Luận án Nghiên cứu ứng dụng công nghệ xử lý nitơ vô cơ trong quản lý môi trường nuôi trồng thủy sản ven biển

5 ngày/lần 11 Ca 2+ (mg/l) 3 - 5 ngày/lần 12 Mg 2+ (mg/l) 3 - 5 ngày/lần 13 K + (mg/l) 3 - 5 ngày/lần 14 Vi khuẩn tổng số (CFU/ml) 3 - 5 ngày/lần 15 Vibrio sp. (CFU/ml) 3 - 5 ngày/lần 48 16 Tỷ lệ sống (%) 1 lần/vụ nuôi Cuối vụ nuôi 17 Tăng trưởng(g/ngày) 1 lần/vụ nuôi -nt- 18 Năng suất (kg/m3) 1 lần/vụ nuôi -nt- 19 Năng lực bể lọc sinh học 1 lần/vụ nuôi -nt- 2.2.5. Phương pháp quan trắc - Phương pháp đo nhanh: + Nhiệt độ nước được đo bằng nhiệt kế thuỷ ngân chuyên dụng với độ chính xác đến 0,10C. + Độ muối của nước biển (S ‰) đã được đo bằng khúc xạ kế cầm tay (Hand Refrectometer) với độ chính xác đến 1 ‰. + pH của nước được đo bằng máy đo pH cầm tay (Model: pH100A, YSI – USA), chính xác đạt 0,01 đơn vị. + Oxy hòa tan trong nước được đo bằng máy đo oxy cầm tay (DO200A, YSI – USA), chính xác đến 0,01 mg/l. - Phương pháp phân tích các thông số chất lượng nước + Nhu cầu ôxy sinh hóa (BOD5) được xác định bằng phương pháp trực tiếp, không pha loãng, ủ ở nhiệt độ 200C, độ chính xác đến 0,01 mg/l. + Nhu cầu Oxy hóa học (COD) được xác định bằng phương pháp Oxy hóa Kali Permanganat (KMnO4) trong môi trường kiềm, chính xác đến 0,01 mg/l. + Nồng độ các chất dinh dưỡng nitơ: nitrate (NO3 - ), nitrite (NO2 - ), ammonia tổng (NH3, NH4 +) được xác định bằng phương pháp đo mật độ hấp thụ quang trên quang phổ kế DR/2000 HACH. USA. Sai số của các phép đo ammonia, NO2 - là 0,1g/l, của NO3 - là 0,5g/l. + Độ cứng và độ kiềm xác định bằng phương pháp chuẩn độ bằng H2SO4. + Vi khuẩn Vibrio spp. được xác định mật độ bằng phương pháp màng lọc và cấy trải trên môi trường chọn lọc TCBS agar (Thiosulfate citrate bile sucrose agar). 2.2.6. Phương pháp đánh giá hiệu quả hệ thống RAS và quy trình nuôi 2.2.6.1. Đánh giá hiệu quả hệ thống RAS + Tổng lượng TAN tối đa sinh ra hàng ngày trong hệ thống RAS WTAN = Wfeed x Pfeed x 0,092 Trong đó: 49 WTAN: Tổng lượng TAN sinh ra tối đa trong hệ thống (kg/ngày); Wfeed: Lượng thức ăn tôm sử dụng (kg/ngày); Pfeed: Hàm lượng protein trong thức ăn (%). + Tổng diện tích bề mặt của hệ lọc sinh học Sts = Vhlsh*Sbmr Trong đó: Sts: Tổng diện tích bể mặt của hệ lọc sinh học (m 2) Vhlsh: Thể tích hệ lọc sinh học (m 3) Sbmr: Diện tích bề mặt riêng của vật liệu lọc sinh học (m 2/m3) + Tốc độ nitrate hoá hệ lọc sinh học Rn = WTAN/Sts Trong đó: Rn: Tốc độ nitrate hoá WTAN: Tổng lượng TAN sinh ra (kg/ngày) Sts: Tổng diện tích bề mặt của hệ lọc sinh học (m 2) 2.2.6.2. Đánh giá hiệu quả quy trình nuôi +Tỷ lệ sống của tôm Trong đó: TLS: Tỷ lệ sống (%) Nt: Số lượng tôm lúc thu hoạch No: Số lượng tôm lúc bắt đầu nuôi +Tốc độ tăng trưởng bình quân theo khối lượng (g/ngày) DWG W − W Trong đó: DWG: Tốc độ tăng trưởng bình quân theo khối lượng (g/ngày) Wt: Khối lượng tôm lúc thu hoạch Wo: Khối lượng tôm lúc bắt đầu nuôi t: Số ngày nuôi khi thu hoach +Tốc độ tăng trưởng đặc trưng theo khối lượng (%/ngày) 50 GR x g W − g W Trong đó: SGR: Tốc độ tăng trưởng đặc trưng theo khối lượng (%/ngày) Wt: Khối lượng tôm lúc thu hoạch Wo: Khối lượng tôm lúc bắt đầu nuôi t: Số ngày nuôi khi thu hoach +Tốc độ tăng trưởng đặc trưng theo chiều dài (%/ngày) GR x g − g Trong đó: SGR: Tốc độ tăng trưởng đặc trưng theo chiều dài (%/ngày) Lt: Chiều dài tôm lúc thu hoạch Lo: Chiều dài tôm lúc bắt đầu nuôi t: Số ngày nuôi khi thu họach + Hệ số chuyển hóa thức ăn 𝐹𝐶𝑅 W asd 𝑊𝑡 − 𝑊𝑜 Trong đó: FCR: Hệ số chuyển hoá thức ăn Wtasd: Lượng thức ăn sử dụng (kg) Wt: Khối lượng tôm ở thời gian thu hoạch Wo: Khối lượng tôm ở giai đoạn ban đầu +Năng suất nuôi (kg/m3/vụ nuôi) P = Q/V Trong đó: P: Năng suất nuôi (kg/m3/vụ) Q: Tổng sản lượng nuôi trong 1 vụ (kg) V: Tổng thể tích bể nuôi (m3) 2.2.6.3. Phương pháp đánh giá hiệu quả kinh tế mô hình + Vốn đầu tư (VĐT): Xây dựng cơ sở hạ tầng và đầu tư máy móc, thiết bị 51 + Chi phí vận hành: con giống, thức ăn, năng lượng điện, chế phẩm sinh học, khoáng chất, v.v. + Tổng chi phí (TC) = Chi phí vận hành + chi phí cơ hội (=8%*VĐT) + khấu hao tài sản (10% x VĐT); + Tổng doanh thu (TR) = Năng suất x Thể tích bể nuôi x 4 vụ; + Tổng lợi nhuận ròng (LN) = doanh thu - tổng chi phí. 2.2.6.4. Phương pháp ước lượng tỷ lệ sống và sinh trưởng - Sinh trưởng của tôm được tính toán dựa vào chiều dài tôm theo thang chuẩn tỷ lệ tương quan chiều dài và khối lượng. Số lượng mẫu khoảng 20 -30 con/lần. Tần suất theo dõi từ 3 – 5 ngày/lần. - Mật độ tôm được ước tính theo công thức sau: W x Trong đó: D: Mật độ tôm (con/m3) W: Tổng khối lượng tôm (kg) V: Thể tích bể nuôi (m3) Nw: Số lượng tôm theo trọng lượng (con/kg) - Tỷ lệ sống sót sau mỗi vụ nuôi được ước tính vào thời điểm thu hoạch theo công thức sau: 𝑅 x D 𝑜 Trong đó: Rs: Tỷ lệ sống sót của tôm sau vụ nuôi (%) Dt: Mật độ tôm tại thời điểm thu hoạch (con/m3) Do: Mật độ tôm tại thời điểm bắt đầu nuôi (con/m3) 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần xã vi khuẩn nitrate hoá bằng chỉ số Shannon (Shannon và Wiener, 1963[79]; Alekseiev, 2007[80]) và chỉ số Simpson [81]. −∑( ) 𝑜 52 Trong đó: H: chỉ số đa dạng sinh học hay chỉ số Shannon Ni: số lượng trình tự của OTU thứ i N: tổng số lượng trình tự của cả quần xã Đánh giá mức độ ưu thế của các OTUs trong quần xã bằng chỉ số Cd (Concentration of Dominance) hay được gọi là chỉ số (Simpson, 1949) [81]: 𝐶 ∑( ) Trong đó: Cd: chỉ số mức độ chiếm ưu thế hay còn gọi là chỉ số Simpson Ni: số lượng trình tự của OUT thứ i N: tổng số lượng trình tự của cả quần xã Đánh giá mức độ tương đồng giữa các quần xã vi khuẩn bằng chỉ số SI (Index of Similarity hay Sorensen’s Index) (Shannon và Wiener, 1963) [79]: SI = 2C/ (A+B) Trong đó: C = số lượng loài xuất hiện cả ở 2 khu vực A và B A = số lượng loài của khu vực A B = số lượng loài của khu vực B Đánh giá mức độ khác nhau giữa các giá trị trung bình bằng hàm T-test trên phần mềm Microsoft Office 2010. 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu làm giàu và tạo màng trên giá thể bám của vi khuẩn nitrate hóa định hướng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 3.1.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn nitrate hoá Làm giàu quần xã vi khuẩn nitrate hoá từ nguồn tự nhiên là bước quyết định trong quy trình nghiên cứu sản xuất chế phẩm nitrate hoá và là một trong những khâu quan trọng nhất quyết định hiệu quả xử lý ammonia và nitrite và khả năng thích ứng của màng nitrate trong điều kiện sản xuất thực tiễn. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển quy trình làm giàu 5 bước để nhân sinh khối đồng thời cả nhóm vi khuẩn oxy hoá ammonia và nhóm vi khuẩn oxy hoá nitrite tại nồng độ cơ chất thấp từ mẫu nước lợ thu thập trong rừng ngập mặn Phù Long, đảo Cát Hải, thành phố Hải Phòng. Quá trình làm giàu bước thứ nhất được thực hiện tổng cộng 29 ngày. Quá trình làm giàu bước thứ hai được thực hiện tổng cộng 18 ngày, quá trình làm giàu bước thứ ba được thực hiện tổng cộng 19 ngày. Bước làm giàu bước thứ tư kéo dài trong thời gian tổng cộng là 28 ngày. Quá trình làm giàu bước thứ năm được thực hiện tổng cộng 28 ngày. Kết quả làm giàu từng bước như sau: Quá trình làm giàu bước bước thứ nhất: Được thực hiện tổng cộng 29 ngày, lượng TAN tiêu thụ tích lũy là 28 mgN L -1 . Tốc độ loại bỏ cơ chất đạt khoảng 0,11 - 0,12 mgN L-1.h. Trong 10 ngày đầu làm giàu, lượng cơ chất tiêu thụ là rất thấp, khoảng 1,0 mgN L-1. Từ ngày thứ 11 - 23, mức tiêu thụ cơ chất được cải thiện, khoảng 1 mgN L-1 cho mỗi ngày. Tốc độ loại bỏ cơ chất tăng khoảng mười lần, từ 0,04 mgN L-1.h- 1 trong ngày thứ 12 lên 0,42 mgN L-1.h-1 trong ngày thứ 22. Từ ngày thứ 24 đến ngày kết thúc quá trình làm giàu, cơ chất được bổ sung 2,0 mg L -1 cho mỗi ngày. Tốc độ loại bỏ cơ chất tăng từ 0,083 mg L-1.h-1 vào ngày thứ 26 lên 0,14 mgN L-1.h-1 vào ngày cuối cùng của quá trình làm giàu (Hình 3.1). 54 Hình 3.1.Mức tiêu thụ cơ chất và tốc độ loại bỏ cơ chất của tổ hợp vi sinh vật nitrate hóa trong quá trình làm giàu bước 1 Quá trình làm giàu bước bước thứ hai: Quá trình làm giàu bước thứ hai được thực hiện tổng cộng 18 ngày, lượng TAN tiêu thụ tích lũy là 89 mgN L-1. Tốc độ loại bỏ cơ chất đạt khoảng 1,52 - 1,53 mgN L -1 .h -1 . Nồng độ cơ chất ban đầu trong quá trình nuôi cấy là 5,0 mgN L-1. Hai ngày một lần, cơ chất được thêm vào bình nuôi cấy 5 mgN L-1.h-1 hai ngày một lần.Trong tuần tiếp theo (ngày thứ 7 - ngày thứ 14), hàng ngày, cơ chất được bổ sung 5mgNL-1. Từ ngày thứ 15 - ngày thứ 18, cơ chất được bổ sung 10 mgN L-1 cho mỗi ngày. Tốc độ loại bỏ cơ chất tăng 23,6 lần, từ 0,065 mgN L-1.h-1 vào ngày làm giàu thứ hai lên đến 1,53 mgN L-1.h-1 vào ngày làm giàu cuối cùng (Hình 3.2). 0.112 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30 35 Thời gian (ngày) Tốc độ cơ chất được loại bỏ Lượng cơ chất được tiêu thụ L ư ợ n g cơ c h ất t iê u t h ụ ( m g .l -1 ) T ố c đ ộ l ọ a b ỏ c ơ c h ất l o ại b ỏ c ơ c h ất ( m g .l -1 .h 1 ) 55 Hình 3.2. Mức tiêu thụ cơ chất và tốc độ loại bỏ cơ chất của tổ hợp vi sinh vật nitrate hóa trong quá trình làm giàu bước 2 So với bước làm giàu thứ nhất, trong lần làm giấu thứ hai lượng cơ chất tiêu thụ tăng gấp 3,2 lần, thời gian nuôi giảm từ 29 ngày xuống 18 ngày. Tốc độ loại bỏ cơ chất tăng 13,4 lần, từ 0,114 mgN L-1.h-1 lên 1,532 mgN L-1.h-1. Quá trình làm giàu bước thứ ba: Quá trình làm giàu bước thứ ba được thực hiện tổng cộng 19 ngày, lượng TAN tiêu thụ tích lũy là 211 mgN L-1, tốc độ loại bỏ cơ chất đạt 2,510 mgN L-1.h-1 vào ngày cuối cùng của quá trình làm giàu. Trong bốn ngày đầu tiên, cơ chất được bổ sung từ 5,0 mgN L-1 đến 7,0 mgN L-1cho mỗi ngày. Trong mười ngày tiếp theo, cơ chất được bổ sung 10 mgN L-1 cho mỗi ngày. Trong năm ngày cuối cùng, cơ chất được bổ sung từ 15 mgN L-1 đến 20 mgN L-1 (Hình 3.3). Thời gian (ngày) Lượng cơ chất được tiêu thụ Tôc độ cơ chất được loại bỏ L ư ợ n g cơ c h ất t iê u t h ụ ( m g .l -1 ) T ố c đ ộ l ọ a b ỏ c ơ c h ất l o ại b ỏ c ơ c h ất ( m g .l -1 .h 1 ) 56 Hình 3.3. Mức tiêu thụ cơ chất và tốc độ loại bỏ cơ chất của tổ hợp vi sinh vật nitrate hóa trong quá trình làm giàu bước 3 So với bước làm giàu thứ hai, mức tiêu thụ tích lũy của TAN tăng 2,37 lần, từ 89 mgN L-1 lên đến 211 mgN L-1. Tốc độ loại bỏ cơ chất tăng 1,64 lần, từ 1,542 mgN L -1 .h -1 lên 2,510 mgN L -1 .h -1 . Quá trình làm giàu bước thứ tư: Quá trình làm giàu bước thứ tư được thực hiện tổng cộng 28 ngày, lượng TAN tiêu thụ tích lũy là 415 mgN L-1, tốc độ loại bỏ cơ chất đạt 3,580 mgN L-1.h-1 vào ngày cuối cùng của quá trình làm giàu. Nồng độ cơ chất ban đầu là 5,0 mgN L-1. Trong ba ngày đầu tiên, cơ chất được thêm 5,0 mgN L-1 mỗi ngày vào các bình. Trong tám ngày tiếp theo, cơ chất được điều chỉnh thành 10 mgN L-1 mỗi ngày. Sau đó, cơ chất được điều chỉnh tăng lên mỗi ngày từ 15 mgN L-1 đến 20 mgN L-1 và cuối cùng là 25 mgN L-1 (Hình 3.4). Thời gian (ngày) Lượng cơ chất được tiêu thụ Tốc độ cơ chất được loại bỏ L ư ợ n g cơ c h ất t iê u t h ụ ( m g .l -1 ) T ố c đ ộ l ọ a b ỏ c ơ c h ất l o ại b ỏ c ơ c h ất ( m g .l -1 .h 1 ) 57 Hình 3.4. Mức tiêu thụ cơ chất và tốc độ loại bỏ cơ chất của tổ hợp vi sinh vật nitrate hóa trong quá trình làm giàu bước 4 So với bước làm giàu bước thứ ba, mức tiêu thụ tích lũy của TAN tăng 1,97 lần, từ 211 mgN L-1 lên đến 415 mgN L-1. Tỷ lệ loại bỏ cơ chất tăng 1,43 lần, từ 2,510 mgN L -1 h -1 lên đến 3,580 mgN L-1h-1. Quá trình làm giàu bước thứ năm: Bước làm giàu thứ năm được thực hiện trong thời gian tổng cộng là 28 ngày, mức tiêu thụ tích lũy của TAN là 495 mgN L-1, tốc độ loại bỏ cơ chất đạt 3,650 mgN L -1 .h -1 vào ngày cuối cùng của quá trình làm giàu. Nồng độ cơ chất ban đầu là 5 mgN L -1 sau đó cơ chất được thêm vào các bình 5 mgN L-1 cho mỗi ngày trong hai ngày tiếp theo. Cơ chất tiếp tục được điều chỉnh tăng trong những ngày sau đó, từ 10 mgN L -1 trong 4 ngày, 15mgN L -1 trong 7 ngày, 20 mgN L -1 trong 3 ngày và cuối cùng là 25 mg L -1 trong những ngày còn lại (Hình 3.5). So với bước làm giàu thứ tư, mức tiêu thụ tích lũy của TAN tăng 1,19 lần, từ 415 mgN L -1 lên 495 mgN L -1 . Tuy nhiên, tốc độ loại bỏ cơ chất không tăng mà duy trì trong khoảng 3,580 - 3,650 mgN L-1.h-1. Thời gian (ngày) Lượng cơ chất được tiêu thụ Tốc độ cơ chất được loại bỏ L ư ợ n g cơ c h ất t iê u t h ụ ( m g .l -1 ) T ố c đ ộ l ọ a b ỏ c ơ c h ất l o ại b ỏ c ơ c h ất ( m g .l -1 .h 1 ) 58 Hình 3.5. Mức tiêu thụ cơ chất và tốc độ loại bỏ cơ chất của tổ hợp vi sinh vật nitrate hóa trong quá trình làm giàu bước 5 Như vậy, thông qua 5 bước làm giầu, cả vi khuẩn oxy hóa ammonia và vi khuẩn oxy hóa nitrite đều được làm giàu đồng thời. Mặc dù cơ chất cho vi khuẩn oxy hóa nitrite không được thêm trực tiếp vào môi trường nuôi cấy, nitrite được tạo ra từ vi khuẩn oxy hóa ammonia được sử dụng làm cơ chất cho vi khuẩn oxy hóa nitrite. Hệ vi khuẩn nitrate hóa đã tiêu thụ 1,238 mgN L-1 trong 122 ngày. Lượng cơ chất tiêu thụ tăng dần trong quá trình làm giàu. Trong bước làm giàu đầu tiên, tổng cơ chất tiêu thụ khoảng 28 mg L-1, nhưng lên đến 495 mg L-1 trong lần làm giàu thứ năm. Tốc độ loại bỏ cơ chất tăng từ 0,083 mg L-1 h-1 trong quá trình làm giàu bước đầu tiên lên 3,65 mg L-1h -1 trong làm giàu bước thứ năm (Hình 3.6). Hình 3.6. So sánh mức tiêu thụ cơ chất và tốc độ loại bỏ cơ chất giữa các bước làm giàu. (a- đồ thị lượng cơ chất tiêu thụ; b-đồ thị tốc độ loại bỏ cơ chất) Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Thời gian (ngày) Lượng cơ chất được tiêu thụ Tốc độ cơ chất được loại bỏ Bước 1 Bước 4 Bước 2 Bước 5 Bước 1 Bước 4 Bước 3 Bước 2 Bước 5 Bước 3 L ư ợ n g cơ c h ất t iê u t h ụ T ố c đ ộ l ọ a b ỏ c ơ c h ất lo ại b ỏ L ư ợ n g cơ c h ất t iê u t h ụ ( m g .l -1 ) T ố c đ ộ l ọ a b ỏ c ơ c h ất l o ại b ỏ c ơ c h ất ( m g .l -1 .h 1 ) 59 3.1.2. Đa dạng hình thái quần xã vi khuẩn nitrate hoá Tập hợp quần xã vi khuẩn cả ở dạng lơ lửng và dạng lọc sinh học (dính bám trên giá thể) đều được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét. Kết quả cho thấy có mười loại tế bào hình dạng khác nhau, chín trong số chúng là tế bào hình que, ngoại lệ duy nhất 1 tế bào hình cầu (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của tổ hợp vi khuẩn nitrate hóa được làm giàu Stt Hình dạng tế bào Kích thước tế bào (µm) Bề mặt của tế bào Phản ứng Gram 1 Thanh dài mảnh cong có đầu tròn 0,5 x 1,9 Bề mặt ít gồ ghề - 2 Thanh thẳng có đầu tròn 0,6 x 1,4 Bề mặt ít gồ ghề + 3 Thanh ngắn có đầu nhọn 0,7 x 1,1 Bề mặt ít gồ ghề + 4 Que thẳng có đầu tròn 0,9 x 1,9 Bê mặt thô - 5 Que cong có đầu tròn 0,5 x 0,9 Bê mặt thô - 6 Que cong có đầu tròn 0,5 x 1,4 Bê mặt thô - 7 Hình cầu 0,7 Bê mặt thô ND 8 Thanh dài mảnh cong có đầu nhọn 0,3 x 1,3 Bề mặt ít gồ ghề ND 9 Thanh cong thanh mảnh với các đầu nhọn 0,2 x (1,2 -1,6) Bề mặt ít gồ ghề ND 10 Thanh thẳng có đầu tròn 0,2 x 0,7 Bề mặt ít gồ ghề ND * Ghi chú: ND: chưa xác định Ở dạng lơ lửng, kết quả phân tích cho thấy có sáu loại hình dạng tế bào khác nhau, các vi khuẩn khác nhau về hình dạng và kích thước của chúng. Tế bào loại 1 là hình que dài cong, đầu tròn, bề mặt tế bào ít gồ ghề hơn, chiều dài khoảng 1,8 µm và đường kính 0,5µm. Tế bào loại 2 là tế bào hình que thẳng, đầu tròn, bề mặt tế bào ít gồ ghề hơn, chiều dài khoảng 1,4 µm và đường kính 0,6µm. Tế bào loại 3 là những tế bào hình que ngắn, đầu nhọn, bề mặt tế bào có sắp xếp lớp, ít nhám, chiều dài khoảng 1,1µm, đường kính 0,7µm. Tế bào loại 4 là tế bào hình que dài thẳng, đầu tròn, bề mặt tế bào nhám, chiều dài khoảng 1,9 µm và đường kính 0,9 µm. Tế bào loại 5 là những tế bào hình que cong, đầu tròn, bề mặt tế bào thô ráp và có vết phồng ở tâm tế bào, chiều dài khoảng 0,9 µm, đường kính 0,4µm. Tế bào loại 6 là những thanh dài cong, đầu tròn, bề mặt của tế bào thô ráp và có vết phồng ở trung tâm tế bào, chiều dài khoảng 1,4µm và đường kính 0,5µm (Hình 3.7). 60 Hình 3.7. Sự đa dạng về hình dạng tế bào của tổ hợp vi sinh vật làm giàu ở dạng lơ lửng Ở dạng dính bám trên giá thể, có bốn loại hình dạng tế bào khác nhau, trong đó có hai loại ở trên bề mặt xơ dừa (Loại 7 & 8) và hai loại khác trên bề mặt xốp (Loại 9 & 10). Tế bào loại 7 là những cầu khuẩn có bề mặt nhám, đường kính khoảng 0,7µm. Tế bào loại 8 là hình que dài cong, có rãnh dọc bề mặt tế bào, chiều dài khoảng 1,3µm, đường kính 0,3µm. Tế bào loại 9 là hình que dài cong, có một rãnh dài từ tâm tế bào, dài khoảng 1,2 - 1,6µm, đường kính 0,2µm. Tế bào loại 10 là những thanh dài thẳng có đầu tròn, có một rãnh dọc theo chiều dài của tế bào, chiều dài khoảng 0,7µm và đường kính 0,2 µm (Hình 3.8). 61 Hình 3.8. Sự đa dạng về hình dạng tế bào của tổ hợp vi sinh vật làm giàu ở các dạng dính bám: a - xơ dừa; b & c –tế bào dính bám trên xơ dừa; d - bọt biển; e& f - các tế bào dính bám trên bọt biển. 3.1.3. Đa dạng di truyền quần xã vi sinh vật Để tăng mật độ vi khuẩn nitrate hoá từ huyền dịch làm giầu, có 2 phương pháp cô đặc khác nhau là phương pháp ly tâm và phương pháp để lắng tự nhiên. Phương pháp li tâm có ưu điểm là có thể thu được nhiều sinh khối vi khuẩn hơn nhưng có nhược điểm là chi phí cao và có thể ảnh hưởng đến hoạt lực của vi khuẩn sau khi li tâm. Phương pháp lắng để thu phần cặn ở đáy có ưu điểm là chi phí thấp nhưng có thể sẽ thu được lượng sinh khối thấp hơn và mất đi nhiều nhóm vi khuẩn có hoạt tính tốt. Do đó, để có cơ sở lựa chọn phương pháp cô đặc thích hợp nhất, tác giả tiến hành so sánh đánh giá thành phần vi khuẩn nitrate hoá sau khi cô đặc bằng phương pháp lắng (CU1) và phương pháp ly tâm (CU2). Kết quả giải trình tự bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (NGS) cho thấy, mẫu CU2 có 40.818 trình tự được đọc trong khi đó mẫu CU1 chỉ có 21.531 đoạn trình tự được đọc. Mẫu CU2 có số OTUs là 137 trong khi đó mẫu CU1 chỉ có 94 OTUs. Các chỉ số Shannon, SI và Cd 62 cũng được phân tích cho thấy mẫu CU1 đa dạng hơn mẫu CU2, mẫu CU2 có độ tập trung cao hơn (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Đánh giá mức độ đa dạng và giàu có của quần xã vi khuẩn nitrate hoá Mẫu Shannon SI Cd Trình tự gen OTUs CU1 3,97 0,49 0,12 21.531 94 CU2 2,67 0,49 0,42 40.818 137 Cấu trúc quần xã vi khuẩn ở đơn vị phân loại cấp ngành cho thấy cả 2 quần xã này có tổng cộng 17 ngành, bao gồm các ngành Actinobacteria, Acidobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Gemmatimonadetes, Hydrogenedentes, Nitrospirae, Parcubacteria, PAUC34f, Planctomycetes, SBR1093 and Verrucomicrobia.Trong đó, số lượng ngành ở mẫu CU1 là 14 và ở mẫu CU2 là 15 ngành. Ở mẫu CU1, ngành Proteobacteria là ngành trội nhất và chiếm 70,31% tổng số trình tự đọc được, tiếp đến là Nitrospirae chiếm 14,87%, Bacteroidetes chiếm 6,47%. Trong khí đó, Nitrospirae là ngành trội nhất trong mẫu CU2 và chiếm 63,89% tổng số trình tự, tiếp đến làProteobacteriachiếm 22,59%, Bacteroideteschiếm 6,49% (Hình 3.9). Hình 3.9. Đa dạng di truyền quần xã vi khuẩn nitrate hoá sau khi cô đặc. (a): Đa dạng di truyền quần xã vi khuẩn nitrate hoá sau khi cô đặc bằng phương pháp lắng đọng; (b): Đa dạng di truyền quần xã vi khuẩn nitrate hoá sau khi cô đặc bằng phương pháp ly tâm. Kết quả phân tích đa dạng di truyền quần xã vi khuẩn nitrate hoá ở đơn vị phân loại cấp giống được thể hiện ở hình 3.9. Có tổng cộng 173 OTUs ở cả 2 mẫu, 63 trong đó mẫu CU1 có 94 OTUs, mẫu CU2 có 137 OTUs. Có tổng cộng 57 OTUs chung giữa 2 mẫu. Trong mẫu CU1, Pseudohongiella là giống trội nhất với tổng cộng 3.202 trình tự, chiếm khoảng 26,00% tổng số trình tự, tiếp đến là giống Nitrospira, chiếm khoảng 14,87%, Marinobacter chiếm khoảng 13,74%. Trong khi đó ở mẫu CU2, Nitrospira là giống trội nhất với tổng cộng 26,079 trình tự, chiếm khoảng 63,90% tổng số trình tự, tiếp đến là Denitromonas, chiếm khoảng 5,35% và Nitrosomonas chiếm khoảng 4,49% (Hình 3.9). 3.1.4. Cô đặc tạo chế phẩm Mặc dù phương pháp lắng đơn giản và giá thành thấp hơn phương pháp ly tâm nhưng kết quả giải trình tự cho thấy thành phần quần xã vi khuẩn nitrate hoá sau khi làm giàu bằng phương pháp ly tâm có nhiều nhóm vi khuẩn nitrate hoá tự dưỡng bắt buộc chiếm ưu thế trong quần xã. Do đó, trong nghiên cứu này áp dụng phương pháp ly tâm để cô đặc tạo chế phẩm nitrate hoá. Mẫu sau khi làm giàu chọn lọc nhiều bước sẽ tiến hành ly tâm trong thiết bị ly tâm lạnh với tốc độ 7.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút. Sau khi loại bỏ dịch trong phía trên và bổ sung phần cặn vào môi trường khoáng mới với nồng độ cơ chất ban đầu 2mg/l với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch ban đầu thu được chế phẩm sinh học gốc. Chế phẩm sinh học gốc được bảo quản tại 4oC khi pha loãng với môi trường nuôi cấy 10 lần có khả năng nitrate là 0,73 mg/l/giờ cơ chất thành nitrate. Sinh khối khô của vi sinh vật trong chế phẩm đạt 620 mg/l. Sinh khối vi sinh vật tổng số trong chế phẩm được định lượng bằng cân phân tích với độ chính xác 0,001g, ly tâm chế phẩm và môi trường nuôi với tốc độ 7.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, gạn bỏ lớp dịch trong phía trên và cân phần sinh khối phía dưới sau khi sấy qua đêm trong tủ sấy tại 37oC. Sinh khối chế phẩm là hiệu số giữa phần kết tủa của chế phẩm và phần kết tủa của môi trường nuôi cấy. 3.1.5. Nghiên cứu lựa chọn giá thể bám Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn 05 loại vật liệu khác nhau đề đánh giá hiệu quả dính bám cũng như xử lý ammonia và nitrite của chúng, bao gồm đá san hô chết, xơ dừa, đá cuội nhỏ, xốp sponge và hạt nhựa kaldnes. Sau khi dính bám vi sinh vật trên giá thể, giá thể (biofilter) được chuyển sang bình tam giác dung tích có sẵn môi trường khoáng với nồng độ cơ chất ban đầu 10 mg/l. Kết quả quan trắc 64 các chỉ tiêu TAN và nitrite cho thấy sau thời gian 15 ngày, nồng độ ammonia và nitrite trong các nghiệm thức có các giá thể khác nhau đều tiêu thụ hết. Tuy nhiên, nếu tính ở thời điểm sau 7 ngày thí nghiệm, tốc độ loại bỏ ammonia và nitrite cao nhất ở nghiệm thức có giá thể san hô chết, tiếp đến là xơ dữa, các nghiệm thức có giá thể xốp sponge và hạt nhựa kaldnes có tốc độ loại bỏ TAN và nitrite không khác nhau có ý nghĩa, đã cuội có tốc độ loại bỏ TAN và nitrite thấp nhất (α = 0,05). Sau thời gian 9 ngày, tốc độ loại bỏ TAN và nitrite của các nghiệm thức san hô chết, xơ dừa, đá cuội và hạt nhựa kaldnes là không có sự khác biệt và đều cao hơn giá thể là đá cuội (Hình 3.10). Hình 3.10. Đánh giá hiệu quả xử lý TAN và nitrite của các loại lọc sinh học khác nhau Nếu dựa vào hiệu quả xử lý ammonia và nitrite, lọc sinh học đá san hô chết và xơ dừa có hiệu quả xử lý ammonia và nitrite tốt nhất. Tuy nhiên, khi lựa chọn vật liệu làm giá thể dính bám vi sinh vật cần tính đến nhiều yếu tố khác như ở bảng 3.3. Dựa trên so sánh đánh giá 12 chỉ tiêu quan trọng khác, trong đó mỗi tiêu chí được chia làm 3 mức độ khác nhau, mức 1 là mức thấp, mức 2 là mức trung bình và mức 3 là mức cao, thì hạt kaldnes có số điểm tổng cộng cao nhất (32 điểm), tiếp đến là xốp sponge (23 điểm), đá cuội (21 điểm), san hô chết (20 điểm) và thấp nhất là xơ dừa (16 điểm). Hạt nhựa kaldnes mặc dù có hiệu quả dính bám vi sinh vật không cao bằng san hô chết hay sơ dữa (sau 7 ngày thí nghiệm), nhưng có ưu điểm tiếp diện bề mặt cao, nhẹ, tính bền và trơ cao, dễ vệ sinh, khử trùng và tiêu hao điện thấp 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 2 4 6 8 10 12 1 3 5 7 9 11 13 15 San hô chết TAN Sơ dừa TAN Đá cuội TAN Bọt biển TAN Hạt Kaldness TAN San hô chết N-NO2 Sơ dừa N-NO2 Đá cuội N-NO2 Bọt biển N-NO2 Hạt Kaldness N-NO2 TA N ( m g. L- 1 . h -1 ) N -N O 2 (m g. L- 1 .h -1 ) 65 trong quá trình vận chuyển. Trong khi đó san hô chết mặc dù về mặt lý thuyết có thể khai thác được từ ngoài tự nhiên nhưng do trữ lượng thấp, phân bố rải rác và kích thước không đồng đều nên nếu không có biện pháp quản lý tốt có thể dẫn đến tình trạng chặt phá các rạn san hô sống làm nguyên liệu sản xuất giá thể. Hơn nữa, san hô thường có độ bền không cao, khó vệ sinh trong quá trình vận hành. Xơ dừa là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm nhưng có nhược điểm lớn là độ bển rất thấp do xơ dừa có thể bị phân huỷ bởi vi sinh vật trong quá trình nuôi trường thuỷ sản. Bảng 3.3. So sánh và đánh