất * Số bông trên khóm: Các mẫu giống lúa có số bông trên khóm tập trung ӣ mức thấp, dao động từ 4,0 bông/khóm đến 5,3 bông/khóm trong vụ xuơn vƠ từ 4,0 bông/khóm đến 6,9 bông/khóm trong vụ mùa. * Số hạt trên bông: Các mẫu giống lúa có số hạt trên bông dao động từ 135 hạt đến 187 hạt trong vụ xuơn vƠ từ 130 hạt đến 173 hạt trong vụ mùa. 14 * Tỷ lệ hạt chắc: tỷ lệ hạt chắc của các mẫu giống lúa dao động động tưѫng đối lớn, từ 75,0% đến 94,7% trong điều kiện vụ xuơn vƠ từ 71,0% đến 92,5% trong điều kiện vụ mùa. Phần lớn các mẫu giống được xếp vƠo nhóm chắc (80,4% trong vụ xuơn vƠ 90,2% trong vụ mùa) vƠ nhóm chắc cao (17,6% trong vụ xuơn vƠ 2% trong vụ mùa). * Khối lượng 1000 hạt (M1000 hạt) của các mẫu giống lúa không có sự sai khác nhiều giữa vụ xuơn vƠ vụ mùa, biến động từ 20,0g đến 27,5g. Phần lớn (47/51 mẫu giống) có M1000 hạt tập trung trong khoảng 20,0 – 25,0 g; chỉ có 4 mẫu giống có M1000 hạt từ 25,1 g đến 27,5g. * Nĕng suất hạt: Trong vụ xuơn, nĕng suất của các mẫu giống dao động từ 49,35 tạ/ha đến 93,78 tạ/ha đối với NSLT vƠ từ 46,96 đến 81,79 tạ/ha đối với NSTT. Trong vụ mùa, nĕng suất của các mẫu giống lúa dao động từ 38,73 tạ/ha đến 83,47 tạ/ha đối với NSLT vƠ từ 36,92 đến 74,12 tạ/ha đối với NSTT. Các mẫu giống được phơn nhóm theo NSTT với khoảng cách 5 tạ/ha. Với khoảng cách nƠy, 51 mẫu giống được phơn thƠnh 10 nhóm. Trong vụ xuơn, có 32 mẫu giống chiếm 63% có NSTT đạt trên 60,0 ta/ha, trong đó NSTT của 10 mẫu giống trong khoảng 75 – 80 tạ/ha vƠ 2 mẫu trong khoảng 80 – 85 tạ/ha. Trong vụ mùa, 32 mẫu giống lúa có NSTT trên 55,0 tạ, trong đó 3 mẫu giống có NSTT cao nhất, trong khoảng 70,0 – 75,0 tạ/ha. 18 mẫu giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá có NSTT ≤ 55,0 tạ/ha, phần lớn (12 mẫu giống) trong khảng 40,0 – 45,0 tạ/ha. Mục tiêu chọn tạo lƠ giống lúa thѫm, chất lượng cao, thӡi gian sinh trưӣng ≤ 110 ngƠy trong vụ mùa, nĕng suất đạt trên 60,0 tạ/ha trong vụ xuơn vƠ trên 55,0 tạ/ha trong vụ mùa. Như vậy, nguồn vật liệu khӣi đầu nghiên cứu lƠ hoƠn toƠn phù hợp về nĕng suất với mục tiêu chọn tạo đã được đưa ra. 3.2.1.5. Đặc điểm về chất lượng của các mẫu giống lúa nghiên cứu * Hình dạng hạt: trong 51 mẫu giống lúa nghiên cứu, có 19 mẫu thuộc nhóm hạt dƠi, chiếm tỷ lệ 37,3%; 31 mẫu thuộc nhóm hạt bầu, chiếm tỷ lệ 60,8% vƠ chỉ có 1 mẫu có dạng hạt tròn, chiếm tỷ lệ 2%. 15 * Tỷ lệ bạc bụng: Phần lớn các mẫu giống lúa vật liệu (47/51 mấu giống) có tỷ lệ bạc bụng ӣ mức trung bình (10 – 20% bạc bụng). * Tỷ lệ gạo nguyên: biến động từ 67,4% của mẫu giống đến 96,3%. Trong đó, 4 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên > 90%, 15 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên từ 80 – 90%, 30 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên từ 70 – 80% vƠ chỉ có 2 mẫu có tỷ lệ gạo nguyên < 70%. * Hàm lượng amylose: 51 mẫu giống lúa nghiên cứu đều thuộc nhóm nonwaxy. Trong đó, 78,4% số mẫu thuộc nhóm amylose thấp vƠ 21,6% số mẫu thuộc nhóm amylose trung bình. * Nhiệt hóa hồ: ToƠn bộ các dòng lúa đẳng gen gen kháng bệnh bạc lá (18 mẫu giống) có nhiệt hóa hồ cao. Trong 33 mẫu giống lúa thѫm chỉ có 5 mẫu thuộc nhóm có nhiệt hóa hồ cao, còn lại 28 mẫu lƠ có nhiệt hóa hồ từ thấp đến trung bình. * Mùi thơm: 33 mẫu giống được đánh giá ӣ mức thѫm vƠ thѫm nhẹ. 18 dòng lúa đẳng đẳng gen kháng bệnh bạc lá lƠ không thѫm. 3.2.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen di truyền bằng sử dụng chỉ thị phân tử DNA 3.2.2.1. Hệ số đa hình (PIC) và số allele thu được ở các mồi chỉ thị 31 mồi chỉ thị SSR cho kết quả đa hình với 81 loại allen, trung bình 2,61 allen/1 mồi. Hệ số đa hình (PIC) của 31 chỉ thị thay đổi từ 0,00 (ӣ mồi xuất hiện 1 allele) đến giá trị PIC cao nhất lƠ 0,69 (ӣ mồi xuất hiện 8 allele - RM224). Giá trị PIC trung bình của 31 cặp mồi nghiên cứu lƠ 0,31. 3.2.2.2. Mối quan hệ di truyền của các mẫu lúa nghiên cứu Hệ số tưѫng đồng di truyền của 51 giống lúa nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,36 đến 1. Ӣ hệ số tưѫng đồng di truyền 0,63 thì tổng số 51 mẫu lúa nghiên cứu được chia thƠnh 8 nhóm: Nhóm I: 19 mẫu giống vƠ được chia thƠnh 4 phơn nhóm phụ; Nhóm II: 6 mẫu giống; Nhóm III: 4 mẫu giống; Nhóm IV: 6 mẫu giống; Nhóm V: 2 mẫu giống; Nhóm VI: 12 mẫu giống vƠ được chia thƠnh 2 phơn nhóm phụ; Nhóm VII: 1 mẫu giống vƠ Nhóm VIII có 1 mẫu giống lƠ HT1. 16 3.2.3. Định hướng bố mẹ trong lai tạo giống lúa thơm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc Trên cѫ sӣ kết quả đánh giá đặc tính nông sinh học cùng với phơn tích đa dạng di truyền vƠ nguồn gen mục tiêu của 51 mẫu giống lúa trong tập đoƠn vật liệu khӣi đầu, danh sách bố mẹ được lựa chọn cho các tổ hợp lai định hướng trong chọn tạo giống lúa thѫm kháng bệnh bạc lá cho các tỉnh phía Bắc được đưa ra trong bảng 3.3 vƠ 3.4. Bҧng 3.3. Vұt liӋu lúa thѫm cho các tә hợp lai TT Tên dòng, giống Nhóm Đặc điểm chính lựa chọn cho mục tiêu chọn tҥo TGST vụ mùa (ngƠy) NSTT vụ xuơn (tạ/ha) NSTT vụ mùa (tạ/ha) HƠm lượng amylose (%) Gen thѫm Gen kháng bệnh bạc lá 1 HDT8 VI 100 81,79 66,48 17,5 fgrfgr - 2 HDT2 VI 100 79,76 66,82 15,5 fgrfgr - 3 D19-10 III 108 75,65 64,19 11,3 fgrfgr - 4 D21-10 III 106 65,30 62,91 13,8 fgrfgr - 5 D68-10 II 110 77,53 74,12 17,3 fgrfgr - 6 D26-10 IV 106 65,69 62,97 13,8 fgrfgr - 7 D127-10 VI 112 72,71 67,52 15,3 fgrfgr - 8 D257-10 VI 105 76,83 68,39 14,8 fgrfgr - 9 D227-10 VI 98 74,44 62,95 12,8 fgrfgr Xa4 10 D395-10 IV 103 78,61 64,36 16,1 fgrfgr - 11 SH8 VI 108 77,39 68,12 18,5 fgrfgr - 12 D129-10 III 106 70,49 63,60 14,2 fgrfgr - Bҧng 3.4. Nguӗn gen kháng bӋnh bҥc lá cho các tә hợp lai TT Tên dòng, giống Nhóm Gen kháng TT Tên dòng, giống Nhóm Gen kháng 1 HDT8 VI Xa4 7 IRBB4/5 I Xa4, xa5 2 D227-10 VI Xa4 8 IRBB7/10 I Xa4, Xa10 3 IRBB7 I Xa7 9 IRBB3/7 I Xa4, Xa3, Xa10 4 IRBB4 VI Xa4 10 IRBB5/7 I Xa5, Xa7 5 IRBB5/7 I Xa5, Xa7 11 IRBB5 I xa5 6 BB4/10 I Xa4, Xa10 12 IRBB21 I Xa21 17 3.3. Lai tҥo các tә hợp lai đӏnh hѭớng tҥo vұt liӋu cho chọn lọc dòng lúa mới theo mục tiêu 3.3.1. Mục tiêu chọn tạo giống mới Dựa trên yêu cầu của sản xuất tại các tỉnh phía Bắc hiện nay, tiêu chí chính cho mục tiêu chọn tạo các giống lúa thѫm, chất lượng cao cho các tỉnh phía Bắc được đưa ra như sau: Nĕng suất: ≥ 6,5 tấn/ha trong vụ xuơn vƠ ≥ 6,0 trong vụ mùa; Có mùi thѫm, hƠm lượng amylose ≤ 22%, cѫm mềm, ngon; Kháng cao đến kháng vừa (nhiễm nhẹ) với bệnh bạc lá tại các vùng sản xuất ӣ các tỉnh phía Bắc. 3.3.2. Lựa chọn bố mẹ Trên cѫ sӣ kết quả đánh giá vật liệu, di truyền của các tính trạng mục tiêu để lựa chọn bố mẹ trong các tổ hợp lai phù hợp với các tiêu chí đưa ra trong mục tiêu chọn tạo 3.3.3. Kết quả lai tạo Công việc lai tạo được bắt đầu thực hiện từ vụ xuơn 2011, 20 tổ hợp lai đã được thực hiện, danh sách được đưa ra trong Bảng 3.5. Bҧng 3.5. Danh sách các tә hợp lai theo đӏnh hѭớng TT Tên tә hợp lai TT Tên tә hợp lai 1 HDT8 x IRBB5 11 D68-10 x IRBB4/5 2 HDT8 x IRBB7 12 D68-10 x IRBB5/7 3 HDT8 x IRBB4/5 13 D257-10 x IRBB5 4 HDT8 x IRBB5/7 14 D257-10 x IRBB7 5 HDT2 x IRBB5 15 D257-10 x IRBB4/5 6 HDT2 x IRBB7 16 D257-10 x IRBB5/7 7 HDT2 x IRBB4/5 17 SH8 x IRBB5 8 HDT2 x IRBB5/7 18 SH8 x IRBB7 9 D68-10 x IRBB5 19 SH8 x IRBB4/5 10 D68-10 x IRBB7 20 SH8 x IRBB5/7 Con lai F1 của các tổ hợp lai được phơn tích gen thѫm fgr bằng chỉ thị BADH2, gen Xa4 bằng chỉ thị XNbp181, gen xa5 bằng chỉ thị RG556 vƠ gen Xa7 bằng chỉ thị P3. Những tổ hợp lai có con lai sinh trưӣng tốt, tiềm nĕng cho nĕng suất cao sẽ được tiếp tục được phát triển quần thể F2 cho chọn lọc dòng phơn ly; những cá thể mang gen thѫm fgr vƠ 2 gen kháng bệnh bạc lá ӣ các tổ hợp lai khác nhau sẽ được lựa chọn để lai với 18 nhau (trong phép lai 4); tổ hợp lai có mẹ lƠ những giống lúa cần cải tiến (HDT8, SH8), con lai F1 mang gen thѫm fgr đồng thӡi mang 1 hoặc 2 gen kháng bệnh bạc lá được sử dụng cho lai backcross. 3.3.3.1. Lai tạo các tổ hợp lai kép (4 bố mẹ) Vụ xuơn 2012, tiếp sử dụng con lai F1 của một số tổ hợp lai đã được tạo ra từ vụ xuơn 2011 để lai với nhau, danh sách như sau: 1/ (HDT8 x IRBB4/5) x (SH8 x IRBB5/7); 2/ (SH8 x IRBB5/7) x (HDT2 x IRBB4/5); 3/ (HDT8 x IRBB4/5) x (HDT2 x IRBB5/7). Con lai F1 của các tổ hợp lai được kiểm tra gen mục tiêu vƠ tự thụ đến thế hệ F6 (vụ mùa 2014) để tiến hƠnh chọn lọc dòng theo mục tiêu. 3.3.3.2. Lai backross Lai chuyển gen kháng xa5, Xa7 hoặc tổ hợp 2 gen kháng (Xa4 + xa5), (xa5 + Xa7) vƠo nền di truyền của 2 giống lúa HDT8 vƠ SH8. Sử dụng chỉ thị phơn tử để kiểm tra gen mục tiêu của con lai từ BC1F1 đến BC4F1 để xác định cơy nhận trong các lần lai lại. Vụ Xuơn 2014, con lai BC5F1 được đánh giá vƠ kiểm tra gen mục tiêu bằng chỉ thị phơn tử. Các cơy mang gen mục tiêu ӣ trạng thái dị hợp được phát triển quần thể F2 cho chọn lọc theo mục tiêu từ vụ mùa 2014. 3.4. Sử dụng chӍ thӏ phơn tử chọn cá thể mang kiểu gen thѫm vƠ gen kháng bӋnh bҥc lá từ các thӃ hӋ phơn ly, kӃt hợp với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo mục tiêu 3.4.1. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết để chọn lọc các thể mang gen mục tiêu từ thế hệ sớm Chọn lọc trên các thế hệ phơn ly của các tổ hợp lai HDT8 x IRBB5; HDT8 x IRBB7; HDT8 x IRBB4/5; HDT8 x IRBB5/7. Ӣ thế hệ F2, vụ xuơn 2012, tiến hƠnh lọai bỏ những cơy xấu, thu hạt những cơy tốt để phát riển quần thể F3. Ӣ thế hệ F3, vụ mùa 2012, tiến hƠnh chọn những cơy mang nhiều tính trạng tốt: thӡi gian sinh trưӣng ngắn ngƠy, dạng hình đẹp, cứng cơy, tiềm nĕng nĕng suất cao (bông to, dƠi, nhiều hạt, hạt xếp sít), ít nhiễm sơu bệnh thu hạt của các cá thể nƠy kết hợp với lấy mẫu lá để tiến 19 hƠnh kiểm tra gen mục tiêu bằng chỉ thị phơn tử. Tổng số 620 cá thể F3 được chọn kiểu hình từ 4 tổ hợp lai, trong đó chọn được 112 cá thể mang kiểu gen mục tiêu đồng hợp tử. Ӣ các thế hệ chọn lọc tiếp theo, gen mục tiêu luôn ӣ trạng thái đồng hợp tử nên chúng tôi chỉ quan tơm chọn lọc theo kiểu hình theo mục tiêu. 3.4.2. Đánh giá và chọn lọc theo mục tiêu đối với các các dòng lúa mang gen mục tiêu 3.4.2.1. Kết quả chọn lọc trên các thế hệ phân ly Ӣ thế hệ F4, vụ xuơn 2013, trên 55 dòng được chọn theo các dạng phơn ly đặc trưng về thӡi gian sinh trưӣng, chiều cao cơy, thoát cổ bông vƠ các yếu tố cấu thƠnh nĕng suất... tổng số được 386 cá thể để phát triển thế hệ dòng chọn F5. Thế hệ F5, vụ mùa 2013, tiến hƠnh chọn được 225 cá thể phơn ly theo các dạng đặc chưng. Các cá thể nƠy sẽ được gieo thƠnh dòng trong vụ xuơn 2014 cho chọn lọc dòng thế hệ F6. 19 dòng tốt có độ đồng đều tưѫng đối cao được chọn để đánh giá dòng trong vụ xuơn 2014. 3.4.2.2. Đánh giá dòng chọn theo mục tiêu * Kết quả kiểm tra gen mục tiêu của các dòng lúa Vụ xuơn 2014, các dòng lúa ӣ thế hệ F6 được kiểm tra gen thѫm vƠ gen kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phơn tử. Kết quả kiểm tra đã đưa ra sự sai khác về kiểu gen mục tiêu ӣ 3/19 dòng lúa chọn từ thế hệ F3 so với thế hệ F6 (bảng 3.6) * Đánh giá khả nĕng kháng bệnh bạc lá và mùi thơm trong hạt của các dòng lúa: Vụ xuơn 2014, các dòng lúa được đánh mức kháng/nhiễm với các chủng vi khuẩn gơy bệnh bạc lá bằng lơy nhiễm nhơn tạo. Đồng thӡi các dòng lúa nƠy cũng được thu hạt dề phơn tích mùi thѫm trong hạt. - Đánh giá bệnh bạc lá: kết quả cho thấy có 15/19 dòng chọn thể hiện mức kháng cao đến nhiễm vừa, đưѫng với mức kháng/nhiễm của các dòng đối chứng IRBB4, IRBB5 vƠ IRBB7; 2 dòng T94.32-2 vƠ T25.74-3 xác định không có gen kháng nhưng vẫn thể hiện mức nhiễm vừa với các chủng vi khuẩn; 2 dòng T7.11-4, T94.29-5 vƠ T27.88-5 được 20 xác định có gen kháng nhưng vẫn nhiễm nặng đến nhiễm vừa với c