Luận văn Căn nguyên gây nhiễm khuẩn tiết niệu và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập tại khoa phục hồi chức năng ở bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01 - 12 / 2018

g vi khuẩn. MALDI là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lượng laser (Matrix - assisted laser desorption ionization, MALDI). Nguồn MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn. Các ô trống trên đĩa sau khi được phết khuẩn lạc lên sẽ được phủ matrix (hoặc đầu tiên nhỏ dung dịch acid formic, sau đó để khô và sau đó phủ matrix) sau đó để khô, và đĩa đích được đặt vào máy đo khối phổ. Matrix sẽ tách các phân tử protein vi khuẩn hoặc nấm, bảo vệ chúng khỏi phân mảnh và không bị hấp thụ bởi năng lượng laser, phần lớn năng lượng laser bị hấp thụ bởi matrix, chuyển nó thành trạng thái ion hoá. Phần mềm máy tính so sánh khối phổ thu được với dữ liệu trong thư viện tham chiếu để đưa ra một danh sách các vi sinh vật gần giống nhất và có xếp hạng điểm. Hình 1.19. Hệ thông máy định danh MALDI - TOF. Tuỳ thuộc vào giá trị phù hợp thế nào, vi khuẩn cần định danh có thể xác định được họ, chi hoặc loài. Thời gian để phân tích vi khuẩn là 30 phút, có thể lên tới 96 mẫu bệnh phẩm. Các hệ thống này có ưu điểm là cho kết quả định danh nhanh và chính xác. Nhược điểm của hệ thống này là cơ sở dữ liệu chưa rộng, vẫn phải cập nhật thêm. Ngoài ra, một số trường hợp không phân biệt được các vi khuẩn có phổ protein giống nhau. Ví dụ như E. coli và Shigella 34 không phân biệt được bằng MALDI - TOF. Burkholderia pseudomallei không thể xác định được vì cơ sở dữ liệu của MALDI - TOF không có, thay vào đó là Burkholderia thailandensis. 1.4.4.3. Sinh học phân tử a) SeptiFast real - time PCR (Roche) PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần, đó có thể là gen đơn hoặc là một phần của gen nhờ hoạt động xúc tác của enzyme xác định vi khuẩn Gram dương và Gram âm và một số loài nấm. SeptiFast đã được so sánh trực tiếp với trên 82 mẫu nước tiểu được nuôi cấy của 81 bệnh nhân nghi ngờ NKTN. Các mẫu nước tiểu được xử lý mà không cần ủ trước và DNA được chiết xuất từ các tế bào trong nước tiểu để phân tích PCR. Xét nghiệm cho ta thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng là 82% và 60% để phát hiện nhiễm khuẩn tiết niệu [74]. b) FilmArray (bioMérieux) và GeneXpert (Cepheid) Kỹ thuật này đã tích hợp chiết xuất axit nucleic và PCR ghép kênh, vì vậy người dùng cuối chỉ cần trộn mẫu với dung dịch đệm và áp dụng nó vào hộp thử nghiệm. Xét nghiệm này nó có khả năng phát hiện vi khuẩn gây nhiễm khuẩn lây truyền qua đường tình dục chẳng hạn như bệnh lậu Chlamydia trachomatis và Neisseria, trong vòng 90 phút trực tiếp từ mẫu nước tiểu. Độ nhạy và độ đặc hiệu của việc phát hiện các căn nguyên này đều trên 97% trong các mẫu từ nam và nữ. Tuy nhiên, giống như hệ thống SeptiFast, xét nghiệm GeneXpert hiện tại có tính chất định tính và không biết số lượng vi khuẩn từ các mẫu nước tiểu, điều này rất quan trọng đối với chẩn đoán nhiễm khuẩn tiết niệu. Nhược điểm của phương pháp này là không làm được kháng sinh đồ cho bệnh nhân. 1.5. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHẠY CẢM 1.5.1. Phương pháp kháng sinh khuếch tán 1.5.1.1. Phương pháp kháng sinh đồ khoanh giấy kháng sinh khuếch tán [39], [40], [51]. 35 Kỹ thuật này xác định mức độ nhạy cảm với các kháng sinh của các chủng vi khuẩn dựa trên nguyên lý khuếch tán (định tính). Thuốc kháng sinh được thấm vào những khoanh giấy với nồng độ nhất định, có đường kính thường là 6 mm và được đặt tại một điểm trên bề mặt đĩa thạch dàn đều chủng vi khuẩn. Kháng sinh từ khoanh giấy khuếch tán ra môi trường xung quanh. Độ khuếch tán phụ thuộc vào tính chất của từng loại kháng sinh và độ dày của môi trường. Vì vậy, càng xa nơi đặt khoanh giấy, nồng độ kháng sinh càng thấp và ngược lại, càng gần nơi đặt khoanh giấy, nồng độ kháng sinh càng cao. Nơi có thuốc kháng sinh, chủng vi khuẩn không phát triển được gọi là vùng ức chế. Đường kính vùng ức chế của từng loại thuốc kháng sinh tùy thuộc vào quy định của hãng. Tuy nhiên, vì sự ức chế tăng trưởng của vi khuẩn không có nghĩa là cái chết của vi khuẩn, phương pháp này có thể phân biệt tác dụng diệt khuẩn và kìm khuẩn. Hình 1.20. Kết quả kháng sinh đồ của chủng P. aeruginosa. Kĩ thuật khuếch tán đĩa cung cấp nhiều lợi thế so với các phương pháp khác: đơn giản, chi phí thấp, khả năng kiểm tra số lượng lớn vi sinh vật và dễ dàng giải thích kết quả. Hơn nữa, một số nghiên cứu đã chứng minh sự quan tâm lớn ở những bệnh nhân bị nhiễm vi sinh vật trong một liệu pháp kháng sinh dựa trên kháng sinh của tác nhân gây bệnh [71]. 1.5.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ dải giấy khuếch tán theo bậc nồng độ (Etest). Kỹ thuật này xác định chính xác nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh với các chủng vi khuẩn hiếu khí dễ nuôi cấy. Phương pháp kháng khuẩn này 36 kết hợp nguyên tắc của phương pháp pha loãng với phương pháp khuếch tán để xác định giá trị Etest, là một phiên bản thương mại của kỹ thuật này [29], [32]. Kháng sinh được thấm vào dải giấy với nồng độ thấm lượng kháng sinh khác nhau ở các vị trí khác nhau trên dải giấy. Có 29 nồng độ kháng sinh được pha loãng bậc 2 gắn cố định ở một mặt của dải giấy. Thuốc kháng sinh từ dải giấy khuếch tán ra môi trường xung quanh. Độ khuếch tán phụ thuộc vào tính chất của từng loại thuốc và độ dày của môi trường. Khi dải giấy được đặt lên mặt thạch đã dàn vi khuẩn ở các bậc có nồng độ nhanh chóng khuếch tán trong thạch. Giá trị Etest được xác định tại giao điểm của dải và hình elip ức chế tăng trưởng. Kỹ thuật này cũng có thể được thực hiện để điều tra sự tương tác kháng khuẩn giữa hai loại thuốc [105]. Hình 1.21. Kết quả Etest của chủng K. pneumonie. Ưu điểm của phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, dễ dàng giải thích kết quả. Phương pháp này trở nên tốn kém nếu nhiều loại kháng sinh được thử nghiệm. 1.5.2. Phương pháp kháng sinh đồ pha loãng Phương pháp kháng sinh đồ pha loãng là phương pháp xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh được thử nghiệm trong môi trường canh thang hoặc môi trường thạch. Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất của chất kháng sinh đã được thử nghiệm có tác dụng ức chế sự tăng 37 trưởng của vi sinh vật được biểu thị bằng hàm lượng μg/mL hoặc mg/L. Các tiêu chuẩn đánh giá, thử nghiệm kháng sinh đã được công nhận bởi Viện chuẩn hóa xét nghiệm và lâm sàng (CLSI), đã cung cấp một quy trình thống nhất để thử nghiệm trong hầu hết các phòng xét nghiệm vi sinh. 1.5.2.1. Pha loãng trên canh thang kháng sinh Phương pháp pha loãng trên canh thang là phương pháp nuôi cấy một lượng vi khuẩn nhất định vào các ống (giếng canh thang) có nồng độ kháng sinh xác định (thường giảm dần theo bậc 2) nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi sinh vật. Hình 1.22. Kháng sinh đồ pha loãng trong môi trường canh thang. Ưu điểm của phương pháp này là xác định nồng độ ức chế tối thiểu với độ chính xác cao. Đảm bảo ổn định nồng độ kháng sinh trong môi trường nên áp dụng được tất cả kháng sinh. Nhược điểm chính của phương pháp này là thực hiện thủ công mất rất nhiều thời gian và công sức, yêu cầu người thực hiện có chuyên môn cao, nhiều thao tác nhỏ nhặt nên có nhiều nguy cơ sai sót, cần phải có thiết bị hỗ trợ đọc ghi lại kết quả phát hiện sự tăng trưởng trong giếng. Tuy nhiên, nhược điểm này có thể hạn chế bằng sử dụng các kit thương mại đã được kiểm chứng mặc dù cho chi phí cao. 1.5.2.2. Pha loãng trên thạch Phương pháp pha loãng trên thạch là phương pháp nuôi cấy một lượng vi khuẩn nhất định vào các đĩa thạch có nồng độ kháng sinh xác định (thường giảm dần theo bậc 2) nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh 38 đối với vi sinh vật. Hình 1.23. Kháng sinh đồ pha loãng trong thạch. Giống như phương pháp pha loãng trên canh thanh kháng sinh, ưu điểm của phương pháp này cho độ chính xác cao, đảm bảo ổn định nồng độ kháng sinh trong môi trường. Tuy nhiên, phương pháp này có thể áp dụng cho một số loại vi khuẩn khó mọc. 1.5.3. Hệ thống tự động 1.5.3.1. Máy VITEK Xác định chủng vi khuẩn nhạy cảm hoặc kháng các loại thuốc chống vi khuẩn (định lượng). Thẻ AST dành cho VITEK 2 COMPACT là phương pháp thử nghiệm tự động dựa trên kĩ thuật kháng sinh đồ pha loãng. Mỗi thẻ AST có giếng chứng chỉ chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Các giếng còn lại chứa số lượng kháng sinh cụ thể đã được đo trước kết hợp với môi trường nuôi cấy. Huyền dịch vi sinh vật để thử nghiệm phải được pha loãng tới nồng độ chuẩn hóa trong nước muôi sinh lý 0,45% trước khi được sử dụng để bù nước lại môi trường có kháng sinh bên trong thẻ. Sau đó thẻ được làm đầy, bịt kín và đặt vào màng ủ đầu đọc của thiết bị. Thiết bị giám sát sự phát triển của từng giếng trong thẻ qua một khoảng thời gian xác định tối đa 36 tiếng. Sau khi hoàn thành chu kỳ ủ, các giá trị của MIC được xác định cho từng kháng sinh chứa trên thẻ. 1.5.3.2. Máy M50 Xác định chủng vi khuẩn nhạy cảm hoặc kháng các loại thuốc chống vi 39 khuẩn. Áp dụng phương pháp đo độ đục kết hợp với chỉ thị oxi hóa khử nhằm phát hiện nhanh nồng độ ức chế tối thiểu MIC của mỗi vi sinh vật tương ứng với mỗi kháng sinh đồ có trên thanh panel. Sự kết hợp giữa đo độ đục và chỉ thị oxy hóa khử trong thực hiện kháng sinh đồ mang lại kết quả nhanh nhất và chính xác nhất có thể. Trong 1 thanh panel có chứa nhiều kháng sinh và mỗi kháng sinh được thiết kế với nhiều nồng độ khác nhau. Dãy nồng độ của mỗi kháng sinh giảm dần theo cấp số nhân (pha loãng bậc hai). Đặc điểm này giúp hệ thống Phoenix trả kết quả MIC thực, không trả kết quả MIC nội suy. Ngoài kết quả kháng sinh, hệ thống còn phát hiện các đề kháng quan trọng: Extended Spectrum β - lactamase (ESBL), Methicillin - resistance Staphylococci (MRS), Vancomycin resistance Enterococcus (VRE), High - level aminoglycoside resistance (HLAR), Gram Positive β - lactamase (GP - BL), Macrolide resistance Streptococcus (MLSB). 40 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thực hiện tại khoa Vi sinh, Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2018 đến tháng 12/2018. 2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Tất cả các bệnh nhân và chủng vi khuẩn phân lập được chẩn đoán NKTN nằm điều trị tại khoa PHCN - Bệnh viện Bạch Mai. 2.2.1. Tiêu chuẩn chọn mục tiêu cho NKTN Tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập của các bệnh nhân được chẩn đoán NKTN nằm điều trị tại khoa PHCN - Bệnh viện Bạch Mai. 2.2.2. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân cho mục tiêu ca bệnh giám sát Tiêu chuẩn chẩn đoán ca bệnh NKTN Tất cả các chủng vi khuẩn nuôi cấy có số lượng ≥ 105 CFU/ml và phải thỏa mãn điều kiện UTI - A: + Bệnh nhân có đặt sonde tiểu dài ngày (≥ 5 ngày). + Cấy nước tiểu dương tính với không hơn 2 loài vi khuẩn. + Ít nhất một vi khuẩn nuôi cấy có số lượng ≥ 105 CFU/ml. + Có một trong các triệu chứng sau: • Sốt (> 38°C thân nhiệt trung tâm) • Đau nhẹ vùng trên xương mu • Mót tiểu • Tiểu buốt • Tiểu dắt Ca bệnh giám sát nhiễm khuẩn tiết niệu do catheter - Người bệnh có đủ tiêu chuẩn chẩn đoán NKTN [32] và có thêm một trong những dấu hiệu sau: + Có ống thông tiểu giữ lưu đã đặt được hơn > 2 ngày lịch vào ngày biến cố, với ngày thay catheter là ngày 1. Hoặc 41 + Có ống thông giữ lưu đã đặt được hơn > 2 ngày lịch nhưng rút vào ngày biến cố kiện hoặc ngày trước ngày biến cố. 2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ Các chủng vi khuẩn trên cùng một bệnh nhân trùng với chủng đã được chọn từ những bệnh nhân đó. 2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.3.1. Bệnh phẩm Bệnh phẩm được khoa PHCN - Bệnh viện Bạch Mai lấy theo quy định lấy bệnh phẩm xét nghiệm vi sinh của Bệnh viện Bạch Mai. 2.3.2. Môi trường nuôi cấy, định danh và làm kháng sinh đồ vi khuẩn 2.3.1.1. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn - Thạch máu - Thạch UTI agar 2.3.1.2. Môi trường làm kháng sinh đồ vi khuẩn - Thạch Muller Hilton 2.3.1.3. Các hóa chất khác - PYR - Huyết tương thỏ (xác định men catalase) - Thuốc thử Oxydase, Kowac - Nước muối sinh lý 0,9% - Các khoanh giấy kháng sinh phục vụ làm kháng sinh đồ - Bộ thuốc nhuộm Gram 2.3.1.4. Các dụng cụ khác - Ống nghiệm vô trùng - Tăm bông vô trùng 42 - Lam kính - Que cấy ria phân vùng - Que cấy định lượng 1µl, 10µl - Các máy móc thiết bị + Hệ thống máy định danh VITEK 2 COMPACT, MALDI - TOF + Kính hiển vi với vật kính x40, x100 + Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn (tủ ấm 37°C) + Thước đo mm + Máy tính cài phần mềm đọc kháng sinh đồ Whonet 5.6 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Thiết kế nghiên cứu Sử dụng phương pháp mô tả cắt ngang để khảo sát trên 728 mẫu nước tiểu được nuôi cấy tại khoa PHCN. 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu Tất cả các chủng vi khuẩn đủ tiêu chuẩn được lựa chọn vào nghiên cứu theo phương pháp lấy mẫu thuận lợi nhằm: Mô tả các đặc điểm NKTN, tỷ lệ của các tác nhân gây NKTN, NKTN bệnh viện. Mối liên hệ giữa các triệu chứng lâm sàng. Yếu tố nguy cơ liên quan đến NKTN bệnh viện. Tình hình nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được. 2.4.3. Phương pháp thu thập số liệu - Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ tất cả các bệnh phẩm chỉ định nuôi cấy ở Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01 - 12/2018. - Tất cả các bệnh nhân vào khoa PHCN - Bệnh viện Bạch Mai điều trị nội trú chẩn đoán bị chấn thương tủy sống từ tháng 1 - 12/2018 được nuôi cấy nước tiểu dương tính. - Các số liệu thu thập được ghi chép vào mẫu bệnh án của bệnh nhân. 43 2.4.4. Quy trình nghiên cứu: Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu. Soi nhuộm Gram (nhận định sơ bộ hình thể) Dương tính Nhuộm Gram Bệnh phẩm Nuôi cấy, phân lập Xác định tính chất sinh vật hóa học Âm tính Loại Xác định vi khuẩn gây bệnh Kháng sinh đồ Thu thập thông tin Chọn BN nghiên cứu Có NKTN bệnh viện Không NKTN bệnh viện Xác định tỷ lệ NKTN BV Theo dõi và phòng ngừa Tìm hiểu các chỉ số nghiên cứu: sốt, tiểu rắt, tiểu buốt Tổng hợp số liệu, phân tích và xử lý 44 2.4.5. Các bước tiến hành 2.4.5.1. Xử lý bệnh phẩm ❖ Quan sát nước tiểu: Màu sắc, độ trong đục, có máu... ❖ Soi trực tiếp: • Nhuộm Gram nước tiểu không ly tâm: Có giá trị định hướng - Lấy 10ml nước tiểu đã được lắc kỹ (không ly tâm) nhỏ lên lam kính, để khô tự nhiên. Có thể cố định bằng methanol. - Phát hiện số lượng tác nhân gây bệnh trên một vi trường vật kính dầu. Một VK gây bệnh quan sát được x 1000 tương đương với một khuẩn lạc được đếm là 105/ml nước tiểu. - Sự có mặt của nhiều tế bào biểu mô và nhiều loại vi khuẩn khác nhau gợi ý đến tình trạng nhiễm bẩn. 2.4.5.2. Nuôi cấy - Sử dụng que cấy : * Que cấy định lượng 1µl: Nuôi cấy nước tiểu giữa dòng. * Que cấy định lượng 10µl: Cấy nước tiểu qua sonde, nước tiểu chọc hút qua bàng quang. - Nuôi cấy: * Lắc kỹ lọ nước tiểu (không ly tâm) * Cầm đầu ăng thẳng đứng, lấy đầy một ăng nước tiểu (tạo màng trên ăng). * Thạch máu: Cấy trải đều lên bề mặt thạch máu. Sử dụng ăng, tạo một đường thẳng giữa trung tâm của đĩa thạch, sau đó ria khắp mặt thạch vuông góc với đường thẳng giữa. Ủ ấm đĩa thạch máu 35 - 37ºC. * Thạch UTI agar: Cấy phân vùng trên môi trường ủ ấm 35 - 37ºC khí trường thường 18 - 24 giờ. - Định danh các vi khuẩn gây bệnh phân lập được. 45 2.4.5.3. Đọc kết quả - Âm tính: Sau 48 giờ không có vi khuẩn gây bệnh mọc trên các môi trường nuôi cấy. - Nước tiểu nhiễm bẩn: Nếu mọc ≥ 3 loại vi khuẩn. - Dương tính * Đếm số lượng + Que cấy định lượng 1µl cấy nước tiểu giữa dòng: Đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch máu nhân với hệ số 1.000 sẽ là số CFU/1 ml nước tiểu. + Que cấy định lượng 10 µl cấy nước tiểu qua sonde, chọc hút bàng quang: Đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch máu nhân với hệ số 100 sẽ là số CFU/ml nước tiểu. * Đếm số lượng từng loại khuẩn lạc + < 105 CFU/ml: kèm theo có bạch cầu đa nhân hoặc triệu chứng lâm sàng rõ thì nghĩ đến vi khuẩn gây bệnh. + ≥ 105 CFU/ml: thì chắc chắn và vi khuẩn gây bệnh, định danh và kháng sinh đồ. * Tham khảo kết quả nhuộm Gram + Soi có ≥ 1 vi khuẩn/vi trường: chắc chắn có nhiễm khuẩn, số lượng > 105 CFU/ml. + Soi có > 5 BCĐN/vi trường: Chắc chắn có nhiễm khuẩn. + Soi có 1 - 5 BCĐN/vi trường: Nghi ngờ có nhiễm khuẩn. 2.4.6. Định danh và làm kháng sinh đồ 2.4.6.1. Định danh * Thử nghiệm trên môi trường Chromogenic UTI Agar + Là môi trường để phát hiện chủng vi khuẩn qua hiển thị màu sắc của khuẩn lạc, trong môi trường chứa sẵn chất hiển thị màu đặc trưng cho từng loại vi khuẩn 46 + Dùng que cấy lấy một phần khuẩn lạc vi khuẩn đã nuôi cấy trên môi trường hoặc thạch máu 18 - 24 giờ ria trên đĩa Chromogenic UTI Agar. + Nhận định sơ bộ kết quả dựa trên màu sắc và tính chất nhuộm Gram Thứ tự Màu khuẩn lạc Vi khuẩn 1 Xanh lam Enterococcus 2 Hồng E.coli 3 Nâu Protues, Morganella 4 Xanh hoặc nâu huỳnh quang Pseudomonas 5 Vàng hoặc trắng Staphylococcus 6 Xanh tím than Klebsiella * Định danh trên máy MALDI - TOF Nguyên lý: MALDI là thuật ngữ chỉ phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lượng laser. Mẫu được xử lý, làm tinh sạch bằng nhiều phương pháp khác nhau. Sau đó, mẫu phân tích được trộn với các chất nền chứa các phân tử hữu cơ nhỏ có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở những bước sóng nhất định. Hỗn hợp mẫu và chất nền được đưa lên khay và bay hơi tạo thành các hạt tinh thể bám với peptid. Dưới tác dụng của nguồn năng lượng laser cực lớn chiếu vào làm cho các chất nền hấp thụ năng lượng và bật ra các photon. Mẫu được hấp thụ photon và năng lượng sẽ được đi vào hệ thống khối phổ. Cách tiến hành - Chuẩn bị mẫu: + Phết khuẩn lạc lên đĩa target, tạo lớp mỏng đồng nhất. Làm khô ở nhiệt độ phòng. + Thêm 1µl dung dịch HCCA matrix lên trên mẫu, để khô ở nhiệt độ phòng. - Đưa đĩa vào hệ thống + Đảm bảo Target carrier đang ở vị trí Out. + Mở nắp và đưa đĩa target vào vùng đặt đĩa. 47 + Đóng nắp sau khi đã đưa đĩa target vào. + Nhấn nút MALDI target plate IN/OUT một lần. - Chờ kết quả. Kết quả sẽ tự động ra. Nhận định kết quả: Kết quả so sánh sự tương đồng của phổ protein thu được từ mẫu vi khuẩn với cơ sở dữ liệu, cho phép định danh chính xác các loại vi khuẩn bằng công nghệ tiên tiến nhất. * Định danh trên máy VITEK 2 COMPACT Nguyên lý: Dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hóa học của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ. Cách tiến hành - Lấy thẻ xét nghiệm ra khỏi tủ lạnh và để nhiệt độ phòng. - Chuẩn bị huyền dịch để định danh. + Lấy 3ml NaCl 0,9% từ Dispenser cho vào ống nghiệm và pha huyền dịch. + Huyền dịch vừa pha lắc đều, đưa vào máy Densichek để đo độ đục - Lấy thẻ từ túi bảo vệ và đặt vào cassette. Đưa cassette vào buồng hút. Nhấn Start Fill. Đóng cửa Loading Station. - Nhập thông tin casstte và bệnh nhân vào máy. - Chờ kết quả. Kết quả sẽ tự động ra. Nhận định kết quả: Kết quả được so sánh chuỗi phản ứng sinh hóa với cơ sở dữ liệu có sẵn cho từng loại vi khuẩn. Phần trăm xác suất được thể hiện nhằm đánh giá tương thích của kết quả phản ứng trong cơ sở dữ liệu. 2.4.6.2. Kháng sinh đồ * Phương pháp khoanh giấy khuếch tán Nguyên lý: Dùng khoanh giấy vô khuẩn có đường kính và độ dày nhất định, tẩm sẵn kháng sinh có nồng độ quy định, đặt lên đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn. Đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn quanh khoanh giấy kháng sinh, để xác định đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Cách tiến hành: - Chuẩn bị canh khuẩn: + Dùng que cấy lấy 3 - 5 khuẩn lạc có hình thái giống nhau ghiền vào 48 nước muối sinh lý 2 ml, lắc đều. + So sánh độ đục của ống canh khuẩn tương đương 0,5. - Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn, ép nhẹ vào thành ống. - Đặt đĩa lên máy ria để canh khuẩn dàn đều trên mặt thạch. - Dùng kim tiêm vô trùng để đặt khoanh giấy kháng sinh lên mặt thạch. - Tối đa đặt 7 khoanh trên mặt đĩa, để vào trong tủ ấm 35 ± 2°C trong vòng 16 - 18 giờ. Nhận định kết quả: Đo đường kính vùng ức chế của các chủng vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhân, so sánh với bảng giới hạn đường kính vùng ức chế theo CLSI (2018) để đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh theo 3 mức độ: S (susceptible), I (intermediate), R (resistant) [40]. * Phương pháp xác định ESBL (Extended spectrum beta - lactamase) Nguyên lý: Là một loại men β - lactamase có hoạt phổ rộng, thường gặp trong các chủng vi khuẩn đường ruột đặc biệt là Klebsiella sp., E. coli Gen sinh ESBL nằm trên plasmid, đột biến từ các gen sản xuất β - lactamase. Bản chất hoạt lực của ESBL(+) chính là khả năng thủy phân các cephalosporin trừ cephamycin, các penicillin trừ temocylin, aztreonam và monobactam. Cách tiến hành: - Chuẩn bị chủng vi khuẩn xác định ESBL gồm có: E. coli, Klebsiella sp., P. mirabilis - Chuẩn bị canh khuẩn + Dùng que cấy lấy 3 - 5 khuẩn lạc có hình thái giống nhau ghiền vào nước muối sinh lý 2ml, lắc đều. + So sánh độ đục của ống canh khuẩn tương đương 0,5. - Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn, ép nhẹ vào thành ống. - Đặt đĩa lên máy ria để canh khuẩn dàn đều trên mặt thạch. - Đặt 4 khoanh giấy kháng sinh, ceftazidime (CAZ), ceftazidime/acid clavulanic (CCAZ), cefotaxime (CTX), cefotaxime/acid clavulanic (CCTX) lên mặt thạch. Mỗi khoanh giấy cách thành đĩa từ 1,0 - 1,5mm, cách nhau từ 2,0 - 2,5mm. - Để vào trong tủ ấm 35 ± 2°C trong vòng 16 - 18 giờ. Nhận định kết quả: Đo đường kính vùng ức chế của 4 khoanh giấy kháng 49 sinh. Nếu đường kính của khoanh giấy kháng sinh có phối hợp ceftazidime/acid clavulanic, cefotaxime/acid clavulanic với kháng sinh không phối hợp ceftazidime, cefotaxime ≥ 5mm thì thử nghiệm xác định ESBL(+). 2.5. XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU Nhập, xử lí và phân tích số liệu theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Whonet 5.6. 2.6. ĐẠO ĐỨC NGHỀ NGHIỆP Nghiên cứu được tiến hành trên các chủng vi khuẩn, không can thiệp đến bệnh nhân. Kết quả nghiên cứu mang lại dữ liệu và thực trạng và xu hướng đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh, là cơ sở để xây dựng phác đồ điều trị cho bác sĩ lâm sàng phối hợp với dược lâm sàng. 2.7. HẠN CHẾ SAI SÓT - Đảm bảo việc chọn đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn. - Giám sát chặt chẽ việc tuân thủ theo quy trình nghiên cứu. 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Từ tháng 1/2018 đến tháng 12/2018 có 618 bệnh nhân được chỉ định nuôi cấy nước tiểu với tổng số 728 mẫu được nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi như sau: 3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CĂN NGUYÊN GÂY NKTN. 3.1.1.Tỷ lệ phân lập các tác nhân gây NKTN. Bảng 3.1. Tỷ lệ phân lập các tác nhân gây NKTN Số lượng Tỷ lệ (%) Tổng số mẫu cấy nước tiểu 728 100 Số mẫu phân lập tác nhân gây bệnh 391 53,7 Nhận xét: Trong thời gian từ tháng 1/2018 đến tháng 12/2018, Khoa Vi sinh - Bệnh viện Bạch Mai có 728 mẫu nước tiểu đã được nuô