Luận án Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc.) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu

xử lý được triển khai qua cột cổ điển Silica-gel 1 với hệ dung môi CHCl3 – MeOH (90:10) ngoài phân đoạn Tw1-1 và Tw1-2 ở mục 3.2.2.1 còn thu được kết tinh phân đoạn Tw1-3 có 2 vết trên SKLM và tiếp tục phân lập bằng MPLC, thu được hợp chất (3). Phương pháp MPLC để phân lập hợp chất (3) từ phân đoạn Tw1-3 theo điều kiện và các bước tiến hành ở mục 2.4.1.3. Kết tinh thu được sau khi cô giảm áp thu hồi dung môi tiếp tục được tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần với DCM và PE để thu được chất tinh khiết; kiểm tra lại bằng sắc ký lớp mỏng. Sau đó, kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất (3) bằng HPLC pha đảo với đầu dò PDA theo điều kiện trong Bảng 3.4. Bảng 3.4. Điều kiện sắc ký trong phân lập và đánh giá độ tinh khiết hợp chất (3) Điều kiện sắc ký MPLC HPLC Pha tĩnh Silica-gel (loại SKC, cỡ hạt 40 – 63 µm) Cột Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) Pha động PE – Aceton (84:16) ACN-nước (70:30) Nhiệt độ cột 25 ºC 25 ºC Bước sóng phát hiện 280 nm 280 nm Tốc độ dòng 40 ml/phút 1 ml/phút Thể tích tiêm mẫu 1 ml/lần 10 µl Nồng độ pha mẫu 10% (g/100 ml) 0,1% (g/100 ml) Phân lập và tinh chế các hợp chất (4) và (5) bằng sắc ký cột cổ điển Lấy 50 g từ 200 g cao MeOH 100% đã xử lý (thu được từ mục 3.1.2) triển khai qua cột cổ điển Silica-gel 2 với hệ dung môi CH2Cl2 – aceton (100:5) thu được kết tinh phân đoạn Tw2-1 có 2 vết trên SKLM. Phân đoạn Tw2-1 tiếp tục được triển khai qua cột cổ điển Silica-gel 2-1 với hệ dung môi PE-EA (7:3) thì thu được kết tinh của 2 hợp chất (4) và (5). 53 Hai hợp chất (4) và (5) sau khi được tinh sạch bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi theo cách tiến hành đã trình bày ở mục 2.4.1.4 thu được chất tinh khiết trên SKLM (triển khai với 3 hệ dung môi chỉ cho 1 vết trên sắc ký đồ) và trên HPLC theo điều kiện ở Bảng 3.4. Sơ đồ 3.3. Quy trình chiết tách và phân lập hợp chất taxoid (4) và (5) Các hợp chất taxoid sau khi phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả độ tinh khiết của 5 hợp chất taxoid phân lập được của đề tài đều có độ tinh khiết > 95% (xem kết quả ở mục 3.4.1) và tiếp tục được phân tích bằng các phương pháp phổ nghiệm đề xác định cấu trúc của từng hợp chất. Xác định cấu trúc Hợp chất (1) Hợp chất (1) là kết tinh dạng rắn vô định hình, không màu, có ánh lấp lánh, tan trong cloroform, acetonitril, ethyl acetat, hơi tan trong methanol. Sau khi khai triển SKLM, hợp chất (1) có vết tắt quang khi soi dưới đèn UV 254 nm, và hiện màu tím chuyển sang nâu với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C 50 g cao MeOH 100% đã xử lý Cô quay áp suất giảm Rửa kết tinh với PE Cột cổ điển 2 CH2Cl2 : Aceton (100:5) Pđ Tw 2-1 6 g kết tinh (4) và (5) (4) tinh khiết > 99% (183 mg) (5) tinh khiết > 95% (105 mg) Cột cổ điển 2-1 PE:EA (7:3) 54 trong 5 phút (xem Hình 3.17 ở mục 3.4.1), sơ bộ xác định được hợp chất (1) thuộc nhóm terpen. Phổ UV của (1) trong MeOH cho đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 217 và 279,4 nm. Điều này phù hợp với các taxoid vì các taxoid có đỉnh hấp thu cực đại trong khoảng 190 – 300 nm [42]. Các băng hấp thụ đáng chú ý trên phổ IR của (1): 1684 cm-1 (C=O), 1634 cm-1 (C=C), 1132 cm-1 và 1070 cm-1 (C-O-C) (xem PL2.1). Điều này phù hợp với các taxoid vì trong cấu trúc của các taxoid đều có sự hiện diện của nhóm carbonyl ester ở vị trí C5, nhóm ceton (C=O) ở vị trí C13 [34], [42]. Phổ MS – ES+ cho thấy mảnh chính có m/z 687,28; đây là mảnh [M+Na]+, do vậy (1) có khối lượng phân tử là 664,28 Dalton, tương ứng với công thức phân tử là C37H44O11, độ bất bão hòa Ω = 16. Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 37 carbon bao gồm một carbon carbonyl [δC 199,3], bốn carbon carbonyl ester [δC 169,3; 169,7 và 169,2], hai carbon olefin [δC 150,5 và 138,6]. Vậy hợp chất (1) có 13 nối đôi, kết hợp thêm thông tin từ phổ MS có độ bất bão hòa Ω = 16 nên hợp chất (1) phải có 3 vòng. Ngoài các tín hiệu trên, phổ 13C-NMR còn cho thấy 6 tín hiệu carbon oxymethin [δC 68,6; 76,2; 69,6; 75,0 và 72,8]. Phổ 1H-NMR (CDCl3) cho thấy có bốn nhóm methyl với δH 1,15 (s); 1,77 (s); 2,38 (s) và 1,03 (s) đặc trưng cho khung taxan diterpen và phổ MS có mảnh m/z 359 đặc trưng cho vòng 6/8/6 [17]. Ngoài ra, phổ 1H-NMR của (1) có bốn tín hiệu đơn ở δH 2,08 (s), cùng với các nhóm carboxyl, dự đoán khả năng có 4 nhóm thế acetyl trên khung taxan. Thêm nữa, các tín hiệu methylen với δH 6,45 (d; 16,0 Hz); 7,69 (d; 16,0 Hz); 7,47; 7,78 (d) và 7,44; điều này cho thấy có nhóm cinnamoyl gắn lên khung taxan. Tổng hợp các dự liệu phổ UV, MS, NMR, đồng thời so sánh dữ liệu NMR của hợp chất (1) với dữ liệu NMR của taxinin B (Bảng 3.5) [34], cho thấy hoàn toàn tương tự. Vì vậy, hợp chất (1) được xác định là taxinin B, còn có tên gọi khác là 7β-acetat-O-taxinin A được Woods M.C. và cs phân lập lần đầu tiên vào năm 1968 từ lá Taxus cuspidata Sieb. et Zucc. [34]. 55 Bảng 3.5. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (1) và taxinin B C Hợp chất (1) Taxinin B [34] δC* δH (J, Hz)*1 δC** δH (J, Hz)**1 1 48,7 2,25; dd (1,5; 7) 48,7 2,24; dd (1,5; 7) 2 68,6 5,63; dd (1,5; 6,5) 68,6 5,62; dd (1,5; 6,5) 3 42,0 3,33; d (6,5) 42,0 3,32; d (6,5) 4 139,8 - 139,8 - 5 76,2 5,39; t (3) 76,2 5,38; t (3) 6a 35,1 1,77; m 35,1 1,75; m 6b 2,08; m 2,11; m 7 69,6 5,45; dd (6; 11) 69,6 5,44; dd (6; 11) 8 47,6 - 47,6 - 9 75,0 5,94; d (10,5) 75,0 5,94; d (10,5) 10 72,8 6,25; d (10,5) 72,8 6,24; d (10,5) 11 150,5 - 150,5 - 12 138,6 - 138,6 - 13 199,3 - 199,3 - 14a 36,2 2,39; d (20) 36,2 2,34; d (20) 14b 2,85; dd (7; 20) 2,84; dd (7; 20) 15 37,3 - 37,4 - 16 37,7 1,15; s 37,8 1,15; s 17 25,3 1,77; s 25,3 1,76; s 18 14,3 2,39; s 14,3 2,38; s 19 13,2 1,03; s 13,2 1,02; s 20a 118,8 4,92; s 118,8 4,92; s 20b 5,45; s 5,43; s 21 166,2 - 166,2 - 22 117,4 6,45; d (16) 117,4 6,44; d (16) 23 146,4 7,69; d (16) 146,4 7,68; d (16) 2-OAc 169,3 169,3 Me 20,8 2,08; s 20,8 2,06; s 7-OAc 169,7 169,7 Me 21,3 2,08; s 21,3 2,06; s 9-OAc 169,7 169,7 Me 21,4 2,08; s 21,4 2,06; s 10-OAc 169,2 169,2 Me 20,7 2,08; s 20,7 2,02; s 1′ 134,5 134,5 2′, 6′ 129,0 7,78; d (7) 129,0 7,77; d (7) 3′, 5′ 128,6 7,47; m 128,6 7,42; m 4′ 130,5 7,44; m 130,5 7,42; m Ghi chú: *: ppm, 125 MHz, CDCl3.; *1: ppm, 500 MHz, CDCl3. **: ppm, 125 MHz, CDCl3.; **1: ppm, 500 MHz, CDCl3 56 Hình 3.2. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1) Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất (1) Hợp chất (2) Hợp chất (2) có dạng tinh thể hình kim không màu, tan trong methanol, acetonitril, cloroform. Sau khi khai triển SKLM, hợp chất (2) có vết tắt quang khi soi dưới đèn UV 254 nm, và hiện màu hồng tím với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C trong 5 phút (xem Hình PL1.1), sơ bộ xác định được hợp chất (2) thuộc nhóm terpen. 57 Hợp chất (2) có cực đại hấp thu tại bước sóng 266,7 nm; phù hợp với phổ UV của các hợp chất taxoid [9], [42], [61]. Phổ hồng ngoại của (2) có các đỉnh hấp thu tương ứng với các nhóm chức: 3450 cm-1 (nhóm -OH), 1747 cm-1 và 1679 cm-1 (C=O), 1199 cm-1 (C-O-C) trùng khớp với cấu trúc taxoid (xem PL2.2). Trên phổ MS, (2) cho cường độ mảnh chính tương ứng với m/z 557,32 phù hợp với mảnh [M+Na]+. Vậy, (2) có khối lượng phân tử là 534,32 Dalton, tương ứng với công thức phân tử là C28H38O10, độ bất bão hòa Ω = 10. Phổ 13C NMR kết hợp phổ DEPT 90 và DEPT 135 của (2) cho các tín hiệu hưởng ứng với 28 carbon bao gồm một carbon carbonyl với δC 199,4; bốn carbon carbonyl ester với δC 169,2; 169,3; 169,7; 169,8; bốn tín hiệu carbon olefin với δC 115,5; 139,2; 144,7 và 149,8. Hợp chất (2) có độ bất bão hòa Ω = 10 và phổ 13C NMR có 7 nối đôi (5 carbon carbonyl, 4 carbon olefin) nên hợp chất (2) có 3 vòng. Phổ 1H-NMR của hợp chất (2) xuất hiện bốn nhóm metyl tứ cấp với δH 1,74 (s), 1,11 (s); 2,33 (s) và 0,98 (s) đặc trưng cho khung taxan diterpen và phổ MS có mảnh m/z 359 đặc trưng cho vòng 6/8/6 [17]. Tương tự như (1), hợp chất (2) có bốn tín hiệu 1H-NMR đơn với δH 2,02-2,08 (s). Tuy nhiên, hợp chất (2) thiếu các tín hiệu olefin và carboxyl. Hơn nữa, phổ MS của hợp chất (2) cũng không có tín hiệu của mảnh m/z 151 của cinnamoyl; đồng thời (2) cũng có số khối thấp hơn (1) tương ứng một nhóm cinnamoyl. Dự đoán công thức (2) tương tự như (1), chỉ khác là không có nhóm cinnamoyl. So sánh các dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất (2) với các chất đã được công bố cho thấy cấu trúc của (2) hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của taxuspin F [61]. Taxuspin F có cấu trúc hóa học như trong Hình 3.6. Hợp chất này đã được phân lập từ Taxus cupidata Sieb.et Zucc năm 1995 [61] và từ Taxus wallichiana Zucc bởi Nguyễn Thị Thanh Tâm [9]. 58 Bảng 3.6. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (2) và taxuspin F Hợp chất (2) Taxuspin F [61] C δC* δH (J, Hz)*1 δC** δH (J, Hz)**1 1 48,8 2,20 (dd; 2,0; 6,0) 48,8 2,20 (dd; 2,0; 6,5) 2 68,9 5,60 (dd; 1,5: 6,0) 69,0 5,60 (dd; 2,0; 6,0) 2-OAc 169,7 - 169,4 - Me 21,3 2,05 (s) 21,3 2,05 (s) 3 39,7 3,53 (d; 6,0) 39,7 3,55 (d; 6,0) 4 139,2 - 139,2 - 5 74,5 4,22 (d; 2,5) 74,5 4,22 (d; 2,0) 6a 37,5 1,61(m) 37,6 1,61 (m) 6b 1,94 (m) 1,94 (ddd; 3,0; 5,5; 13,5) 7 69,5 5,50 (dd; 5,5; 11,5) 69,6 5,52 (dd; 5,5;11) 7-OAc 169,2 - 169,2 - Me 21,3 2,08 (s) 21,4 2,08(s) 8 47,8 - 47,9 - 9 75,1 5,90 (d; 11,0) 75,2 5,90 (d; 10,5) 9-OAc 169,3 - 169,4 - Me 20,9 2,05 20,9 2,05 10 72,8 6,26 (d; 11,0) 72,8 6,25 (d; 10,5) 10-OAc 169,8 - 169,8 - Me 20,7 2,02 20,7 2,02 11 149,8 - 149,9 - 12 144,7 - 144,8 - 13 199,4 - 199,6 - 14a 36,1 2,33 (d; 19,5) 36,1 2,33 (d; 19,5) 14b 2,77 (dd; 7,0; 20,0) 2,76 (dd; 6,5; 19,5) 15 37,8 - 37,8 - 16 37,4 1,74 (s) 37,4 1,74 (s) 17 25,4 1,11 (s) 25,4 1,12 (s) 18 14,5 2,33 (s) 14,5 2,31 (s) 19 12,9 0,98 (s) 12,9 0,98 (s) 20a 115,5 4,81 (s) 115,5 4,82 (s) 20b 5,23 (s) 5,23 (s) Ghi chú: *: ppm, 125 MHz, CDCl3.; *1: ppm, 500 MHz, CDCl3. **: ppm, 125 MHz, CDCl3.; **1: ppm, 500 MHz, CDCl3 59 Hình 3.4. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (2) Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất (2) Hợp chất (3) Hợp chất (3) là kết tinh trắng, hình kim dài, dạng xốp, tan trong ACN, aceton; hơi tan trong MeOH, EtOH, PE và ethyl acetat. Sau khi khai triển SKLM, hợp chất (3) có vết tắt quang khi soi dưới đèn UV 254 nm, và hiện màu nâu với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C trong 5 phút (xem Hình PL1.1), sơ bộ xác định được hợp chất (3) cũng thuộc nhóm terpen. Trên phổ IR của (3) cho các tín hiệu của nhóm –OH tự do (3.495 cm-1), nhóm C=O của ester (1.737 cm-1), nhóm C–O–C của ester (1.168 cm-1), nhóm 60 carbonyl C=O (1.665 cm-1) (xem PL2.3) phù hợp với cấu trúc taxoid [42], [43]. Phổ UV – Vis của (3) cho đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 274 nm, phù hợp với taxoid [42]. Phổ MS-ES+ trong MeOH cho thấy pic cơ bản có m/z 645,2; tương ứng mảnh [M-Na]+ do vậy (3) có khối lượng phân tử là 622 Dalton, tương ứng với một hợp chất có công thức phân tử là C35H42O10, độ bất bão hòa Ω = 15. Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 35 carbon bao gồm: Một carbon carbonyl với δC 199,3 nhưng chỉ có ba carbon carbonyl ester với δC 169,3; 169,7 (2C). Hai nhóm carbon olefin bậc bốn C 150,5 và 138,6 (2C), một carbon olefin bậc hai C 118,8, bốn carbon đặc trưng cho vòng thơm với C 134,5; 129,0 (2C); 128,6 (2C); 130,5. Dựa trên độ bất bão hòa Ω = 15, nên hợp chất (3) cũng có cấu trúc 3 vòng. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất (3) cho các tín hiệu tương tự như của hợp chất (1) và phổ MS cũng có mảnh m/z 359 đặc trưng cho taxan diterpen vòng 6/8/6 [17] và mảnh m/z 137 của nhóm cinnamoyl giống (1), tuy nhiên phổ 1H-NMR của hợp chất (3) chỉ có sự hiện diện của ba nhóm –OAc với δH 2,08 (s); 2,08 (s), 2,08 (s). Hơn nữa, theo kết quả MS thì chênh lệch khối lượng phân tử của (1) và (3) Δm = 42 u cho thấy sự mất đi của nhóm CH2=CO [74]. Phổ COSY của hợp chất (3) cũng cho các tương quan của proton tương tự như hợp chất (1). So sánh phổ 1H và 13C NMR nhận thấy 2 hợp chất có khung cấu trúc tương tự nhau nhưng hợp chất (3) chỉ hiện diện 3 nhóm –OAc và 1 nhóm –OH. Phổ HMBC cho các tương quan giữa: H-2, H-7 và H-9 lần lượt với các carbon carbonyl ester [C 169,3 (s, 2-OAc); 169,7 (s, 7-OAc); 169,7 (s, 9-OAc)]. Do đó, tại C-2, C7 và C-9 lần lượt có mang nhóm thế -OAc. Tại C-10 có δH 5,30 và C 72,8 ppm nên nhóm –OH gắn tại C-10. Từ các kết quả trên, hợp chất (3) được đề nghị là 10- deacetyl taxinin B. So sánh dữ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất (3) với các tài liệu đã được công bố thì dữ liệu phổ của (3) trùng khớp với dữ liệu phổ của 10-deacetyl taxinin B [116]. Từ các kết quả phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR, hợp chất (3) 61 được xác định là 10-deacetyl taxinin B. Chất này đã được tìm thấy trong loài Taxus cuspidata Sibe et Zucc. vào năm 1994 [116]. Hình 3.6. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (3) Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất (3) 62 Bảng 3.7. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (3) và 10-deacetyl taxinin B C Hợp chất (3) 10- deacetyl taxinin B [116] δC* δH (J, Hz)*1 δC** δH (J, Hz)**1 1 48,7 2,23; dd (1,5; 7) 48,7 2,20, dd (1,5; 7) 2 68,6 5,60; dd (6; 3,2) 68,6 5,60, dd (6; 3,2) 3 42,0 3,32; d (6) 42,0 3,33, d (6) 4 139,8 - 139,8 - 5 76,2 5,30; t (3) 76,2 5,30, t (3) 6a 35,1 1,76; m 35,1 1,76, m 6b 2,08; m 2,09, m 7 69,6 5,38; dd (6; 11) 69,6 5,38, dd (6; 11) 8 47,6 - 47,6 - 9 75,0 5,83; d (10) 75,0 5,80, d (10) 10 72,8 5,28; d (10) 72,8 5,28, d (10) 11 150,5 - 150,5 - 12 138,6 - 138,6 - 13 199,3 - 199,3 - 14a 36,2 2,38; d (20) 36,2 2,38, d (20) 14b 2,86; dd (20, 7) 2,86, dd (20, 6) 15 37,4 - 37,4 - 16 37,8 1,23; s 37,8 1,24, s 17 25,3 1,80; s 25,3 1,82, s 18 14,3 2,24; s 14,3 2,23, s 19 13,2 1,02; s 13,2 1,02, s 20a 118,8 4,90; s 118,8 4,90, s 20b 5,42; s 5,42, s 21 166,2 - 166,2 - 22 117,4 6,44; d (15,5) 117,4 6,45, d (16) 23 146,4 7,69; d (15,5) 146,4 7,60, d (16) 2- OAc 169,3 - 169,3 - Me 20,8 2,08; s 20,8 - 7- OAc 169,7 - 169,7 - Me 21,3 2,08; s 21,3 - 9- OAc 169,7 - 169,7 - Me 21,4 2,08; s 21,4 - 1′ 134,5 - 134,5 - 2′, 6′ 129,0 7,78; d (7) 129,0 7,80 3′, 5′ 128,6 7,42; m 128,6 7,42 4′ 130,5 7,44; m 130,5 7,42 Ghi chú: *: ppm, 125 MHz, CDCl3.; *1: ppm, 500 MHz, CDCl3. **: ppm, 125 MHz, CDCl3.; **1: ppm, 500 MHz, CDCl3 63 Hợp chất (4) Hợp chất (4) là kết tinh dạng bột mịn, không màu, lấp lánh, tan trong cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, hơi tan trong MeOH. Sau khi khai triển SKLM, hợp chất (4) có vết tắt quang khi soi dưới đèn UV 254 nm, và hiện màu nâu với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C trong 5 phút (xem Hình PL1.1), sơ bộ xác định được hợp chất (4) thuộc nhóm terpen. Phổ UV-Vis của hợp chất (4) trong methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 217 và 278 nm, tương ứng với các taxoid [34]. Khối phổ cho mảnh m/z 747,05 [M+Na]+ là pic cơ bản, do vậy hợp chất (4) có mảnh khối lượng phân tử [M] là 724 đơn vị khối tương ứng với công thức nguyên là C39H48O13, độ bất bão hòa là 16 [43]. Phổ 13C NMR kết hợp với phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 39 carbon bao gồm: Năm carbon carbonyl ester với C 170,6; 170,2; 169,3; 170,4; 168,5. Hai nhóm carbon olefin bậc bốn với C 124,3 và 144,2. Một carbon olefin bậc hai với C 110,9. Hai carbon bậc ba với C 50,4 và 40,8 và carbon bậc bốn với C 142,6. Bốn carbon đặc trưng cho vòng thơm với C 134,2; 128,1 (2C); 128,9 (2C). Bốn carbon bậc ba mang oxygen với C 68,4; 67,4; 70,4; 76,7; 78,5. Một carbon bậc bốn mang oxygen với C 77,3. Từ kết quả MS trên cho thấy chất này có độ bất bão là 16. Thêm kết quả phổ 13C NMR cho thấy có các nhóm chức gồm 5 nhóm –OAc (độ bất bão hòa là 5), 1 nhóm C=O este (độ bất bão hòa là 1), 3 nhóm olefin (độ bất bão hòa là 3), 1 vòng thơm (độ bất bão hòa là 4). Vậy cấu trúc khung của hợp chất (4) có 3 vòng. Phổ 1H NMR của hợp chất (4) cho các tín hiệu proton tương tự như của hợp chất (1), nhưng có sự hiện diện của 5 nhóm -OAc H [1,96 (3H, s); 2,10 (3H, s); 2,00 (3H, s); 2,02 (3H, s)] và 2,20 (3H, s) và 1 nhóm -OH [2,10 (1H, s)]. Nên đây cũng là hợp chất có cấu trúc khung 6/8/6 giống hợp chất (1) nhưng khác ở một số nhóm thế, tiếp tục xác định cấu trúc bằng phổ HMBC và COSY. Phổ MS của (4) có mảnh m/z 362 đặc trưng cho khung 6/8/6 và 2 mảnh m/z 150 đặc trưng cho nhóm cinnamoyl. 64 So sánh dữ liệu phổ của hợp chất (4) với các hợp chất đã được công bố thì dữ liệu của (4) hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của taxuspin D, một hợp chất đã được tìm thấy trong loài Taxus cuspidata [42]. Cấu trúc của hợp chất (4) và chuyển dịch hóa học của các carbon và proton trên phân tử được xác định bằng các dữ liệu phổ NMR. Hình 3.8. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (4) Hình 3.9. Cấu trúc của hợp chất (4) 65 Bảng 3.8. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (4) với taxuspin D C Hợp chất (4) Taxuspin D [42] δC* δH (J, Hz)*1 δC** δH (J, Hz)**1 1 50,4 1,89; dd (1,5; 7,5) 50,4 1,89; (dd) 2 68,4 5,80; d (7,0) 68,3 5,80; d (6,8) 3 40,8 3,70; d (7,0) 40,8 3,69; d (6,8) 4 142,6 - 142,6 - 5 67,4 5,34; dd (9,4; 6,2) 67,2 5,34; dd (9,4; 6,2) 6 32,7 2,07; (m) 32,7 2,06; (m) 7 70,4 4,85; (m) 70,4 4,80; (m) 8 43,0 - 43,1 - 9 76,7 4,85; d (5) 76,4 4,84; (m) 10 78,5 5,60; d (5) 78,7 5,60; d (4,8) 11 77,3 - 77,3 - 12 124,3 - 124,3 - 13 144,2 - 144,2 - 14a 25,8 2,36; d (18,5) 25,8 2,36; d (17,8) 14b 2,57; dd (18,5; 7,5) 2,57; dd (17,8; 6,8) 15 41,3 - 41,3 - 16 24,1 1,49; (s) 24,1 1,49; (s) 17 31,3 1,17; (s) 31,3 1,17; (s) 18 11,6 1,57; (s) 11,6 1,57; (s) 19 14,8 1,53; (s) 14,8 1,53; (s) 20a 110,9 5,20; (s) 110,9 5,20; (s) 20b 5,08; (s) 5,08; (s) 21 165,2 - 165,2 - 22 117,8 6,46; d (16) 117,8 6,46; d (16) 23 145,1 7,70; d (16) 145,1 7,70; d (16) 1′ 134,2 - 134,2 - 2′, 6′ 128,1 7,54; (m) 128,1 7,54; (m) 3′, 5′ 128,9 7,40; (m) 128,9 7,40, (m) 4′ 130,4 7,54; (m) 130,4 7,54, (m) 2-OAc 170,6 - 170,6 - Me 21,5 1,96; (s) 21,4 1,96; (s) 7-OAc 170,2 - 170,2 - Me 21,2 2,10; (s) 21,2 2,19; (s) 9-OAc 169,3 - 169,3 - Me 21,2 2,00; (s) 21,7 2,00; (s) 10-OAc 170,4 - 170,4 - Me 20,7 2,02; (s) 21,2 2,02; (s) 13-OAc 168,5 - 168,5 - Me 20,7 2,20; (s) 20,2 2,20; (s) Ghi chú: *: ppm, 125 MHz, CDCl3.; *1: ppm, 500 MHz, CDCl3. **: ppm, 125 MHz, CDCl3.; **1: ppm, 500 MHz, CDCl3. 66 Hợp chất (5) Hợp chất (5) là kết tinh dạng rắn vô định hình, không màu, có ánh lấp lánh, tan trong cloroform, dicloromethan, ethyl acetat, hơi tan trong methanol. Sau khi khai triển SKLM, hợp chất (5) có vết tắt quang khi soi dưới đèn UV 254 nm, và hiện màu hồng chuyển sang nâu với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C trong 5 phút (xem Hình PL1.1), sơ bộ xác định được hợp chất này cũng thuộc nhóm terpen. Phổ UV của (5) trong MeOH cho các đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 219 nm và 279 nm. Điều này phù hợp với các hợp chất taxoid vì các taxoid có đỉnh hấp thu cực đại trong khoảng 190 nm – 300 nm [42]. Phổ MS – ES+ trong MeOH có pic m/z 825,05 là mảnh [M+Na]+, do vậy hợp chất (5) có mảnh khối lượng phân tử [M]+ là 802, tương ứng với công thức nguyên là C44H48O13, độ bất bão hòa Ω = 21. Phổ 13C NMR kết hợp với phổ DEPT 90 và DEPT 135 cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 44 carbon bao gồm: Bốn carbon carbonyl ester [C 170,3; 169,2; 169,8)]. Hai nhóm carbon olefin bậc bốn [C 135,9 và 148,2]. Sáu carbon bậc ba mang oxygen [C 67,9; 84,8; 70,6; 76,4; 68,7; 79,1]. Tám carbon đặc trưng cho vòng thơm [C 134,1; 129,0 (2C); 130,7; 128,8 (2C); 129,1; 129,5; 128,2; 133,4 (-Ph)]. Kết quả MS trên cho thấy hợp chất (5) có độ bất bão là 21. Thêm kết quả phổ 13C NMR cho thấy có các nhóm chức gồm 4 nhóm –OAc (độ bất bão hòa là 4), 3 nhóm C=O este (độ bất bão hòa là 3), 2 nhóm olefin (độ bất bão hòa là 2), 2 vòng thơm (độ bất bão hòa là 8). Vậy cấu trúc khung của hợp chất (5) có 4 vòng. Phổ 1H NMR cho tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của: Bốn nhóm methyl δH [1,19 (3H, s); 1,23 (3H, s); 2,01 (3H, s)] và 1,72 (3H, s) đặc trưng cho khung taxan diterpen và MS có mảnh m/z 218 đặc trưng cho khung 5/7/6 [113]. Các tín hiệu δH [4,39 (1H; d; 8,0); 4,50 (1H; d; 8,0] và C 74,7 đặc trưng cho sự hiện diện vòng oxetan trong phân tử. Bốn nhóm -OAc H [2,01 (3H, s); 2,10 (3H, s); 1,76 (3H, s]. Bốn proton oxymethin H [6,17 (1H; d; 8,0); 5,01 (1H; d; 8,0); 5,62 (1H; t; 8,3); 6,22 (1H; d; 11,0) và 6,61 (1H; d; 11,0)]. Hai nhóm methylen H [1,92 67 (1H; dd; 9,0; 15,5); 2,60 (1H, m), và 1,72 (1H, m); 2,45 (1H; dd; 7,5; 14,8)]. Một nhóm proton methin H [3,04 (1H; d; 8,0)]. Nhóm methylen gắn trên carbon mang oxygen H [4,39 (1H; d; 8,0) và 4,50 (1H; d; 8,0)]. Một nhóm cinnamoyl H [6,50 (1H; d; 16,0); 7,70 (1H; d; 16,0); 7,80 (2H; d; 8,0) và 7,56 (3H, m)]. Các tín hiệu 1H-NMR ở δH 7,80 (2H, d; 8,0 Hz); 7,56 (1H, m) và 7,56 (2H, m) cho thấy sự hiện diện của benzoat. Phổ MS của (5) cũng có 2 mảnh m/z 150 và 107 lần lượt đặc trưng cho nhóm cinnamoyl và nhóm benzoyl. Ngoài ra, cực đại hấp thụ UV ở 219 và 279 nm cũng hỗ trợ cho thấy có sự hiện diện của nhóm cinamoyl. So sánh dữ liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất (5) với các chất đã được công bố thì dữ liệu của hợp chất (5) hoàn toàn trùng khớp với cấu trúc của taxchinin B [37]. Hình 3.10. Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (5). 68 Bảng 3.9. So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất (5) với taxchinin B C Hợp chất (5) Taxchinin B [37] δC* δH (J, Hz)*1 δC** δH (J, Hz)**1 1 68,2 - 68,2 - 2 67,9 6,17; (d; 8,0) 67,9 6,18; (d; 7,9) 3 44,7 3,04; (d; 8,0) 44,7 3,04; (d; 7,8) 4 79,4 - 79,4 - 5 84,8 5,01; (d; 8,0) 84,7 5,01; (d; 7,6) 6 34,9 1,92; (dd; 9,0; 15,5) 34,8 1,92; (dd; 8,3; 15,4) 2,60; (m) 2,60; (m) 7 70,6 5,62; (t; 8,3) 70,6 5,62; (t; 8,3) 8 43,7 - 43,7 - 9 76,4 6,22; (d; 11,0) 76,4 6,22; (d; 10,9) 10 68,7 6,61; (d; 11,0) 68,6 6,62; (d; 10,9) 11 135,9 - 135,9 - 12 148,2 - 148,2 - 13 79,1 5,62; (t; 6,7) 79,1 5,62; (t; 6,7) 14a 37,4 1,72; (m) 37,3 - 14b 2,45; (dd; 7,5; 14,8) 2,46; (m) 15 75,7 - 75,7 - 16 27,7 1,19; (s) 27,7 1,23; (s) 17 25,4 1,23; (s) 25,4 1,21; (s) 18 12,1 2,01; (s) 12,1 2,01; (s) 19 12,5 1,72; (s) 12,5 1,72; (s) 20a 74,7 4,39; (d; 8,0) 74,7 4,39; (d; 7,7) 20b 4,50; (d; 8,0) 4,50; (d; 7,7) 21 166,6 - 166,5 - 22 117,4 6,46; (d; 16) 117,4 6,47; (d; 16) 23 146,0 7,80; (d; 16) 146,0 7,80; (d; 16) 1′ 134,1 - 134,1 - 2′, 6′ 129,0 7,87; (d; 8) 129,1 7,87; (d; 7,3) 3′, 5′ 128,8 7,56; (m) 128,8 7,56; (m) 4′ 130,7 7,56; (m) 130,6 7,56; (m) 2-OAc 170,3 - 170,3 - Me 21,6 2,01; (s) 21,6 2,01; (s) 4-OAc 169,2 - 169,2 - Me 22,0 2,01; (s) 22,0 2,01; (s) 7-OAc 169,8 - 169,8 - Me 21,4 2,10; (s) 21,4 2,10; (s) 9-OAc 169,8 - 169,8 - Me 20,6 1,76; (s) 20,6 1,76; (s) 69 C Hợp chất (5) Taxchinin B [37] δC* δH (J, Hz)*1 δC** δH (J, Hz)**1 10- OC=OC6H5 164,1 - 164,1 - Ph 129,1 - 129,0 - 129,5 7,43; (m) 129,5 7,43; (m) 128,2 7,43; (m) 128,2 7,43; (m) 133,4 7,43; (m) 133,4 7,43; (m) Ghi chú: *: ppm, 125 MHz, CDCl3.; *1: ppm, 500 MHz, CDCl3. **: ppm, 125 MHz, CDCl3.; **1: ppm, 500 MHz, CDCl3 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất (5). 3.2. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU Các hợp chất taxoid phân lập được từ lá Thông đỏ lá dài từ mục 3.1 đều có độ tinh khiết cao > 95%, có thể làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên, do hợp chất taxchinin B chỉ phân lập được khối lượng là 105 mg < 150 mg nên không đủ để thiết lập chất đối chiếu. Vì vậy, các hợp chất được chọn làm nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu là 04 hợp chất: Taxinin B, taxuspin F, 10- deacetyl taxinin B, taxuspin D. 70 Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu Thử tinh khiết bằng SKLM Chấm 04 mẫu thử (taxinin B, taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D) trên 03 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau, soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm, hiện màu với thuốc thử H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C trong 5 phút. Các hệ dung môi khảo sát: Hệ dung môi 1: PE : ethanol (9 : 1) Hệ dung môi 2: Acetonitril : methanol (7 : 3) Hệ dung môi 3: Dicloromethan : aceton (6 : 4) Mỗi mẫu thử dương tính với TT H2SO4 10%/ethanol 96%, sấy ở 105 °C trong 5 phút, mỗi mẫu chỉ cho 01 vết màu nâu duy nhất trên bản mỏng. Vậy cả 3 hợp chất tin