Luận án Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson - Nguyễn Thị Mai Hương

trên 1 b n kinh (bệnh nhân bị liệt, co cứng các chi và cơ m -2A>G) (Hình 3.7). có 2 đột biến dị hợp tử: (1) F1026Y trên trí c.3077 bị thay bằng nucleotid A do đó b 1026 chuyển thành bộ ba TAT mã hóa Tyrosin ến thêm ã làm cho ịch mã, (2) là đột ứu là đột ợp tử kép ện F1026Y ệnh nhân ặt) ộ ba TTT (Y); (2) IVS12-2A>G trên intron trí c.2866, cách nucleotid cu Hình 3.7. Trình t  Các đa hình trên gen Qua phân tích trình tự phát hiện thêm 22 đa hình, g xảy ra trên các intron (Bảng 3.5) Bảng 3.5. Các đa hình trên gen Đa hình acid amin/intron cDNA S406A c.1216T>G V456L c.1366G>C L770L c.2310C>G K832R c.2495A>G G859G c.2577A>G R952K c.2855G>A V1140A c.3419T>C V1297I c.3889G>A IVS3-53A>C c.1544-53A>C IVS9-25G>A c.2448-25A>G IVS10-59T>A c.2576-59T>A IVS12-14T>A c.2866-14T>A 63 12 làm thay đổi nucleotid A thành nucleotid G ối cùng exon 12 là 2 nuleotid. ự gen của bệnh nhân mã số WBW140801 ATP7B gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson, nghiên c ồm có 8 đa hình xảy ra trên exon và 14 đa h . ATP7B được phát hiện trong nghiên c Vị trí Tài liệu tham khảo Cu4 Thomas và cs, Cu4/5 Figus và cs, 1995 TM 4 Nanji và cs, 1997 Tm 4/Td Figus và cs, 1995 Td Mới Tm 5 Thomas và cs, ATP loop Figus và cs, 1995 ATP hinge Loudianos và cs, Intron 3 Shah và cs, 1997 Intron 9 Figus và cs,1995 Intron 10 Mới Intron 12 Mới ở vị ứu đã ình khác ứu 1995 1995 1999 64 IVS12-57T>A c.2866-57T>A Intron 12 Mới IVS13-12T>C c.3061-12T>C Intron 13 Garcia-Villareal, 2000 Đa hình (tiếp) Vị trí Tài liệu tham khảo acid amin/intron cDNA IVS13+67T>C c.30601+67T>C Intron 13 Mới IVS15+75G>A c.3413+75G>A Intron 15 Mới IVS15-97T>C c.3413-97T>C Intron 15 Mới IVS15-51G>C c.3413-51G>C Intron 15 Mới IVS18+6C>T c.3903T>C Intron 18 Figus và cs, 1995 IVS18+50G>C c.3903+50G>C Intron 18 Mới IVS19+50G>C c.4021+50G>C Intron 19 Cox và cs, 2005 IVS20-49delA c.4124-49delA Intron 20 Trong số 22 đa hình trên gen ATP7B, 13 đa hình đã được công bố và 9 đa hình mới lần đầu được phát hiện trong nghiên cứu.  Sự phân bố các đột biến trên gen ATP7B Đột biến gen xảy ra trên 9 exon và 4 intron của gen ATP7B (Bảng 3.6). Bảng 3.6. Tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7B Exon/Intron Tổng số alen đột biến Tỷ lệ (%) Exon 2 65 43,0 Exon 8 13 8,6 Exon 10 8 5,3 Exon 11 2 1,3 Exon 13 6 4,0 Exon 14 10 6,6 Exon 16 15 9,9 Exon 18 9 6,0 Exon 20 9 6,0 Intron 6 2 1,3 Intron 12 1 0,7 Intron 14 10 6,6 Intron 20 1 0,7 Tổng 151 100 Trong số các vị trí xác định được đột biến trên gen ATP7B, 5 exon có tỷ lệ phát hiện đột biến cao nhất trong nghiên cứu bao gồm: exon 2 (43,0%), exon 16 (9,9%), exon 8 (8,3%), exon 14 và intron 14 (6,6%). Một số vùng khác của gen 65 ATP7B chỉ có 1 hoặc 2 bệnh nhân Wilson bị đột biến chẳng hạn như intron 12, intron 20, intron 6 và exon 11. Hình 3.8. Biểu đồ tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7B Biểu đồ trên Hình 3.8 biểu thị tỷ lệ phát hiện đột biến trên các vùng gen ATP7B. Phân tích kết quả cho thấy đột biến gen ATP7B xảy ra tập trung trên một số vùng gen nhất định. Exon 2 có tỷ lệ phát hiện đột biến cao nhất, tiếp đến là 4 exon bao gồm: exon 8, exon 14, exon 16, exon 18, exon 20 và intron 14. Dựa trên kết quả phân tích đột biến gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson, nghiên cứu đã xây dựng được biểu đồ vị trí và tỷ lệ của các đột biến gen, các exon và intron của gen ATP7B (Hình 3.9). Exon 2 có 3 đột biến S105X, V176SfsX28, H251AfsX19; intron 6 có một đột biến chưa được công bố trên thế giới là IVS6+3A>G; exon 8 có 5 đột biến, bao gồm: D765G, R778L, M769HfsX27, P868PfsX5, [R723S; H724TfsX34]; exon 10 có 1 đột biến: T850I; exon 11 có 1 đột biến L902P; intron 12 có 1 đột biến: IVS12-2A>G; exon 13 có 2 đột biến P992L, K1010T; exon 11 có 1 đột biến L902P; intron 12 có 1 đột biến: IVS12-2A>G; exon 13 có 2 đột biến P992L, K1010T; exon 14 có 4 đột biến: V1042CfsX79, F1026Y, D1027H, P1052L; exon 16 có 2 đột biến: 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Tỷ lệ phát hiện đột biến trên một số vùng của gen ATP7B Tỷ lệ đột biến Hình 3.9. Chú thích: chữ màu đỏ là các đột biến mới, chữ vùng thường xảy ra đột biến. 66 Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên c màu xanh là tên các đột biến đã được công bố; exon được đổ màu đ ứu ỏ, chữ đậm là các exon thuộc 67 I1148T, E1173K; exon 18 có 4 đột biến P1245S, N1270S, P1273Q, G1281D; exon 20 có 1 đột biến: L1371P, intron 20 có 1 đột biến: IVS20+4A>G. Như vậy, dựa trên các vùng chức năng của gen, đột biến được phân bố như sau: (1) Vùng gắn đồng kéo dài từ exon 2 đến exon 6, có 3 đột biến trên exon 2, gồm: 2 đột biến dịch khung, 1 đột biến sai nghĩa. Trên vùng gắn đồng có 1 đột biến mới là đột biến dịch khung. (2) Vùng vận chuyển xuyên màng 1-6 kéo dài từ exon 6 đến exon 13 có 11 đột biến xảy ra trên intron 6, exon 8, exon 11-14, gồm: 3 đột biến dịch khung, 6 đột biến sai nghĩa và 2 đột biến vùng cắt nối. Vùng vận chuyển xuyên màng có 3 đột biến mới, trong đó có 2 đột biến dịch khung và 1 đột biến vùng cắt nối của gen. (3) Vùng liên kết với ATP kéo dài từ exon 14 đến một phần của exon 18 có 11 đột biến xảy ra trên exon 14, intron 14, exon 16 và exon 18, bao gồm: 1 đột biến dịch khung, 9 đột biến sai nghĩa và 1 đột biến vùng cắt, nối. Hai đột biến mới trên vùng liên kết đồng của ATP7B bao gồm: 1 đột biến mới là đột biến dịch khung và 1 đột biến mới là đột biến sai nghĩa. (4) Vùng vận chuyển xuyên màng 7-8 hay còn là vùng photphoryl hóa (vùng P) gồm 1 phần của từ exon 18 đến exon 21. Trên vùng gen này có thêm một đột biến vùng cắt nối ở intron 20. Với các kết quả phát hiện đột biến trên gen ATP7B thu được trong nghiên cứu, chúng tôi khuyến cáo đưa ra quy trình phân tích đột biến gen ATP7B trên bệnh nhi mắc bệnh Wilson ở Việt Nam như trên Hình 3.10. Qui trình xét nghiệm gồm 4 bước như sau: 1. Bệnh nhân được phát hiện đột biến trên exon 2. 2. Bệnh nhân được phát hiện đột biên trên 6 exon bao gồm: exon 8, exon 14- 16, exon 18, exon 20. 3. Bệnh nhân tiếp tục được phát hiện đột biến trên 5 exon, bao gồm: exon 6, exon 10 đến exon 13. 4. Bệnh nhân được phát hiện đột biến trên 9 exon còn lại của gen ATP7B. Hình 3.10. Sơ đồ các bư Chú thích: Quy trình phân tích đột biến gen tự trực tiếp exon 2; (2) giải trình tự trực ti (exon 6, 10-14); (4) giải trình tự trực tiế biến trên 2 bản sao của gen ATP7B. 68 ớc phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhi mắc b ATP7B cho bệnh nhân nhi mắc bệnh Wilson được chia làm ếp 6 exon (exon 8, 14, 16, 18, 20 và 15 (intron 14)); (3) p 9 exon còn lại của gen ATP7B (exon 1, 3-6, 7, 9, 17, 19, 21) ệnh Wilson 4 bước: (1) giải trình giải trình tự trực tiếp 5 exon ; dị hợp tử kép: 2 đột 69 3.1.1.4. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân có đột biến mới trên gen ATP7B Bảy đột biến mới được phát trong nghiên cứu gồm 4 đột biến thêm/mất 1 nuleotid hoặc 1 đoạn nucleotid không cần thiết phải phân tích bằng các chương trình tin sinh, ba đột biến mới còn lại, bao gồm: F1026Y được phát hiện trên bệnh nhân có kiểu hình thể bệnh gan-thần kinh; đột biến IVS6+3A>G, IVS20+4A>G được phát hiện trên bệnh nhân Wilson thể bệnh gan và các đột biến này sẽ tiếp tục được phân tích bằng chương trình tin sinh (Bảng 3.7). Kiểu gen của 3 bệnh nhân Wilson có đột biến mới vùng intron lần lượt là: F1026Y/IVS12-2A>G, IVS6+3A>G/V176SfsX28, IVS20+4A>G/S105X (Phụ lục 4). Bảng 3.7. Kết quả phân tích đột biến mới bằng chương trình tin sinh STT Đột biến Exon/ Intron Kết quả phân tích acid amin/intron cDNA Polyphen- 2 (Score) SIFT Mutation Taster BDGP/ MaxEntScan 1 F1026Y c.3077T>A Exon 14 1,0 0,00 0,99 2 IVS6+3A>G c.1946+3A>G Intron 6 + 3 IVS20+4A>G c.4124+4A>G Intron 20 + Tham khảo SIFT ≤ 0,05 damaging (gây bệnh) > 0,05 tolerated (không gây bệnh) Polyphen-2 >0,85 probably damaging (có khả năng gây bệnh) >0,15 possibly damaging (có thể gây bệnh) benign (lành tính) MutationTaster 0-1 disease causing (có thể gây bệnh) BDGP/MaxEntScan + ảnh hưởng đến vùng trượt gen Nghiên cứu đã đối chiếu kết quả giải trình tự gen ATP7B với các kết quả xét nghiệm cận lâm sàng (Bảng 3.8) của 7 bệnh nhân có đột biến mới trên gen ATP7B và cho thấy 8 bệnh nhân Wilson đã đủ điểm chẩn đoán bệnh theo thang điểm Leipzig. Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình SIFT (mã GI: 55743071/NP_000044), Popyphen-2 (SWISS-Prot: P35670) và MutationTaster (ENST00000242839; NM_000053) lần lượt đạt được số điểm là 0,00; 1,0; 0,99 (Hình 3.11-3.12). 70 Bảng 3.8. Kiểu gen, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 7 bệnh nhân Wilson có đột biến mới Mã bệnh nhân Kiểu gen (alen/alen) Điểm WD* Kiểu hình Vòng KF s-Cp Đồng niệu/24h Đồng tự do AST ALT PT WBW100604 H251AfsX19/S105X 7 Gan + 0,0190 150 - 139,1 116,9 22% WBW140801 F1026Y/IVS12-2A>G 8 Gan-Thần kinh + 0,0032 1330 49 26,82 20,1 49% WBW160101 V176SfsX28/IVS6+3A>G 4 Gan - 0,0341 200 4,53 145,54 269,5 - WBW160503 S105X/IVS20+4A>G 4 Gan - 0,0120 167 Thấp 61 26 31% WBW160507 V1042CfsX79/IVS14-2A>G 5 Gan-Thận - 0,0108 263 0,08 - - - WBW160609 S105X/(R723S;H724TfsX34) 5 Phù - 0,0279 432 2,1 - - 89% PWBW170306F IVS6+3A>G/M769HfsX26 7 Thần kinh + 0,0023 WBW170704 S105X/P868PfsX5 7 Gan-Thận + 0,0920 3639 11,6 129 55,7 17% Ghi chú: *Điểm Wilson tính theo xét nghiệm sinh hóa và điểm của một đột biến đã công bố (chưa tính điểm đột biến mới); KF (Kayser-Fleisher); s- Cp (serum ceruloplasmin - ceruloplasmin huyết thanh, bình thường 0,2-0,6 g/L (chuẩn của khoa Sinh hóa-Bệnh viện Nhi Trung Ương); đồng niệu 70%. 71 Hình 3.11. Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình SIFT Chú thích: sự thay thế tại vị trí 1026 từ acid amin F sang V được dự đoán có ảnh hưởng đến chức năng protein với số điểm là 0,00 Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình SIFT đạt kết số điểm là 0 và được kết luận là một đột biến có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein ATP7B (affected protei function). Hình 3.12. Kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình Polyphen-2 và MutationTaster Chú thích: Alteration (sự thay đổi); Prediction (dự đoán); disease causing (gây bệnh); summary (tóm tắt); amino acid sequence changed (acid amin bị thay đổi); protein features (might be) affected (đặc điểm protein có thể bị ảnh hưởng). 72 Tương tự, kết quả phân tích đột biến F1026Y bằng chương trình Polyphen-2 cho thấy đột biến F1026Y có thể gây bệnh (pobably damaging) trong khi kết quả phân tích bằng chương trình Mutation taster cũng cho thấy F1026Y là một đột biến gây bệnh (disease causing) (Hình 3.12). Kết quả phân tích đột biến IVS6+3A>G và IVS20+4A>G bằng chương trình MaxEntScan (Bảng 3.9) cho thấy, cả 2 đột biến trên đều ảnh hưởng đến trượt gen. Bảng 3.9. Kết quả phân tích đột biến vùng cắt, nối của gen ATP7B Đột biến Trình tự MaxEntScan MDD MM WMM IVS6+3A>G Trình tự chuần gcaGTAGGT 4,53 8,18 5,26 3,98 Trình tự đột biến gcaGTGGGT 1,33 6,28 3,21 2,60 IVS20+4A>G Trình tự chuần gtgGTGAGT 8,95 12,88 8,31 6,08 Trình tự đột biến gtgGTGGGT 4,29 9,18 4,98 6,08 Chú thích: chữ thường (nucleotid vùng exon); chữ hoa (nucleotid vùng intron, theo qui định của phần mềm); chữ gạch dưới (nucleotid bị đột biến); MDD (Muximum Dependence Decomposition); NM (First order Markov Model); WMM (Weight Matrix Model). Phần mềm MaxEntScan dựa trên phương pháp mô hình hóa các đoạn gen có trình tự ngắn tham gia trong quá trình cắt, nối RNA, đồng thời tính toán các vị trí nuleotid có gần kề nhau hay không. Giá trị MDD và WMM đánh giá mức độ độc lập của các nucleotid, cho thấy vị trí đột biến càng gần kề exon thì điểm càng thấp, và do vậy nguy cơ ảnh hưởng đến trượt gen càng cao. Kết quả phân tích đột biến IVS6+3A>G và IVS20+4A>G bằng chương trình MaxEntScan cho thấy, trình tự gen khi bị đột biến có giá trị MaxEntScan, MDD, FMM, WMM thấp hơn rất nhiều so với giá trị của trình tự chuẩn. Điều này cho thấy hai đột biến trên có thể ảnh hưởng đến vị trí cắt nối trong quá trình dịch mã tạo ra phân tử mRNA. Để khẳng định chắc chắn, nghiên cứu đã lựa chọn đột biến IVS20+4A>G để tiếp tục phân tích bằng phần mềm BDGP. Đây là đột biến trên vùng intron 20, làm thay thế nucleotid Adenin ở vị trí cách nucleotid cuối cùng của exon 20 là 4 nucleotid. Kết quả phân tích bằng phần mềm BDGP cũng cho thấy đột biến đã ảnh hưởng đến vị trí cắt nối trên intron 20 của gen ATP7B (Hình 3.13). 73 A. B. Hình 3.13. Kết quả phân tích đột biến IVS20+4A>G bằng phần mềm BDGP Chú thích: A. Trình tự chuẩn; B. Trình tự bị đột biến IVS20+4A>G; Start (điểm bắt đầu cắt, nối); End (điểm kết thúc cắt, nối); Score (điểm đạt được); Donor (chiều xuôi, 5’-3’); Acceptor (chiều ngược, 3’-5’). Khi so sánh vị trí cắt, nối luân phiên và điểm (score) đạt được của trình tự chuẩn và trình tự bị đột biến IVS20+4A>G cho thấy, vị trí cắt xuôi chiều (chiều 5’- 3’, donor) có trình tự cắt tương tự nhưng và điểm đạt được khác nhau: trình tự 74 chuẩn đạt được 0,99 trong khi trình tự bị đột biến đạt được 0,49. Tương tự trên vị trí cắt ngược chiều (chiều 3’=5’, acceptor), điểm đạt được trên trình tự chuẩn ở vị trí 295 trên trình tự chuẩn đạt được 0,78 nhưng trình tự bị đột biến chỉ có 0,86 và điểm đạt được để đánh giá vị trí cắt từ vị trí 277 đến 317 trên trình tự chuẩn đạt 0,45 nhưng trình tự bị đột biến đạt 0,7. 3.1.2. Xác định đột biến gen ATP7B cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson 3.1.2.1. Kết quả phát hiện đột biến gen cho bố, mẹ bệnh nhân Wilson Qua phân tích kết quả sàng lọc đột biến đích cho 208 thành viên (Phụ lục 1) trong 55 phả hệ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson. Trong 55 phả hệ nghiên cứu, một số bố, mẹ của bệnh nhân đã mất hoặc không thể thu thập được mẫu nên nghiên cứu chỉ tiến hành phát hiện đột biến cho 49 người bố và 53 người mẹ (Bảng 3.11). Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc đột biến gen ATP7B cho các thành viên của 55 phả hệ Kết quả Bố bệnh nhân Mẹ bệnh nhân Anh/chị/em ruột Các thành viên khác Đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 0 0 13 0 Đột biến dị hợp tử 49 53 53 12 Không bị đột biến 0 0 17 11 Tổng 49 53 83 23 Qua phân tích kết quả, nghiên cứu đã nghiên cứu đã phát hiện thêm 13 trường hợp bị đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép (Bảng 3.10). Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã xác định được 65 người bị đột bị đột biến dị hợp tử và 106 người không bị đột biến đích. Trong 55 phả hệ nghiên cứu, một số bố, mẹ của bệnh nhân đã mất hoặc không thể thu thập được mẫu nên nghiên cứu chỉ tiến hành phát hiện đột biến cho 49 người bố và 53 người mẹ (Bảng 3.11). 75 Bảng 3.11. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở bố, mẹ của bệnh nhân Wilson Bố/mẹ bệnh nhân Kết quả Tỷ lệ (%) Có mang gen bệnh Không mang gen bệnh Người bố 49 0 100 Người mẹ 53 0 100 Kết quả phân tích đột biến đích trên gen ATP7B ở Bảng 3.11 cho thấy, bố mẹ bệnh nhân Wilson đều là người mang gen bệnh. 3.1.2.2. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson Qua phân tích kết quả sàng lọc đột biến đích cho anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson, nghiên cứu đã phát hiện thêm 13 trường hợp bị đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép trên 2 bản sao của gen ATP7B. Ngoài ra, nghiên cứu đã phát hiện 53 trường hợp là người mang gen bệnh (có 1 đột biến dị hợp tử), 17 trường hợp không mang gen bệnh (không có đột biến gen ATP7B) (Bảng 3.12). Bảng 3.12. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson Kết quả Tần suất (n) Tỷ lệ (%) Bị bệnh 13 15,7 Có mang gen bệnh 53 65,0 Không mang gen bệnh 17 20,1 Tổng 83 100 Như vậy, nghiên cứu đã phát hiện thêm 13 trường hợp là anh, chị, em của bệnh nhân bị bệnh Wilson (Bảng 3.12), 8/13 trường hợp đã đủ điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo thang điểm Leipzig và các bệnh nhân này đã có biểu hiện lâm sàng; 5/13 trường hợp còn lại chưa đủ điểm để kết luận bệnh theo thang điểm Leipzig mà chỉ được chẩn đoán xác định bệnh Wilson sau khi có kết quả phát hiện đột biến gen ATP7B. Trong số 5 trường hợp này, 3/5 trường hợp chưa có bất kì triệu chứng nào của bệnh, 2/5 trường hợp bị tăng men gan nhẹ (Bảng 3.13). 76 Bảng 3.13. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình Ca bệnh Mã bệnh nhân Tuổi/giới* Kiểu hình Cp (g/l) Đồng niệu/24h (mg) Vòng KF Điểm** Kiểu gen Điểm** Chỉ điểm WBW100605 nam/14 suy gan tối cấp không S105X/S105X Sàng lọc WBW160401 nam/11 thể gan S105X/S105X 4 Chỉ điểm WBW100901 nữ/10 thần kinh 0,020 có 6 S105X/S105X 10 Sàng lọc WBW151002B nam/3t - 0,021 ≤0,05 không 2 S105X/S105X 6 Chỉ điểm WBW120501 nam/11 thể gan 0,060 0,516 có 6 V176SfsX28/P1273Q 10 Sàng lọc WBW120501B nam/9 thể gan 0 V176SfsX28/P1273Q 4 Chỉ điểm PWBW160402S nữ/18 thể gan không 0 T850I/IVS14-2A>G 4 Sàng lọc WBW160402 nam/11 thể gan 0,1133 0,200 không 2 T850I/IVS14-2A>G 6 Chỉ điểm WBW160604 nữ/13 thể gan không 0 S105X/S105X 4 Sàng lọc WBW160604B6 nam/9 thể gan 0,0300 0,235 không 4 S105X/S105X 8 Chỉ điểm WBW160608 nam/10t thể gan 0,0220 0,216 không 4 IVS14-2A>G/ IVS14-2A>G 8 Sàng lọc WBW170604S3 nữ/7t thể gan 0,0214 0,283 không 4 IVS14-2A>G/ IVS14-2A>G 8 Chỉ điểm WBW160610S2 nữ/ suy gan tối cấp 0,0011 5,235 có 7 P992L/P992L 11 Sàng lọc WBW160610 nam/13 thể gan 0,0400 0,240 không 4 P992L/P992L 8 Chỉ điểm WBW160802S2 nữ/11 thể gan 0 S105X/S105X 4 Sàng lọc WBW160802 nam/8 thể gan 0,0428 2,930 không 4 S105X/S105X 8 77 Bảng 3.13. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình (tiếp) Ca bệnh Mã bệnh nhân Tuổi/giới* Kiểu hình Cp (g/l) Đồng niệu/24h (mg) Vòng KF Điểm** Kiểu gen Điểm** Chỉ điểm WBW120601 Nữ/18 thể gan 0,0087 2 S105X/I1148T 6 Sàng lọc WBW161001B nam/7 - 0,0100 0,072 không 2 S105X/I1148T 6 Chỉ điểm WBW160904 nam/4 - 0,0179 0,293 không 4 L902P/P1273Q 8 Sàng lọc WBW170304B nam/3th - 0,0104 - không 2 L902P/P1273Q 6 Chỉ điểm WBW161202 nữ/13 Thể gan 0,0247 2,230 không 4 K1010T/L1371P 8 Sàng lọc PWBW17050B nam/25 Thần kinh 0,0014 có 4 K1010T/L1371P 8 Chỉ điểm WBW170303 nữ/11 thể gan 0,030 1,950 có 6 R778L/R778L 10 Sàng lọc WBW170305 nữ/6 thể gan 0,012 0,46 không 4 R778L/R778L 8 Chỉ điểm WBW170806 nữ/14 thể gan 0,085 0,406 có 6 T850I/D1027H 10 Sàng lọc WBW170805 nam/12 - 0,107 0,121 không 2 T850I/D1027H 6 Chú thích: Cp (Ceruloplasmin, bình thường 0,20-0,60 g/L)); chữ đậm chữ nghiêng (chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán khi không có phân tích gen); đổ màu (đã tử vong); B (Brother-anh/em trai); S (Sister-chị/em gái); *tính tại thời điểm được chẩn đoán;**: Điểm Leipzig; Đồng niệu/24h (bình thường <0,1 mg/24h); vòng KF (Kayser-Fleischer ring). Điểm Leipzig 1: điểm tại thời điểm chẩn đoán bệnh; Điểm Leipzig 2: điểm đạt được sau khi phân tích gen ATP7B. Điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo thang điểm chẩn đoán của Leipzig (Ferenci và cs, 2012) như sau: ≥4 điểm: chẩn đoán xác định bệnh 2 điểm: chưa thể chẩn đoán bệnh 3 điểm: có thể chẩn đoán nhưng cần làm thêm xét nghiệm khác Trong 55 phả hệ củ quan hệ huyết thống và đ 3.14). Bố và mẹ của 2 bệ Hình 3.14. Phả hệ củ Nam mang gen b Nam bị Nam đã m Bệnh nhân Phân tích phả hệ WBW160101 (III.3) và m ruột. Phả hệ trên có 2 anh em h lần lượt là WBW160101 và WBW160602 WBW160101 mang gen b không có đột biến. Bố, m Kết quả giải trình t trên Hình 3.15 đều có chung m bệnh nhân khác nhau: n người anh họ (III.2) có ki mẹ bệnh nhân mã số WBW160602 l V176SfsX28, chị gái bệ 78 a bệnh nhân Wilson, nghiên cứu đã phát hi ều có con bị bệnh Wilson đã có biểu hiện lâm nh nhân này là chị em ruột. a gia đình bệnh nhân WBW160101 và WBW160602 ệnh Nữ mang gen b bệnh Nữ bị bệnh ất ? Chưa phân tích gen trên Hình 3.14 cho thấy, bố của bệnh nhân m ẹ của bệnh nhân mã số WBW160602 (III ọ (III.2, III.3) cùng bị bệnh Wilson, mã s . Người em trai của bệnh nhân mã s ệnh và người chị gái của bệnh nhân mã số ẹ của cả 2 bệnh nhân đều là người mang gen b ự gen ATP7B cho thấy, 2 bệnh nhân Wilson trong ph ột đột biến dị hợp tử V176SfsX28 mặ gười em (III.3) có kiểu gen V176SfsX28/IVS6+3A>G và ểu gen V176SfsX28/R778L (Hình 3.15-Hình 3. ần lượt bị đột biến dị hợp t nh nhân này không bị đột biến gen ATP7B ện 2 phả hệ có sàng (Hình ệnh ã số .2) là chị em ố bệnh nhân ố WBW160602 ệnh. ả hệ c dù kiểu gen 2 16). Bố, ử R778L và ; bố, mẹ bệnh nhân mã số WBW160101 b trai bệnh nhân bị đột biến d Hình 3.15. Trình t Chú thích: BN (bệnh nhân) Bệnh nhân mã số WBW160 1946+3 bị thay thế bằng 79 ị đột biến dị hợp tử V176SfsX28 và IVS6+3A>G. ị hợp tử IVS6+3A>G. ự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160101 101có 2 đột biến dị hợp tử: (1) nucleotid nucleotid G (IVS6+3A>G); (2) thêm 1 nucleotid Em A tại vị trí A vào giữa 2 nucleotid ở vị trí 525 mã hóa mã hóa Valin (V) thời tạo ra bộ ba kết thúc s (V176SfsX28); bố của bệ và em trai bệnh nhân (III Hình 3.16. Trình t Chú thích: BN (bệnh nhân) Bệnh nhân (III.2) 80 và 526 trên cDNA của gen ATP7B làm cho b thứ 176 chuyển thành bộ ba AGT mã hóa Serin ớm (X) cách vị trí bị đột biến 28 nh nhân (II.7) bị đột biến dị hợp tử V176SfsX28; m .4) bị đột biến dị hợp tử IVS6+3A>G. ự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160602 (mã số WBW160602) bị đột biến d ộ ba GTC (S), đồng acid amin ẹ (II.8) ị hợp tử kép V176SfsX28/R778L. Độ thành T, khiến bộ ba CG mã hóa Leucin (L). Kết qu đột biến dị hợp tử R778L, Chị gái bệnh nhân (III.1) không Ngoài ra, nghiên cứ có biểu hiện lâm sàng (B hợp mắc Wilson chưa có tri Ca nhỏ tuổi nhất được ch nhân Wilson đã có biểu hi có mã số WBW160904 (Hình 3. Hình 3.17. P Nam mang gen b Nam bị bệnh Nam đã mất ? Chưa được phân tích gen/chưa biểu hi Bệnh nhân Wilson bệnh Wilson, thể bệnh gan. E đột biến dị hợp tử trên 2 b tuổi (Hình 3.18). Như vậ 81 t biến R778L làm cho nucleotid G tại vị trí c.2333 G mã hóa Arginin (R) thứ 778 chuyển thành b ả sàng lọc đột biến đích như sau: bố bệnh nhân mẹ bệnh nhân (II.6) bị đột biến dị hợp tử bị đột biến. u đã xác định 5/13 trường hợp bị bệnh Wilson nhưng ảng 3.14). Phả hệ và trình tự đột biến gen c ệu chứng lâm sàng còn lại được trình bày ẩn đoán xác định bệnh Wilson là em trai c ện lâm sàng và đã xác định được kiểu gen, b 17). hả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW160904 ệnh Nữ mang gen bệnh Nữ bị bệnh Bệnh nhân đã có biểu hiệ ện bệnh Ca sàng lọc chưa có bi sàng mã số WBW160904 (III.1) đã có biểu hiện lâm sàng m trai bệnh nhân (mã số WBW170304 ản sao của gen ATP7B được phát hiện sớ y, đây là ca mắc bệnh Wilson nhưng chưa có tri chuyển ộ ba CTG (II.3) bị V176SfsX28. chưa ủa 3/5 trường ở Phụ lục 6. ủa một bệnh ệnh nhân này n lâm sàng ểu hiện lâm của B-III.2) có 2 m lúc 3 tháng ệu chứng lâm sàng. Bố, mẹ của bệnh nhân (II Hình 3.18. Trình t Chú thích: BN (bệnh nhân) Bệnh nhân Wilson dị hợp tử, L902P và P1273Q. bệnh nhân (II.5) bị đột bi 82 .1, II.5) là người mang gen bệnh. ự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW160904 mã số WBW160904 (III.1) và em trai (III.2 Bố bệnh nhân (II.1) bị đột biến dị hợp t ến dị hợp tử P1273Q. ) có 2 đột biến ử L902P, mẹ 83 Bảng 3.14. Đặc điểm cận lâm sàng, kiểu gen và điểm chẩn đoán của 5 trường hợp mắc Wilson chưa có biểu hiện lâm sàng Xét nghiệm Chỉ số bình thường Bệnh nhân WBW151002B WBW161001B WBW170304B WBW170805 WBW160402 Tuổi/Giới 3t/nam 7t/nam 3th/nam 12t/nam 12t/nam Bilirubin-trực tiếp(µmol/L) 0.5-6.8 0,75 0,21 3,4 1,47 1,4 Bilirubin-toàn phần (µmol/L) 3.4-17 2,87 4,01 4 7,54 6,5 AST (u/L) <40 37,19 43,29 37,80 91,85 51 ALT (u/L) <40 32,46 60,01 25,70 131,71 33 GGT (u/L) <40 20,46 40,44 15,10 43,66 55 PT% >70% 121,00 94,50 90 87,4 69 Albumin (g/L) 35-50 29,00 38,94 45 40,87 34,6 Protein tổng số (g/L) 60-80 57,80 65,42 71,73 69,6 Xét nghiệm Coombs - - - - - Tiểu cầu 320 564 111 304 Ceruloplasmin (g/L) 0,2-0,6 0,0209 0,01 0,0104 0,107 0,1133 Cu niệu/24h (mg) <0,1 <0,05 0,072 Không có 0,121 0,200 Cu huyết thanh (u/L) 12-28 2,7 2,26 Thấp 11,28 Điểm Leipzig 1 2 2 2 2 2 Kiểu gen S105X/S105X S105X/I1148T L902P/P1273Q T850I/D1027H T850I/IVS14-2A>G Điểm Leipzig 2 6 6 6 6 6 Chú thích: AST (Aspartate Amino Transferase); ALT (Alanin Amino Transferase); GGT (Gamma Glutamyl Transferase); PT (Prothrombin); Cu (đồng); điểm Leipzig 1: điểm tại thời điểm chẩn đoán bệnh; điểm Leipzig 2: điểm sau khi phân tích gen ATP7B. Hình 3 Nam mang gen b Nam bị bệnh Nam đã mất ? Chưa được phân tích gen/ Bệnh nhân đã có bi Ca sàng lọc ch