Luận án Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên Peptide tín hiệu đến khả năng tiết α – Amylase tái tổ hợp trong Bacillus Subtilis - Nguyễn Thị Đà

i từ vector pHV33 gốc Các vector tái tổ hợp pHVgracAmy mới từ vector pHV33 gốc đƣợc thực hiện theo sơ đồ Sơ đồ thí nghiệm tạo vector trên Hình 3.17. Các cụm tổ hợp tạo thành bao gồm: Pgrac- DASsub3BT2Mature, Pgrac- DAScere3BT2Mature, Pgrac- DASliche3BT2Mature, Pgrac-3BT2amy đƣợc nhân dòng bằng PCR với cặp mồi xuôi là trình tự khởi đầu của Pgrac (FprimerPgrac- EcoRI) và mồi ngƣợc là P3BL – EcoRI (Hình 3.16) đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI và sau đó đƣợc tinh sạch rồi gắn 75 vào vector pHV33 đã đƣợc cắt mở vòng bằng enzyme tƣơng ứng. Từ các đoạn tái tổ hợp này, các plamid tƣơng ứng tạo thành đƣợc ký hiệu dựa trên tên của vector và tên của cụm tái tổ hợp gắn với SP của các loài nhƣ: pHVSuSig5.2, pHVCeSig15, pHVLiSig23, pHVLi3BT2full. Sản phẩm tách plasmid đƣợc thể hiện trên hình 3.18 A và cắt kiểm tra đoạn gen đã chèn bằng enzyme giới hạn EcoRI (Hình 3.18B) Hình 3.18. Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 (A) và xử lý EcoRI (B) Chú thích: A: giếng 1, 2, 3, 5, 6 kết quả tách plasmid pHVSusig5.2 từ các dòng đƣợc biến nạp; 4, Marker. B: 1, Sản phẩm cắt EcoRI của plasmid đã tách; 3,4 plasmid đối chứng; 2, Marker 3.3.3. Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ Bacillus subtilis 168M Tất cả các tế bào sống đều tổng hợp ra protein mới nhằm đảm bảo cho hoạt động của tế bào. Với các protein ngoại bào, các protein đƣợc vận chuyển ra ngoài màng tế bào thông qua con đƣờng tiết. Trong vi khuẩn, rào cản chính cho quá trình tiết protein chính là lớp màng tế bào chất. Trong mấy thập kỷ qua, đã có nhiều nghiên cứu về protein và các con đƣờng tiết của chúng và thông qua các nghiên cứu này, bức màn bí mật về quá trình làm sao protein vận chuyển ra đƣợc ngoài màng và tiết vào môi trƣờng cũng nhƣ các nhân tố tham gia trong quá trình vận chuyển đã dần đƣợc sáng tỏ. Những nghiên cứu về quá trình tiết protein của vi khuẩn tập chung chủ yếu trên hai đối tƣợng đó là E. coli, đại diện của G-, và B. subtilis, đại diện cho các chủng vi khuẩn G+. Không giống nhƣ E. coli, protein của vi khuẩn G+ đƣợc vận chuyển ra ngoài màng để giải phóng vào môi trƣờng hoặc và tiết qua lớp màng tế bào chất ra thẳng môi trƣờng nuôi cấy. Do đó, các chủng G+ là đối tƣợng pHV33 vector 6.9 kb Pgrac-DASsub3BT2 Mature 1.8 kb 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 76 nghiên cứu hấp dẫn để sử dụng làm chủng chủ cho quá trình tiết lƣợng lớn các enzyme công nghiệp. Để đánh giá khả năng tiết của các peptide tín hiệu của một gen có nguồn gốc từ Bacillus thì phải chọn chính một chủng cũng có nguồn gốc từ chi này làm chủng tái tổ hợp. Thông qua quá trình tiết α - amylase tái tổ hợp trong chủng chủ Bacilus có thể sàng lọc đƣợc các peptide mạnh và đánh giá mức độ biểu hiện cũng nhƣ xác định hàm lƣợng protein tiết đƣợc ra môi trƣờng sẽ có tính chính xác cao hơn. Trong đó, B. subtilis là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm vi khuẩn gram dƣơng nói chung và trong chi Bacillus nói riêng bởi vì trình tự gen của loài này đã đƣợc xác định toàn bộ, không tiết độc tố, có hiệu quả thu hồi cao, khả năng tiết các protein tái tổ hợp trong loài này đƣợc biết đến khoảng 25g/l đây chính là một bộ máy tiết enzyme hoàn hảo nhằm ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm, công nghệ sinh học, và trong lĩnh vực nông nghiệp (Schallmey et al., 2004; Westers et al., 2004; Nijland & Kuipers, 2008). Một số chủng thuộc loài B. subtilis đƣợc thiết kế và phát triển thành các chủng sản xuất thƣơng mại: 168M, WB800, WB700, WB600, BG2054, DB104, DB105... và chủng chủ đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu này là B. subtilis 168M. Hệ thống biểu hiện có sử dụng vector con thoi pHV33 có thể biểu hiện đƣợc ở cả E. coli và B. subtilis. Hệ thống vector biểu hiện tạo thành bao gồm: - Vector pHV33 gốc - Promoter tách từ pHT43 - SP gen α - amylase đã tách từ các chủng tuyển chọn - Đoạn gen trƣởng thành của gen α - amylase từ chủng 3BT2 3.3.3.1. Ảnh hưởng của promoter Pgrac lên khả năng tiết và biểu hiện amylase trong Bacillus subtilis 168M Trong 5 nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện của một gen trong chủng tái tổ hợp, nhân tố promoter là yếu tố đƣợc xét đến trƣớc tiên. Tổ hợp PHV33 mang gen mã hóa cho α-amylase của chủng B. licheniformis 3BT2 và promoter Pamy của chủng chủ đã đƣợc bảo quản trong bộ sƣu tập gen và chủng giống của phòng Công nghệ vật liệu sinh học (Trần Đình Mấn, 2001). Promoter Pgrac là một promoter 77 mạnh đƣợc cảm ứng bằng IPTG và sử dụng trong vector thƣơng mại của hãng MoBiTec. Do đó chúng tôi đã lựa chọn làm promoter chính cho nghiên này và so sánh với sự biểu hiện của cụm gen tái tổ hợp mang promoter Pamy trong vector pHV33. Để xác định ảnh hƣởng của 2 promoter: promoter của chính gen α-amylase của chủng chủ B. subtilis 168M và promoter Pgrac lên khả năng tiết amylase, trƣớc tiên cần tạo đƣợc tổ hợp gen mới bao gồm Pgrac – tách từ pHT43, pHV33 và gen α- amylase 3BT2 sau đó tái tổ hợp và biến nạp trong B. subtilis 168M Chủng tái tổ hợp mang cụm vector pHV33-Pgrac-Amy3BT2 sau khi biến nạp đƣợc sàng lọc hoạt tính amylase trên môi trƣờng LB có bổ sung Chloramphenicol 20µg/ml và chất cảm ứng IPTG. Cả hai chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M mang hệ vector pHV33–PgracAmy3BT2 (ký hiệu 168MPgrac) và B. subtilis 168M mang hệ vector pHV33–PamyAmy3BT2 (ký hiệu 168MPamy) tiếp tục đƣợc nghiên cứu đánh giá khả năng tiết protein và hoạt tính amylase. 168MPgrac đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB + Chloramphenicol đến khi OD đạt 0.6-0.8, bổ sung IPTG 0.01mM và bắt đầu tính thời gian nuôi cấy tại thời điểm bổ sung IPTG đƣợc coi là 0h và nuôi tiếp tục đến thời điểm 48h. Chủng 168MPamy đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB +chloramphenicol + glucose trong khoảng 60h sau đó xác định hoạt tính enzyme và khả năng tiết protein tổng. Hoạt tính của các chủng tái tổ hợp đƣợc đánh giá với đối chứng chính là chủng B. subtilis 168M mang vector pHV33 gốc không chứa cụm gen quan tâm. Bảng 3. 5. Hoạt tính tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp Hoạt tính Ký hiệu chủng Amylase Hàm lƣợng Protein tiết tổng số (µg/ml) Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg) Khuếch tán thạch (mm) Hoạt tính α - amylase (U/ml) 168MPamy 14 53,2±5,5 1763,5±15 30,17 168MPgrac 21 71,4±6,3 1876,4±25 38,05 168M 1 2,1±0,3 1798,7±30 1,17 78 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp enzym của chủng Bacillus subtilis168M mang vector pHV33-promoter Pgrac - α-amylase 3BT2 Hình 3.20. Ảnh hƣởng của promoter lên khả năng tiết enzyme của chủng tái tổ hợp. Chú thích: A, Điện di đồ SDS – PAGE sản phẩm protein thu đƣợc của chủng các chủng tái tổ hợp 168MPamy, 168MPgrac và chủng đối chứng 168M. Băng điện di đậm và đƣợc chỉ bằng mũi tến là amylase với kích thƣớc khoảng 58 kDa. B, Hoạt tính amylase trên bản điện di protein có bổ sung tinh bột tan 1% của các chủng tái tổ hợp nghiên cứu. Hoạt tính enzyme trên bản điện di thể hiện qua vùng không bắt màu iot. Hoạt tính enzyme đều đƣợc tiết ra môi trƣờng nuôi cấy ở cả 2 chủng nghiên cứu cho thấy, α - amylase của B. licheniformis 3BT2 đã đƣợc tiết trong tế bào chủng B. subtilis 168M. Với 168MPamy, hoạt tính α – amylase đạt đƣợc 53,2±5,5 79 U/ml sau 60h nuôi cấy. Chủng 168MPgrac, hoạt tính α – amylase đạt đƣợc 71,4 ±6,3 U/ml sau 48h nuôi cấy tỷ lệ hoạt tính amylase trên hàm lƣợng protein tiết tổng số của enzyme đạt 38,05 U/ml. Các peptide tín hiệu gốc gen α-amylase của 3BT2 đã có hiệu quả hoạt động tốt khi đƣợc điều khiển bởi cả 2 loại promoter trong B. subtilis. Trong khi kết quả trên Bảng 3.5 cho thấy, promoter Pgrac của pHT43 cho hiệu quả biểu hiện amylase cao hơn khi đƣợc tổ hợp với pHV33. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh α - amylase của chủng tái tổ hợp B. subtilis 168MpHV33–PgracAmy3BT2 (168MPgrac) trên môi trƣờng LB có bổ sung IPTG 0,01mM và chloramphenicol 20 µg/ml đƣợc trình bày trong Hình 3.19 cho thấy, chủng này sinh trƣởng và sinh enzyme tốt nhất trong khoảng 30 - 48h nuôi cấy tính từ sau khi bổ sung IPTG, đạt OD cực đại 3,69±0,11 và hoạt tính amylase đạt 73,4±3,61 sau 48h nuôi cấy. Điện di SDS-PAGE đƣợc thực hiện với gel 12% và đƣợc nhuộm bằng AgNO3. Quan sát băng điện di protein và zymogram cho thấy kích thƣớc băng amylase có hoạt tính khoảng 58 kDa (Hình 3.20) phù hợp với kích thƣớc chung của enzyme α-amylase từ các chủng thuộc loài B. licheniformis đã đƣợc công bố (Pandey et al., 2000). Thông qua kết quả này, promoter Pgrac đƣợc sử dụng làm promoter cho plasmid khung pHV33 trong nghiên cứu biểu hiện hoạt tính amylase của các peptide khác nhau trên đoạn gen đích α-amylase 3BT2 trƣởng thành. 3.3.3.2. Ảnh hưởng của các peptide tín hiệu khác nhau lên khả năng biểu hiện và tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2 Một hệ thống biểu hiện tốt là protein quan tâm phải đƣợc tiết ra một lƣợng lớn để thu hồi và mặc dù có một số protein đã đƣợc thu thành công trong B. subtilis nhƣng hiệu suất không cao, đôi khi lƣợng enzyme thu đƣợc vẫn không đủ đáp ứng yêu cầu vì vậy cần tìm hiểu thêm sâu hơn về cơ chế của quá trình vận chuyển protein ra ngoài màng nhằm cải thiện hiệu quả. Đi sâu nghiên cứu nâng cao lƣợng sản phẩm thu hồi chính là nghiên cứu về các con đƣờng tiết tham gia trong quá trình vận chuyển protein và các nhân tố của bộ máy vận chuyển để có thể tìm quá trình 80 tác động nhằm nâng cao lƣợng enzyme tiết thu hồi. Ở vi khuẩn, hầu hết các protein đƣợc tiết theo Sec/P đƣợc tổng hợp nhƣ các tiền chất có chứa SP và đoạn protein trƣởng thành. Mặc dù không có sự bảo thủ về mặt trình tự nhƣng SP luôn cấu tạo gồm: vùng N tích điện dƣơng, vùng H chứa các axit amin kỵ nƣớc và vùng cuối C trung tính hoặc tích điện âm có chứa vị trí phân cắt cho các Spase. Tuy nhiên, SP của vi khuẩn G+ đƣợc biết đến dài hơn so với các SP của gram âm (Nielsen et al., 1997b) cho nên một SP của gram âm có thể sẽ không có chức năng đƣợc thể hiện trong tiết protein nhƣ ở gram dƣơng (Collier, 1994). Tác động của việc thay thế SP gen α-amylase của chủng B. licheniformis 3BT2 bằng các SP của gen α-amylase của các loài khác trong cùng chi Bacillus nhƣ: B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis trong việc tiết α-amylase đƣợc đánh giá bằng protein tổng, hoạt tính tổng và kết quả điện di protein. Các SP khác nhau đƣợc đánh giá ảnh hƣởng lên khả năng biểu hiện hoạt tính amylase và tiết protein của gen đích 4 tổ hợp gen đã đƣợc tạo thành bao gồm: pHV33-Pgrac-3BT2Amyfull (pHVAmy3BT2), pHV33 – Pgrac – ScereusCN15 - 3BT2mature (pHVCeSig15), pHV33 – Pgrac – SsubtilisD5.2-3BT2mature (pHVSuSig5.2), pHV33 – Pgrac – SlicheniformisDA23 - 3BT2mature (pHVLiSig23) trong B. subtilis 168M (Bảng 3.6). Bảng 3.6. Các plasmid thiết kế Chủng tái tổ hợp Plasmids thiết kế Đặc điểm gen 168MSubsig52 pHVSubsig5.2 pHV33+Pgrac+SP gen α – amylase của chủng B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen 168MCeSig15 pHVCesig15 pHV33+Pgrac+ SP gen α – amylase của chủng B. cereus CN1-5+3BT2 Mature α – amylase gen 168MLisig23 pHVLisig23 pHV33+Pgrac+ SP gen α – amylase của chủng B. licheniformis DA23+3BT2 Mature α – amylase gen 168M3BT2 pHVLi3BT2full pHV33+Pgrac + α-amylase 3BT2 gen Các chủng tái tổ hợp thu đƣợc đƣợc ký hiệu theo tổ hợp gen mà chúng đƣợc tạo thành: 168MSubsig52, 168MCeSig15, 168MLisig23, 168M3BT2. Chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi cấy trong 48h trên môi trƣờng LB + chloramphenicol có bổ sung IPTG để cảm ứng sau khi OD đạt 0,7 – 0,8. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.7. 81 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của các SP khác nhau lên khả năng biểu hiện và tiết protein của α-amylase B. licheniformis 3BT2 Chủng Hoạt tính α – amylase (U/ml) Hàm lƣợng protein tiết tổng số (µg/ml) Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg) Khuếch tán thạch (mm) Dịch phá tế bào Dịch nuôi cấy 168MSubsig52 23±1,5 3,1±0,3 76,4±3,7 1896,4±35,0 40,9±3,13 168MCeSig15 16,5±2 4,9±0,7 47,7±4,6 1767,2±21,6 26,9±2,23 168MLisig23 21±1,5 6,3±0,6 71,3,±3,2 1824,7±27,1 38,7±0,72 168M3BT2 20,5±2 4,1±0,4 68,6±5,1 1787,3±20,2 37,5±1,42 Kết quả trên bảng này cho thấy, khi nuôi cấy cả 4 chủng tái tổ hợp trên môi trƣờng LB có bổ sung IPTG 0,01M đều có khả năng sinh α-amylase điều này chứng tỏ cả promoter Pgrac lẫn 3 SP hoạt động tốt khi tái tổ hợp với gen đích là đoạn gen mã hóa cho α-amylase trƣởng thành của chủng 3BT2. Trong đó, chủng tái tổ hợp B. subtilis 168M mang cụm gen pHV33 – Pgrac – SsubtilisD5.2-3BT2mature cho hoạt tính α-amylase mạnh nhất đạt 76,4 ± 3,7 U/ml và tổ hợp gen với trình tự SP của B. subtilis CN1-5 (B. subtilis 168M - pHV33 – Pgrac – ScereusCN15 - 3BT2mature) cho hoạt tính amylase là thấp nhất, chỉ đạt 47,7 ± 4,6 U/ml. Để khảo sát khả năng tiết α-amylase ra môi trƣờng nuôi cấy, dịch sau nuôi cấy của 4 chủng tái tổ hợp sẽ đƣợc ly tâm loại bỏ tế bào và đƣợc kết tủa với ethanol và hòa lại trong đệm thích hợp. Mẫu kết tủa sẽ đƣợc xử lý để điện di SDS-PAGE. Cả 4 plasmid khảo sát đều xuất hiện vạch protein có kích thƣớc tƣơng ứng với lý thuyết khoảng 58kDa (Hình 3.21). Kết quả trên hình 3.21 cho thấy, sau 36h nuôi cấy, các chủng tái tổ hợp cho thấy có sự khác biệt về hàm lƣợng enzyme quan tâm trên băng điện di thông qua mức độ đậm nhạt của băng. Kết quả điện di protein cho thấy tƣơng ứng với các kết quả phân tích ở trên. Dựa vào kết quả trên Bảng 3.7 và Hình 3.21, chủng tái tổ hợp 168MSubsig52 (B. subtilis 168M- pHV33–Pgrac –SsubtilisD5.2-3BT2mature) đƣợc 82 chọn lọc và trình tự SP của B. subtilis D5-2 đƣợc sử dụng cho nghiên cứu gây đột biến trình tự SP nhằm đánh giá ảnh hƣởng của các đột biến này lên khả năng biểu hiện hoạt tính enzyme. Hình 3.21. So sánh biểu hiện tiết α-amylase các peptide tín hiệu khác nhau Chú thích: 1. Thang protein chuẩn, 2: 168MCesig15; 3: 168MSusig52; 4, 168M3BT2; 5: 168Mlisig23 Hình 3.22. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trƣởng và sinh tổng hợp amylase của chủng B. subtilis 168MSusig52 Chủng tái tổ hợp 168MSubsig52 (B. subtilis 168M- pHV33 – Pgrac – SsubtilisD5.2-3BT2mature) đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LB có bổ sung 83 Chloramphenicol và IPTG 0,01 mM và xác định ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trƣởng và sinh hoạt tính amylase. Mật độ quang của mẫu đƣợc xác định tại bƣớc sóng λ = 600 nm. Hoạt tính đƣợc xác định bằng phƣơng pháp DNSA. Kết quả nghiên cứu trên hình 3.22 cho thấy, khoảng thời gian sinh trƣởng và sinh tổng hợp amylase của chủng tái tổ hợp tốt nhất sau 18 ÷ 36h nuôi cấy đạt. Hoạt tính enzyme đo đƣợc cao nhất sau 36h với giá trị đạt 73,7±6,36 U/ml ở thời điểm này. 3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT BIẾN ĐƢỢC THIẾT KẾ Bên cạnh các nghiên cứu thay thế các SP mã hóa cho các protein khác nhau trong cùng loài hay khác loài để tăng cƣờng khả năng tiết enzyme, các nhà khoa học trên thế giới còn sử dụng phƣơng pháp tạo đột biến trên chính các peptide này nhằm đánh giá đƣợc khả năng tiết. Từ cái nhìn tổng quan tài liệu hiện nay về tác động của đột biến các SP của gen từ Bacillus thì phƣơng pháp thay đổi các SP có thể là một công cụ có giá trị để tăng cƣờng sản xuất các protein trong chi này hoặc các tế bào chủ khác nhƣng đối với mỗi sự kết hợp của SP và một đoạn gen đích trƣởng thành đều có sự biến đổi và cần đƣợc minh chứng bằng thực nghiệm. Trong nghiên cứu này, SP đƣợc gắn với gen đích 3BT2 tuy tiết tốt nhất trong các peptide đƣợc so sánh nhƣng khả năng tiết vẫn còn là hạn chế. Chính vì vậy, việc đột biến SP gen α - amylase của B. subtilis D5-2 thu đƣợc này nhằm tìm khả năng để có thể tăng cƣờng tính tiết enzyme. Đánh giá khả năng tiết của các SP thông qua một gen đích chung là 3BT2 α - amylase mature qua B. subtilis 168M cho thấy, đoạn SP của chủng B. subtilis D5-2 với 33 axit amin là cho hàm lƣợng protein tiết cao nhất đƣợc chọn cho nghiên cứu tiếp theo. SP mã hóa cho gen α - amylase của chủng này đƣợc biết đến gồm có 33 axit amin đƣợc chia thành 3 vùng N-(axit amin thứ 1-9), H (axit amin thứ 10-25) và vùng C (axit amin thứ 26-33) (hình 3.23). 84 Hình 3.23. Sơ đồ cấu trúc và trình tự axit amin trên SP gen α-amylase chủng D5-2 Có nhiều phƣơng pháp đột biến peptide tín hiện khác nhau đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tăng tiết enzyme nhƣ: error-prone PCR, đột biến điểm định hƣớngTrong khuôn khổ luận án này, SP α – amylase đƣợc gây đột biến định hƣớng một số điểm chọn lọc dựa trên cấu trúc SP của α – amylase chủng B. subtilis D5-2. Dựa trên chính trình tự ban đầu của SP gen α - amylase của chủng D5-2, các đột biến tại các vị trí mong muốn trên SP này đã đƣợc thiết kế. Bằng các cặp mồi mang trình tự đột biến mong muốn (Bảng 2.5), các đoạn SP đã đƣợc khuếch đại bằng PCR sau đó gắn vào vector pHVSusig5.2 đã đƣợc loại bỏ đoạn SP tƣơng ứng. Các điểm đột biến thiết kế (Hình 3.24) và đặc tính các peptide tính hiệu thiết kế trên Bảng 3.8. Các vị trí đột biến và tổ hợp gen cũng nhƣ plasmid tạo thành đƣợc trình bày trong bảng 3.9. Bảng 3.8. Đặc điểm của các SP đột biến Ký hiệu SP Điện tích vùng N * Độ kỵ nƣớc**(%) Điểm nhận biết SPase SPD 5-2 +4 72,7 A-N-A SP K3Q +3 72,7 A-N-A SPK3QK4I +2 75,8 A-N-A SPP12LF14LA15LF17LF21LH22LV24L +4 75,8 A-N-A SPA31V +4 72,7 V-N-A SPA31G +4 72,7 G-N-A SPA31C +4 69,7 C-N-A Chú thích: * Đƣợc tính toán điện tích với quy ƣớc D, E là -1; R, K là +1, các axit amin còn lại là 0. ** Phần trăm các axit amin kỵ nƣớc đƣợc xác định dựa trên đặc tính các axit amin G, A, V, L, I, M, F, W và P là kỵ nƣớc và các axit amin còn lại là ƣa nƣớc 85 Hình 3.24. So sánh trình tự axit amin của các peptide đột biến. Chú thích: Những axit amin đƣợc đánh dấu vàng là các vị trí đột biến đƣợc thiết kế Bảng 3.9. Thành phần của plasmid mang tổ hợp gen đột biến Chủng tái tổ hợp Plasmid Đặc điểm gen Vị trí axit amin thay đổi của SP 168MpHVD52 pHVN1 pHV33+Pgrac+ SP gen α – amylase của chủng B. subtilis D5.2 +3BT2 Mature α – amylase gen Vùng N: K3Q 168MpHVN1 pHVN2 pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2K3QK4I+3BT2 Mature α – amylase gen Vùng N: K3QK4I 168MpHV HCore pHVHcore pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen Vùng H: P12LF14LA15LF17LF21LH22LV24L 168MpHVC1 pHVC1 pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen Vùng C: A31G 168MpHVC2 pHVC2 pHV33+Pgrac+Signal B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen Vùng C: A31V 168MpHVC3 pHVC3 pHV33+Pgrac+SP B. subtilis D5.2+3BT2 Mature α – amylase gen Vùng C: A31C Đột biến lựa chọn đƣợc tiến hành trên cả 3 vùng N, H, C của SP gen α - amylase của chủng dại B. subtilis D5-2. Đột biến trên vùng N, vùng C của SP gen quan tâm đƣợc tiến hành thông qua phƣơng pháp đột biến điểm có định hƣớng nhằm thay thế các axit amin ở cả hai vùng này. Trong đó, đột biến axit amin ở vùng N của SP đƣợc tiến hành bằng việc thay thế hai axit amin K ở vị tri 3 bằng axit amin Q, axit amin K ở vị trí 4 bằng I nhằm đánh giá hiệu quả tiết thu đƣợc khi làm giảm điện tích đầu N của SP từ +4 xuống +3 và +2. Đột biến ở đầu N đƣợc tạo bằng 86 PCR với hai cặp mồi P22 – P10 và P23 – P10 mang đột biến điểm đã thiết kế cho đoạn sản phẩm PCR khoảng 100 bp (Hình 3.25 A) Riêng đối với đột biến thiết kế trên vùng H của SP gen α - amylase chủng B.subtilis D5-2, DNA khuôn dùng để khuếch đại chính là đoạn SPHcore đã đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng hóa học có chứa các điểm đột biến mong muốn đƣợc khuếch đại với cặp mồi P18 (DABsusigaFXhoI) và P10 (PribasuRsigSacII). Sản phẩm PCR đƣợc thể hiện trên Hình 3.25B cho thấy đã khuếch đại đƣợc đoạn sản phẩm có chứa điểm đột biến mong muốn với kích thƣớc khoảng 100 bp tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn SP gen α - amylase của chủng B. subtilis D5-2 đã xác định. Hình 3.25. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn peptide tín hiệu mang trình tự đột biến Chú thích: 1, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng N với vị trí K3Q; 2, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng N với vị trí K3QK4I; 4, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng tâm H; 5, Sản phẩm PCR đoạn SP mang đột biến vùng C với vị trí A31V; 6, 7 Sản phẩm PCR đoạn gen kép Pgrac- SP mang đột biến vùng C lần lƣợt với vị trí A31G, A31C; 3, 9 Để tiến hành tạo SP mang đột biến điểm định hƣớng ở điểm nhận biết phân cắt của các SPase I trên vùng C, các cặp mồi đƣợc thiết kế mang một số đột biến tại điểm cần quan tâm (Bảng 2.5) đƣợc sử dụng. Cặp mồi P18 (DABsusigaFXhoI ) - P25 (RSA31V-SacII ) đƣợc sử dụng để khuếch đại dựa trên DNA khuôn chính là SP đích nhằm thay thế axit amin A ở vị trí 31 bằng axit amin V với sản phẩm PCR thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 100 bp (Hình 3.25B). Trong khi đó, hai SP mang đột biến tại vị trí A31G và A31C đƣợc khuếch đại bằng PCR với hai cặp mồi P15 - P26 (RSA31G- A B 87 SacII ) và P15 – P27 (RSA31C-SacII ) thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 300 bp (Hình 3.25B). Sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR, tất cả các đoạn gen thu đƣợc đều đƣợc xử lý bằng enzyme cắt giới hạn phù hợp, đƣợc tinh sạch và tiến hành ghép nối với đoạn vector tạo các plasmid mang SP mong muốn. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch và cắt bằng 2 enzyme XhoI, SacII sau đó đƣợc ghép vào vector pHVSusigD5.2 và biến nạp vào E. coli. Sàng lọc tìm các dòng có chứa các vector mang điểm đột biến có hoạt tính amylase (hình 3.27) và tách plasmid sau đó biến nạp vào B. subtilis 168M. Kết quả PCR cụm gen tái tổ hợp có chứa các SP đột biến đƣợc thể hiện trên hình 3.26A, Sản phẩm DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng EcoRI của các plasmid có chứa điểm đột biến đƣợc thể hiện trên hình 3.26B, 3.26C. Mức độ tiết cũng nhƣ hoạt tính amylase của các chủng tái tổ hợp đƣợc thể hiện Bảng 3.10. Hàm lƣợng protein tiết tổng số của các chủng đột biến đƣợc thể hiện trên Hình 3.28. Bảng 3. 10. Khả năng tiết α - amylase và protein tổng số của các chủng tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp Điểm đột biến Hoạt tính amylas, U/ml Hàm lƣợng protein tiết tổng số (µg/ml) Tỷ lệ hoạt tính enzyme/ hàm lƣợng protein tiết tổng số (U/mg) Hiệu quả tiết (%) 168MpHVD52 Chủng gốc 70,6±3,3 1830,23±20,5 38,57 100 168MpHVN1 K3Q 76,7±4,1 1854,17±22,9 41,37 108,6 168MpHVN2 K3QK4I 57,4±4,5 1803,56±10,1 31,83 81,3 168MpHVHC ore P12LF14LA15LF17LF21 LH22LV24L 35,9±3,7 1797,77±21,2 19,97 50,8 168MpHVC1 A31V 80,1±3,1 1851,29±21,1 43,27 113,5 168MpHVC2 A31G 74,3±2,5 1837,13±24,3 40,44 105,2 168MpHVC3 A31C 56,4±2,3 1809,89±15,0 31,16 79,9 88 Hình 3. 25. Điện di đồ sản phẩm PCR các cụm tổ hợp và cắt kiểm tra plasmid Chú thích: Pgrac – SP đột biến – đoạn gen α - amylase trƣởng thành của B. licheniformis 3BT2 (A) và sản phẩm tách DNA plasmid mang các tổ hợp đột biến (B) và cắt kiểm tra tổ hợp Pgrac – SP đột biến vùng C (vị trí axit amin A31 thay bằng V)– đoạn gen α - amylase trƣởng thành của B. licheniformis 3BT2 (C) 89 Hình 3.26. Sàng lọc các dòng mang vector thiết kế thu các chủng có hoạt tính amylase Hình 3.27. Khả năng tiết amylase ngoại bào của các đoạn peptide tín hiệu đột biến. Chú thích: 1, 168MpHVD52. 2, 168MpHVN1; 168MpHVN2; 4, Thang protein chuẩn; 5, 168MpHVHcore; 6, 168MpHVC1; 7, 168MpHVC2; 8, 168MpHVC3; 9, 168MpHV33 α-amylase 90 Kết quả trên Bảng 3.10 cho thấy, có sự khác biệt trong hoạt động tiết enzyme amylase của các chủng tái tổ hợp. Từ peptide ban đầu, các peptide đột biến tại các điểm mong muốn đã đƣợc thiết kế và đƣa vào vector pHVSubsig5.2 đã loại bỏ gen α- amylase ghép giữa SP gen α - amylase của chủng D5.2 và đoạn gen mã hóa cho α- amylase trƣởng thành của 3BT2 tạo thành hệ vector biểu hiện pHV mới. Vector biểu hiện pHV bao gồm các thành phần: bộ khung gen của pHV33 và đƣợc bổ sung thêm Pgrac promoter với một SP chọn lọc và gen mã hóa cho enzyme đích. Tại điểm đột biến ở đầu N của peptide tín hiệu, các axit amin đƣợc thay thế nhằm làm giảm điện tích đầu N và từ đó xét sự ảnh hƣởng đến khả năng tiết α- amylase. Kết quả cho thấy, khi đột biến peptide tín hiệu tại K ở vị trí 3 nhằm thay thế bằng Q, điện tích đầu N chỉ còn là +3 nhƣng lại làm tăng hoạt tính lên đạt 108,6% so với hoạt tính enzyme tiết đo đƣợc của chủng gốc (76,7±4,1 U/ml) so với khả năng tiết của SP ban đầu (70,6±3,3 U/ml). Khi làm giảm điện tích đầu N thì hoạt động tiết giảm xuống, hoạt tính enzyme đo đƣợc ít hơn so với chủng gốc và chỉ còn khoảng 57,4±4,5 U/ml. Vùng H cũng có ảnh hƣởng đến khả năng tiết enzyme của chủng vì vậy khi chủng tái tổ hợp 168MpHVHcore mang đột biến thay toàn bộ các axit amin ở vùng H bằng L chỉ trừ vị trí G ở tâm kỵ nƣớc hoạt tính amylase tiết giảm xuống còn 50,8% so với khả năng tiết amylase của SP ban đầu. Tại vùng C, nơi có chứa vị trí nhận biết phân cắt của SPase, có 3 đột biến đƣợc thiết kế đó là lần lƣợt thay axit amin Ala ở vị trí 31 bằng G, V và C. Kết quả cho thấy, hoạt tính tiết