Luận án Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý mùn cưa làm cơ chất nuôi trồng mộc nhĩ và tái sử dụng bã thải để trồng nấm sò - Nguyễn Bảo Châu

xuất nấm ăn 2.2.6.1. Mô hình trồng mộc nhĩ Mô hình trồng mộc n ĩ được tiến hành tại 3 địa điểm tại huyện Yên án , Y n ô à Hoa Lư, tỉnh Ninh Bình và bố trí gồm: 1. Mô hình trồng mộc n ĩ trên mùn cưa ủ theo kỹ thuật truyền thống đối chứng); 2. Mô hình hình trồng mộc n ĩ trên m n cưa ủ bằng chế phẩm xạ khuẩn. M i mô ìn được tiến hành với 1.000 bịch. Mộc n ĩ được trồng, c m s c à thu hoạch theo quy trình chung tại địa p ương. Theo dõi, so sánh th i gian sin t ư ng, phát triển, số bịch thối hỏng, n ng suất và hiệu quả kinh tế, hiệu suất sinh h c của mô hình trồng mộc n ĩ trên m n cưa ủ bằng chế phẩm xạ khuẩn với mô ìn đối chứng. 2.2.6.2. Mô hình trồng nấm sò trên bã thải trồng mộc nhĩ Mô hình tái sử dụng bã t ải t ồng mộc n ĩ để t ồng nấm s được tiến àn tại 3 địa điểm t uộc các uyện Y n án , Y n ô à Hoa Lư tỉnh in Bìn , t ong đ m i mô ìn sử dụng 1000 bịc nấm s t ồng t n bã t ải t ồng mộc n ĩ ủ tự n i n à ủ sử dụng c ế p ẩm i sin ật. ấm sò được c m s c à t u oạch theo quy trình chung tại địa p ương. Theo dõi, 50 so sánh th i gian sin t ư ng, phát triển, số bịch thối hỏng, n ng suất và hiệu quả kinh tế, hiệu suất sinh h c của mô hình trồng nấm sò trên bã t ải t ồng mộc n ĩ ủ sử dụng c ế p ẩm i sin ật ới mô ìn trồng nấm sò trên bã t ải t ồng mộc n ĩ ủ tự n i n. 2.2.7. Phương pháp theo dõi sinh trưởng và phát triển của nấm ăn. Các đặc điểm sin t ư ng phát triển, n ng suất của mộc n ĩ, nấm sò được t eo dõi, đán giá theo Trịnh Tam Kiệt (2012), cụ thể n ư sau: * Giai đoạn hệ sợi - Tốc độ m c của sợi nấm được tính theo công thức: V = D/T, trong đ : V: Tốc độ m c của hệ sợi (mm/ngày). D: Chiều dài bình (bịch) nguyên liệu sin t ư ng kín trắng (mm). T: Th i gian hệ sợi nấm phát triển kín bịch (ngày). - Th i gian n k n cơ c ất (ngày). - Tỉ lệ nhiễm %) được tính theo công thức: Tổng số bịch nhiễm Tỷ lệ bịch nhiễm %) = ──────────────── × 100% Tổng số bịc được nuôi cấy * Giai đoạn quả thể - Th i gian sợi n k n cơ c ất (ngày): Tính từ khi cấy giống đến khi sợi sin t ư ng kín bịch nguyên liệu. - Th i gian hình thành mầm quả thể (ngày): Tính từ khi cấy giống đến khi ra mầm. - Th i gian xuất hiện quả thể t ư ng thành (ngày): Tính từ khi cấy giống đến khi quả thể t ư ng thành. - c t ước d c mũ nấm mm), k c t ước ngang mũ nấm (mm), số lớp mũ nấm/ cụm. 51 * Hiệu quả sinh h c được tính theo công thức: Khối lượng nấm tươi Hiệu quả sinh h c = ──────────────── × 100 Khối lượng nguyên liệu khô 52 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, t n chọn vi inh vật ph n giải hợp chất igno- xenluloza 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật phân giải hợp chất ligno - xenluloza Vi sinh vật là một trong các thành phần của hệ sin t ái đất trồng tr t, có vai trò quan tr ng trong chu trình chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Cùng với chất hữu cơ, i sin ật sống t ong đất, nước và vùng rễ cây có vai trò quan tr ng trong các mối quan hệ giữa cây à đất trồng. Hầu n ư m i quá trình xảy a t ong đất (mùn hóa, khoáng hóa phân giải hợp chất hữu cơ . . .) đều có sự tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp của VSV (Lê V n ương à cộng sự, 2009). ân lập vi sinh vật phân giải xenluloza từ 30 mẫu đất t ồng, m n cưa à ơm ạ p ân ủy được thu thập t n địa bàn Hà Nội và tỉnh in Bìn cho kết uả số lượng VSV phân giải xenluloza từ các mẫu khác nhau là không giống n au, t ong đ mẫu rơm ạ phân hủy à m n cưa c ứa VSV phân giải xenluloza nhiều ơn t ong mẫu đất. So sánh với kết quả phân lập VSV phân giải xenluloza từ các loại mẫu phân lập k ác n ư m n ác, nước thải, chất thải trong nghiên cứu của Nguyễn Lan Hươn,g 1 ), ạm Thị Ng c Lan và cộng sự, (1999) cho thấy số lượng vi sinh vật phân lập từ mẫu đất, m n cưa, ơm ạ nghiên cứu có số lượng thấp ơn. Trong số các VSV phân giải xenluloza phân lập từ các mẫu đất t ồng, m n cưa à ơm ạ p ân ủy c 10 chủng VSV tạo vòng phân giải CMC cao nhất. kết quả t u được tổng hợp trong bảng 3.1 cho thấy đư ng kính vòng phân giải CMC có sự khác biệt giữa các chủng V V, t ong đ 8 chủng c đư ng kính vòng phân giải C C đạt trên 10 mm, đặc biệt chủng 53 VSV ký hiệu ĐT02, C0 à C0 c đư ng kính vòng phân giải CMC > 20 mm. gược lại các chủng ký hiệu C04, RR01 c đư ng kính vòng phân giải chỉ đạt 3 và 5 mm. Trong 10 chủng VSV phân lập, chủng ký hiệu C0 đ đư ng kính vòng phân giải CMC cao nhất là đạt 32mm. Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi sinh vật có khả n ng p ân giải xenluloza STT Ký hiệu chủng Nhóm vi sinh vật Đư ng kính vòng phân giải CMC (D-d) mm Nguồn gốc phân lập 1 ĐT01 Vi khuẩn 17,0 Mẫu đất 2 ĐT02 Vi khuẩn 21,0 Mẫu đất 3 ĐT03 Vi khuẩn 11,0 Mẫu đất 4 RR05 Vi khuẩn 14,0 Mẫu ơm ạ phân hủy 5 RR06 Vi khuẩn 13,0 Mẫu ơm ạ phân hủy 6 RR01 Xạ khuẩn 5,0 Mẫu ơm ạ phân hủy 7 RR04 Xạ khuẩn 16,0 Mẫu ơm ạ phân hủy 8 MC04 Xạ khuẩn 3,0 Mẫu m n cưa 9 MC05 Xạ khuẩn 32,0 Mẫu m n cưa 10 MC08 Xạ khuẩn 22,0 Mẫu m n cưa Hình 3.1 Vòng phân giải CMC của chủng C0 t n môi t ư ng thạc đĩa 54 C n cứ đặc điểm khuẩn lạc, 10 chủng VSV có hoạt tính phân giải CMC cao nhất được xác địn sơ bộ thuộc nhóm vi khuẩn và xạ khuẩn. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lương Hữu Thành, (2012) cho rằng xạ k uẩn thuộc nhóm VSV c k ả n ng tổng hợp xenlulaza cao à được sử dụng nhiều trong xử lý hợp chất hữu cơ giàu xenluloza. Hợp chất ligno- xenluloza chính của m n cưa là xenluloza à lignin. Để xác định khả n ng sử dụng các vi sinh vật phân lập trong xử lý m n cưa làm cơ c ất trồng mộc n ĩ, đề tài đã tiếp tục đán giá k ả n ng c uyển hóa lignin của các chủng vi sinh vật phân lập thông qua việc xác định vòng phân giải lignin t n môi t ư ng thạch. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.2. cho thấy, 6 trong 10 chủng VSV phân giải xenlulo có hoạt tính phân giải lignin bao gồm 02 chủng vi khuẩn ký hiệu RR01, RR04 và 4 chủng xạ khuẩn ký hiệu RR05, RR06 và MC05, MC08, t ong đ c ủng xạ khuẩn ký hiệu MC05 tạo vòng phân giải lignin t n môi t ư ng thạc đĩa cao n ất đạt 1 mm à cao ơn ất nhiều so với các chủng còn lại. Bảng 3.2. Khả n ng p ân giải lignin của các chủng vi sinh vật p ân lập STT Ký hiệu chủng Nhóm vi sinh vật Đư ng k n ng p ân giải lignin D-d) mm 1 ĐT01 Vi khuẩn - 2 ĐT02 Vi khuẩn - 3 ĐT03 Vi khuẩn - 4 RR01 Vi khuẩn 3,0 5 RR04 Vi khuẩn 5,0 6 RR05 Xạ khuẩn 7,0 7 RR06 Xạ khuẩn 6,0 55 8 MC04 Xạ khuẩn - 9 MC05 Xạ khuẩn 15,0 10 MC08 Xạ khuẩn 6,0 Ghi chú: ( - ) không phát hiện vòng phân giải Lương Bảo Uyên, (2008) cho biết 3 chủng xạ khuẩn ký hiệu là V4, V5, V7 phân lập từ mẫu mạt dừa phân hủy c đồng th i hoạt tính phân giải xenluloza và phân giải lignin. Ba chủng xạ khuẩn này đã được ứng dụng trong xử lý bã sau trồng nấm. Theo Nguyễn Ngô Yến Ng c và cộng sự (2014) các vi sinh vật phân lập từ các đoạn g mục c đồng th i khả n ng phân giải xenluloza và phân giải lignin mang tiềm n ng cao t ong c uyển đổi sinh h c các nguồn phế thải nông nghiệp. Từ kết quả nghiên cứu thể hiện trong bảng 3.1 à 3.2, đề tài lựa ch n chủng xạ khuẩn ký hiệu MC05 cho các nghiên cứu tiếp theo. Enzyme là một sản phẩm quan tr ng mà chúng ta có thể khai thác từ sinh vật, đặc biệt là từ các vi sinh vật. Với hoạt lực xúc tác ượt trội so với các chất xúc tác ô cơ, enzyme t ực sự mang lại những thành tựu to lớn cho nhiều lĩn ực n ư công ng iệp, nông nghiệp, y h c và bảo vệ môi t ư ng (Nguyễn Quốc Trung và cộng sự, 2015). Theo Tuomela et al., (2000), khả n ng p ân giải lignin của vi sinh vật được đán giá t ông ua oạt độ enzyme lignin pe oxidase à manganese peroxidaza. Kết quả xác địn oạt độ enzyme xenlulaza, lignin pe oxidaza à manganese peroxidaza của chủng xạ khuẩn C0 được tổng hợp trong bảng 3.3 cho thấy, chủng MC05 có khả n ng tổng hợp enzyme lignin pe oxidaza Lip) đạt 1 4, I l, manganese pe oxidaza n ) đạt 0, I l à xenlulaza đạt 978,5 UI/l. 56 Bảng 3.3 ả n ng tổng hợp enzyme xenlulaza, lignin peroxidaza à manganese peroxidaza của c ủng MC05 Enzyme Hoạt độ enzyme (UI/l) Xenlulaza 978,5 Lignin peroxidaza (Lip) 154,8 Manganese peroxidaza (MnP) 0,95 3.1.2. Khả năng sử dụng vi sinh vật phân giải ligno - xenluloza trong xử lý mùn cưa làm cơ chất trồng mộc nhĩ n cưa là nguy n liệu c n để trồng mộc n ĩ, c ứa t àn p ần cơ bản là ợp c ất ligno - xenluloza. Các hợp chất chứa nitơ t ong m n cưa chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Theo Grodzinskaya et al., (2003) tỷ lệ C/N trung bình của m n cưa k oảng 6 1. Khả n ng c uyển hóa ligno - xenluloza của m n cưa được đán giá thông qua sự gia t ng của nhiệt độ khối ủ trong quá trình xử lý. Kết quả nghiên cứu về tác động của chủng xạ khuẩn C0 đến nhiệt độ khối ủ mùn cưa t ìn bày tại hình 3.2 cho thấy biến động ề n iệt độ các công t ức ủ so ới n iệt độ môi t ư ng c sự khác biệt õ ệt. iệt độ của m n cưa ủ tự n i n t ng dần đều à đến ngày t ứ 40 ẫn c xu ướng t ng n ẹ, t ong k i n iệt độ của m n cưa ủ c bổ sung sin k ối xạ khuẩn t ng n an t ong n ững ngày đầu, đạt cao n ất 670C ào ngày t ứ 6, duy t ì à giảm dần đến ngày t ứ 40 bằng ới n iệt độ môi t ư ng. ư ậy chủng xạ khuẩn C0 đã c tác dụng gia t ng n iệt độ khối ủ n an ơn, đồng th i làm rút ngắn th i gian giảm nhiệt độ khối ủ so với m n cưa ủ tự nhiên được bổ sung hoặc không bổ sung din dưỡng k oáng. 57 Hìn 3.2. Biến động ề n iệt độ t ong k ối ủ m n cưa Kết quả nghiên cứu tác động của chủng xạ khuẩn MC05 trong chuyển hóa hợp chất ligno-xenluloza của m n cưa tổng hợp trong bảng 3.4 cho thấy, m n cưa ủ bổ sung xạ khuẩn MC05 đã giảm giảm khối lượng từ 100 kg xuống c n 64, kg tương đương mức giảm 35,5% khối lượng so với m n cưa t ước khi ủ, trong khi khối lượng m n cưa công thức ủ tự nhiên chỉ giảm 19% so với m n cưa t ước khi ủ. T ư ng hợp bổ sung din dưỡng vào khối ủ, mức giảm khối lượng so với m n cưa t ước khi ủ đạt 25%. Bảng 3.4. ức độ giảm khối lượng m n cưa ủ bằng các kỹ thuật khác nhau ương p áp ủ Khối lượng t ước ủ (kg) Khối lượng sau 40 ngày ủ (kg) % giảm k ối lượng n cưa ủ tự n i n 100 81,0 19,0 n cưa ủ có bổ sung din dưỡng 100 75,0 25,0 n cưa ủ có bổ sung din dưỡng à c ủng MC05 100 64,5 35,5 ư ậy nguồn din dưỡng bổ sung vào khối ủ đã k c t c oạt động chuyển hóa, phân giải các hợp chất hydratcacbon của quần thể VSV 58 tự n i n c t ong đống ủ. Kết quả nghiên cứu của đề tài đồng nhất với các công bố t ước đây của Chang, (1996), Okhuoya et al. ,(2005) và Wang, (2010) về vai trò của din dưỡng bổ sung trong quá trình chuyển hóa hợp chất lingo – xenluloza và hiệu xuất chuyển đổi sinh h c trong nuôi trồng nấm. Kết quả phân t c t àn p ần a c của m n cưa sau 40 ngày ủ được tổng hợp trong bảng 3.5 Bảng 3. . Hiệu quả chuyển hóa ligno - xenluloza t ong m n cưa ủ bằng các kỹ thuật khác nhau ương p áp ủ Hàm lượng so với khối lượng m n cưa %) Tỷ lệ C/N Xenluloza Lignin Đư ng khử Cacbon tổng số Ni tơ tổng số n cưa mới, không ủ 44,3 24,5 0,13 48,0 0,50 96,0 n cưa ủ tự nhiên 38,5 21,7 0,20 42,2 0,55 76,7 n cưa ủ bổ sung chủng MC05 35,5 18,0 0,52 33,0 0,58 56,9 Kết quả bảng 3.5. cho thấy, quá trình ủ m n cưa đã làm giảm hàm lượng xenluloza, lignin, giảm lượng cacbon tổng số, n ưng lại làm gia t ng àm lượng đư ng khử à nitơ tổng số dẫn đến giảm tỉ lệ C/N của m n cưa ủ so với m n cưa mới. n cưa ủ có bổ sung chủng xạ khuẩn MC05 và m n cưa ủ tự nhiên có sự khác biệt rõ rệt về àm lượng xenluloza (giảm 3%), àm lượng lignin (giảm 3,7%) à àm lượng cacbon tổng số (giảm tới 9,2%). M n cưa ủ t ong điều kiện được bổ sung chủng MC05 có hàm 59 lượng đư ng khử cao ơn gấp 4 lần so với m n cưa mới và cao ơn gấp 2,5 lần so với m n cưa ủ tự nhiên. ư ậy chủng MC05 có khả n ng tổng hợp enzyme xenlulaza, lignin pe oxidaza à manganese peroxidaza, đã c tác dụng tích cực trong chuyển hóa ligno - xenluloza của m n cưa, làm giảm tỷ lệ C/N của mùn cưa từ 96/1 xuống còn 56,9/1 và làm t ng àm lượng đư ng khử từ 0,13% lên 0,52%. Đặc biệt sử dụng chủng xạ khuẩn MC05 trong quá trình ủ mùn cưa đã làm gia t ng n an n iệt độ đống ủ, giúp giảm th i gian xử lý mùn cưa à t ng uá t ìn c uyển hóa, phân giải hợp chất ligno – xenluloza so với quá trình ủ tự nhiên. T eo L Duy T ắng à T ần V n in , 2001) mộc n ĩ p át t iển tốt n ất t n cơ c ất c tỷ lệ C là 3 1 à p át t iển bìn t ư ng t n cơ chất có tỷ lệ C/N từ 40 1 đến 60/1. Kết uả ng i n cứu của đề tài cho thấy m n cưa ủ được bổ sung sinh khối chủng xạ khuẩn MC05 có tỷ lệ C/N sau ủ là 56,9 và phù hợp c o sin t ư ng, phát triển của mộc n ĩ. Từ kết quả nghiên cứu trên có thể sơ bộ kết luận: Bổ sung chủng MC05 trong quá trình ủ m n cưa c tác dụng t úc đẩy n an uá t ìn chuyển hóa các hợp chất cacbon cao phân tử, làm t ng lượng đư ng khử. M n cưa được ủ bằng sinh khối chủng MC05 có tỷ lệ C/N phù hợp để nuôi trồng mộc n ĩ t ong điều kiện bìn t ư ng. Thí nghiệm đán giá sin t ư ng, phát triển của mộc n ĩ t ồng trên m n cưa ủ bằng các p ương p áp k ác n au được thực hiện với 3 công thức: m n cưa mới không ủ, m n cưa ủ tự n i n à m n cưa ủ bổ sung chủng MC05. Kết quả nghiên cứu được tổng hợp trong bảng 3.6 c o t ấy, t n m n cưa k ông ủ, mộc n ĩ k ông ìn t àn ệ sợi và không quan sát thấy sự p át t iển của mộc n ĩ. T n m n cưa ủ tự nhiên, hệ sợi hình thành và phát triển trong 02 tuần đầu sau khi cấy giống với tốc độ chậm, sợi 60 mản , sau đ hệ sợi nấm bị chết tuần thứ 3. T n m n cưa ủ bổ sung sin k ối c ủng MC05, hệ sợi nấm hình thành và phát triển với tốc độ lan tơ đạt t ung bìn 4, mm ngày. Hệ sợi mộc n ĩ lan k n bịc nấm sau cấy giống 6 tuần. Bảng 3.6. in t ư ng, phát triển của hệ sợi mộc n ĩ t n m n cưa ủ bằng các kỹ thuật k ác n au Công thức Tốc độ phát triển trung bình của hệ sợi mộc n ĩ (mm)/chiều dài bịch nấm 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần tuần 6 tuần n cưa k ông ủ - - - - - - n cưa ủ tự nhiên 32,5 52,0 - - - n cưa ủ bổ sung chủng MC05 38,5 74,8 135,8 175,5 196,5 207,5 hi ch -) hệ sợi không hoặc ngừng sinh trưởng Từ các kết uả ng i n cứu trên, đề tài xác định trong quá trình ủ mùn cưa, chủng VSV phân lập ký hiệu MC05 có tác dụng gia t ng n an n iệt độ khối ủ, chuyển hóa tốt ơn hợp chất ligno - xenluloza cao phân tử, qua đ giảm được tỷ lệ C/N đáp ứng nhu cầu sin t ư ng, phát triển của mộc n ĩ. Mộc n ĩ t ồng t n m n cưa ủ bổ sung sinh khối chủng MC05 sinh t ư ng phát triển tốt và tạo hệ sợi lan kín bịch nấm sau cấy giống 6 tuần. 3.1.3. Định danh chủng MC05 3.1.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa chủng MC05 T eo omomu a, 1 74) à Wilkins, 1 ) c n cứ màu sắc khuẩn lạc t n các môi t ư ng ISP (International Streptomyces Project) xạ khuẩn được phân thành 7 nhóm theo màu sắc của khuẩn ty khí sinh và thành 5 nhóm theo màu sắc của khuẩn ty cơ c ất. Bên cạn đ , k ả n ng tạo sắc tố 61 tan à melanin cũng là một trong những tiêu chuẩn cơ bản để phân biệt xạ khuẩn. Khi nuôi cấy chủng C0 t n các môi t ư ng I k ác n au, đề tài xác định khuẩn ty khí sinh của chủng xạ khuẩn MC05 có màu vàng trên môi t ư ng ISP5, màu xám t n các môi t ư ng ISP1, ISP2, ISP3, ISP4 màu trắng t n môi t ư ng I 6 à I 7. uẩn ty cơ c ất của chủng MC05 có màu xám t n môi t ư ng ISP2 và màu vàng trên các môi t ư ng nuôi cấy khác. Chủng MC05 không tạo sắc tố tan hoặc melanin và không làm t ay đổi màu sắc của môi t ư ng nuôi cấy. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 Bảng 3.7. Đặc điểm khuẩn lạc chủng C0 t n môi t ư ng ISP Môi t ư ng Màu sắc khuẩn lạc Khả n ng tạo sắc tố Khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ c ất Melanin Sắc tố tan ISP1 Xám Vàng - - ISP2 Xám Xám - - ISP3 Xám Vàng - - ISP4 Xám Vàng - - ISP5 Vàng Vàng - - ISP6 Trắng Vàng - - ISP7 Trắng Vàng - - Ghi chú: -: không phát hiện Theo Nomomura (1974), khả n ng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ t ong các môi t ư ng ISP khác nhau là các tiêu chí quan tr ng tiếp theo trong phân loại xạ khuẩn. Kết quả đán giá một số đặc điểm sinh hóa của chủng MC05 tổng hợp trong bảng 3.8 cho thấy chủng MC05 có khả n ng đồng hóa casein, gelatin, hypoxanthine, xanthin, L-tyrosine, xylan và có 62 khả n ng sử dụng xanthine, xylan, L-Arabinose, meso-Inositol và mannitol làm nguồn hydratcacbon. Hìn 3.3. uẩn lạc c ủng xạ khuẩn C0 t n môi t ư ng đặc Bảng 3.8. Một số đặc điểm sinh hóa của chủng MC05 Nguồn nitơ ả n ng đồng a Nguồn cacbonhydrate ả n ng đồng a Adenine - Xanthine + Casein + Xylan + Elastin - L-Arabinose + Gelatin + meso-Inositol + Hypoxanthine + Mannitol + Testosterone - Raffinose - L-Tyrosine + Sucrose - Đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử là tiêu chí quan tr ng trong phân loại xạ khuẩn. Kết quả quan sát cuống sinh bào tử chủng MC05 cho thấy mặt bào tử n ẵn, số lượng bào tử khoảng 30 - 50 bào tử/chu i (hình 3.3.). Từ các kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm bảo tử và các phản ứng sinh hoá nêu trên, so sánh với đặc điểm của chi Streptomyces, có thể xác địn sơ bộ chủng MC05 phân lập thuộc chi 63 Streptomyces. Hìn 3.3. C u i bào tử à cuống sinh bào tử chủng MC05 3.1.3.2. Giải trình tự gen của chủng MC05 Để định danh chính xác tên loài của xạ khuẩn nghiên cứu, đề tài đã giải trình tự gen ADNr 16S của chủng C0 à xác định chủng MC05 có tr ng lượng phân tử khoảng 800 bp (hình 3.4). Hình 3.4. Sản phẩm CR được khuếc đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S- rRNA của chủng MC05. T n cơ s kết quả giải trình tự 16s ARN riboxom của chủng MC05, đề tài xây dựng cây phả hệ xác định vị trí phân loại của chủng MC05 và các loài có quan hệ h hàng. Kết quả xây dựng cây phả hệ chủng MC05 được thể hiện trong hình 3.5. Kết quả nghiên cứu xác định, chủng MC05 có độ tương đồng trên 98 % với các gen tương ứng của một số xạ khuẩn thuộc 64 chi Streptomyces, t ong đ mức tương đồng cao n ất đạt % đối với Streptomyces thermocoprophilus. Hình 3.5. Cây phát sinh dựa trên trình tự 16S ARN rebosom của chủng MC05 với các loài có quan hệ h hàng gần T n cơ s kết quả đán giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử, cuống sinh bào tử, các phản ứng sinh hóa và kết quả giải trình tự 16S ARN rebosom, chủng C0 được định danh là Streptomyces thermocoprophilus MC05. Theo ướng dẫn TRBA số 466 ngày 28.5.2015 của của Cộng đồng Châu Âu, Streptomyces thermocoprophilus thuộc nhóm an toàn sinh h c cấp độ 1, là các tác nhân sinh h c không gây bện c o ngư i, động vật và thực vật, được sử dụng phóng thích không hạn chế ào môi t ư ng tự nhiên điều kiện bìn t ư ng. Xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 có quan hệ gần gũi à c mức tương đồng 99% với loài Streptomyces thermocoprophilus vì vậy thuộc nhóm an toàn sinh h c cấp độ 1. 3.2. Nghiên cứ ản ất chế ph m ạ khu n ủ m n cưa àm cơ chất t ồng mộc nhĩ. 3.2.1. Điều kiện nhân sinh khối xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 bằng kỹ thuật lên men chìm MC05 Streptomyces thermocoprophilus strain B19_NR 025291.1 Streptomyces thermocarboxydus strain AT37_ NR 026072.1 Streptomyces lannensis strain TA4-8_ NR 113181.1 Streptomyces sampsonii strain ATCC 25495_ NR 025870.1 Streptomyces canchipurensis strain MBRL 172_ NR 134820.1 Streptomyces tendae strain ATCC 19812_ NR 025871.1 Streptomyces eurythermus strain ATCC 14975_ NR 025869.1 Streptomyces nodosus strain ATCC 14899_ NR 041730.1 0.002 65 3.2.1.1. Nhiệt độ Nhiệt độ là nhân tố quan tr ng, ản ư ng đến sự sin t ư ng, phát triển của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 được nuôi cấy t n môi t ư ng, pH và th i gian thích hợp các nhiệt độ k ác n au t ong bi n độ 25-650C. Kết quả nghiên cứu ản ư ng của nhiệt độ đến sin t ư ng, phát triển của MC05 trong quá trình nhân sinh khối biểu hiện trong hình 3.6. . Hìn 3.6. Ản ư ng của n iệt độ đến k ả n ng sin t ư ng, phát triển của chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 Kết quả thể hiện trong hình 3.6 cho thấy sau 72 gi nuôi cấy, mật độ xạ khuẩn C0 đạt 107 CFU/ml các nhiệt độ 250C và 650C, đạt 109 CFU/ml nhiệt độ 350C, 400C, 450C, 500C, 550C và đạt mật độ cao nhất 5,7x10 9 CFU/ml nhiệt độ 400C. ư ậy sinh khối xạ khuẩn MC05 ổn định với mật độ trên 109 CFU/ml khi nuôi cấy nhiệt độ từ 350C đến 550C. Sự chênh lệch mật độ xạ khuẩn MC05 khi nuôi cấy nhiệt độ 350C, 400C, 45 0 C, 50 0 C và 55 0 C là không đáng kể. T ng T ị C n , 2001) xác định nhiệt độ thích hợp cho một số chủng xạ khuẩn phân giải xenluloza để xử lý rác thải, phế thải nông nghiệp 66 là 40-55 0 C. Kết quả tương tự cũng được Trần Đìn Toại, 200 ) xác định đối với hai chủng xạ khuẩn (ký hiệu 2P và 7P). Nghiên cứu của Nguyễn Thế T ang, 201 ) xác định 02 chủng xạ khuẩn phân lập có ký hiệu là Đ 03 à ĐA0 sin t ư ng tốt khoảng nhiệt độ 35-450C và hoạt độ enzyme xác địn đạt cao nhất là 450C. 3.2.1.2. pH T ong môi t ư ng nuôi cấy, H+ làm t ay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào và tùy thuộc nồng độ H+ có thể t úc đẩy hoặc kìm hãm khả n ng t ẩm thấu qua màng tế bào vi sinh vật đối với một số ion nhất định, đồng th i tác động trực tiếp đến hoạt động của các enzyme có mặt trên thành tế bào. Nếu nồng độ H+ trong dung dịc ượt quá mức bìn t ư ng đối với vi sinh vật nào đ t ì sự sống sẽ bị ức chế Lương Đức Phẩm, 2009). Chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 được nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ và th i gian thích hợp các pH khác nhau trong khoảng pH từ 4 đến 9. Kết quả nghiên cứu ản ư ng của pH môi t ư ng đến sinh t ư ng, phát triển của chủng C0 được thể hiện trong hình 3.7 cho thấy mật độ xạ khuẩn sau 72 gi nuôi cấy pH 7,0 đạt cao nhất là > 109 CFU/ml, trong khi pH 4,0 à ,0 mật độ c ỉ đạt 107 CFU/ml. Chủng xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 có khả n ng sin t ư ng, phát triển tốt t ong môi t ư ng nuôi cấy có pH từ 6,0 đến 8,0. Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với kết quả nghiên cứu đã được công bố của T ng T ị Chính, (2001) và Trần Đìn Toại, (2008) Nguyễn Thế Trang, (2015) về pH thích hợp c o sin t ư ng và hoạt tính xelulaza của xạ khuẩn nằm trong khoảng pH 7,0 – 8,0 và pH tối ưu là 7,0. Công bố của Chen et al., 2011) cũng k ẳng định, hoạt động của nhóm VSV phân giải ơp c ất ligno – xenluloza thích hợp t ong điều kiện pH môi t ư ng 6,0-8,0. 67 Hìn 3.7. Ản ư ng của pH môi t ư ng đến sin t ư ng, phát triển của chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 3.2.1.3. Thời gian nhân sinh khối Chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 được nuôi cấy trên môi t ư ng, pH và nhiệt độ thích hợp các khoảng th i gian khác nhau từ 0 đến 96 gi . Kết quả nghiên cứu ản ư ng của th i gian nhân sinh khối mật độ Streptomyces thermocoprophilus MC05 thể hiện trong hình 3.8 cho thấy, mật độ xạ khuẩn t ng dần từ 104 CF ml đến 109 CFU/ml trong th i gian từ 0 đến 72 gi , trong đ mật độ đạt 109 CFU/ml sau th i gian nuôi cấy 60 gi à đạt cao nhất tại th i điểm 72 gi , sau đ giảm dần, đến th i điểm 6 gi c n 108 CFU/ml. ư ậy, th i gian thu sinh khối đối với Streptomyces thermocoprophilus MC05 đạt hiệu quả cao nhất là 72 - 4 gi . 68 Hìn 3. . Ản ư ng của t i gian nuôi cấy đến sin t ư ng, phát triển của chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 Đào V n T ông à cộng sự 2013) xác định th i gian nhân sinh khối thích hợp đối với chủng xạ khuẩn Streptomyces griseosporeus sử dụng trong sản xuất chế phẩm vi sinh là 60-72 gi . Nghiên cứu của Nguyễn Thế T ang, 201 ) cũng xác địn được khoảng th i gian thích hợp cho quá trình nhân sinh khối đối với 2 chủng xạ khuẩn phân lập Việt Nam ký hiệu là Đ 03 à ĐA0 là 70-96 gi . 3.2.1.4. Lưu lượng khí cấp T eo L V n ương à cộng sự (2009), quá trình cung cấp oxy cho vi sinh vật phát triển gồm 2 pha, pha 1 oxy từ k ông k được hòa tan vào dịch lên men và pha 2 oxy hòa tan từ dịch lên men khuếch tán vào trong tế bào vi sinh vật. Trên thực tế, để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho quá trình lên men, ngư i ta phải k ai t ác đồng th i 2 yếu tố là lượng khí cấp à điều kiện xúc tác giữa pha lỏng và pha khí bằng cách sục khí kết hợp đảo trộn hay khuấy tích cực dịch lên men. ết uả ng i n cứu ản ư ng của lưu lượng khí cấp đến sinh t ư ng, phát triển của xạ khuẩn Streptomyces thermocoprophilus C0 69 t ong uá t ìn n ân sin k ối t ể iện t n ìn 3. c o t ấy mật độ xạ khuẩn đạt 107 CFU/ml t ong điều kiện lượng k cấp là 0,4 dm3 k ông k dm3 môi t ư ng/phút, đạt 108 CFU/ml k i lượng k cấp là 0, à 0,6 dm 3 k ông k dm3 môi t ư ng p út à đạt 109 CFU/ml với lượng cấp k 0,7- 0,9 dm 3 k ông k dm3 môi t ư ng/phút. Khi tiếp tục t ng lượng k cấp l n mức 1,0 dm3 k ông k dm3 môi t ư ng/phút, mật độ Streptomyces thermocoprophilus MC05 không những k ông t ng l n mà giảm xuống c n 10 8 CFU/ml. ư ậy lượng k cấp t c ợp c o n ân sin k ối c ủng xạ k uẩn Streptomyces thermocoprophilus MC05 là 0,7 – 0,9 dm3 k ông k dm3 môi t ư ng/phút. Hìn 3. . Ản ư ng của lượng k cấp đến k ả n ng sin t ư ng, phát triển của chủng Streptomyces thermocoprophilus MC05 Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồn