MỤC LỤC
ĐĂṬVẤN ĐỀ. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀILIÊỤ. 3
1.1. Rốiloaṇdự trữ trong tiêu thể . 3
1.1.1. Đaịcương . 3
1.1.2. Chẩn đoán LSDs. 4
1.1.3. Điều trị LSDs . 5
1.1.4. Các phương pháp sàng lọc bệnh LSDs . 6
1.2. Bệnh Fabry . 7
1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của Fabry . 8
1.2.2. Di truyền học phân tử của Fabry . 11
1.2.3. Liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình . 18
1.2.4. Chẩn đoán và sàng lọc Fabry . 21
1.3. Bệnh Pompe . 26
1.3.1. Biểu hiện lâm sàng của Pompe . 28
1.3.2. Di truyền học phân tử của Pompe . 28
1.3.3. Mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình . 31
1.3.4. Chẩn đoán và sàng lọc Pompe . 32
1.4. Các phương pháp sinh học phân tử trong xác định đột biến gen GLA,
GAA. . 34
1.4.1. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) . 35
1.4.2. Giải trình tự gen trực tiếp . 36
1.4.3. Giải trình tự gen thế hệ mới NGS . 37
1.4.4. Dự đoán khả năng gây bệnh của các đột biến mới bằng các phần
mềm tin sinh học . 37
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 40
2.1. Đối tượng nghiên cứu . 40
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 41
2.3. Phương pháp nghiên cứu . 42
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu . 42
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu . 42
2.3.3. Phương pháp thu thập mẫu . 42
2.3.4. Các biến số nghiên cứu . 44
2.3.5. Sơ đồ nghiên cứu . 45
2.3.6. Phương tiện nghiên cứu . 46
2.3.7. Quy trình kỹ thuật đo hoạt độ enzyme . 50
2.3.8. Quy trình giải trình tự trực tiếp tìm đột biến gen GLA và GAA . 52
2.4. Thu thập và xử lý số liệu . 58
2.4.1. Công cụ thu thập số liệu . 58
2.4.2. Quy trình thu thập số liệu . 58
2.4.3. Xử lý số liệu . 58
2.4.4. Khống chế sai số . 59
2.5. Đạo đức trong nghiên cứu . 59
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 60
3.1. Đặc điểm chung của các đối tượng tham gia nghiên cứu . 60
3.1.1. Bệnh Fabry . 60
3.1.2. Bệnh Pompe . 61
3.2. Kết quả đo hoạt độ enzyme . 62
3.2.1. Hoạt độ enzyme GLA của các người bệnh nghi ngờ Fabry . 62
3.2.2. Kết quả hoạt độ enzyme GAA của các người bệnh nghi ngờ Pompe . 63
3.3. Kết quả phân tích gen tìm đột biến . 64
3.3.1. Kết quả phân tích gen GLA . 64
3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các người bệnh nghi ngờ Pompe . 71
3.4. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh. 79
3.4.1. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình
người bệnh Fabry. . 79
3.4.2. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người
bệnh Pompe . 83
3.5. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe . 93
3.5.1. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry . 93
3.5.2. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Pompe . 93
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN . 96
4.1. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu . 96
4.1.1. Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Fabry . 96
4.1.2. Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Pompe . 98
4.2. Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA của các người bệnh tham gia
nghiên cứu. 98
4.2.1. Hoạt độ enzyme GLA . 98
4.2.2. Hoạt độ enzyme GAA của các người bệnh nghi ngờ Pompe . 100
4.3. Các đột biến gen GLA, GAA ở người bệnh Fabry và Pompe . 100
4.3.1. Các đột biến gen GLA . 100
4.3.2. Các đột biến gen GAA . 103
4.4. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh
tham gia nghiên cứu . 113
4.4.1. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người
bệnh Fabry . 113
4.4.2. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình
người bệnh Pompe . 114
4.5. Biểu hiện lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe . 123
4.5.1. Biểu hiện lâm sàng của người bệnh Fabry . 123
4.5.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Pompe . 124
KẾT LUẬN . 127
KHUYẾN NGHỊ. 128
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
176 trang |
Chia sẻ: vietdoc2 | Ngày: 28/11/2023 | Lượt xem: 348 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
on 6
Sai nghĩa
Đồng
hợp tử
Mới
FB69
IVS4-16 A>G
IVS6-22 C>T
Intron 4
Intron 6
Đồng
hợp tử
FB70 - - - - - -
FB74
IVS4-16 A>G
IVS6-22 C>T
Intron 4
Intron 6
FB79 - - - - - -
FB80 - - - - - -
FB84 - - - - - -
FB85 - - - - - -
FB133
IVS4-16 A>G
IVS6-22 C>T
Intron 4
Intron 6
FB331
IVS4-16 A>G
IVS6-22 C>T
Intron 4
Intron 6
FB334 - - - - - -
FB345
IVS4-16 A>G
IVS6-22 C>T
Intron 4
Intron 6
FB378
IVS4-16 A>G
IVS6-22 C>T
Intron 4
Intron 6
FB414 - - - - - -
VN.06 c.178C>T p.Pro60Ser Exon 1 Sai nghĩa - Mới
(-): không phát hiện bất thường
Nhận xét: Trong số 27 mẫu được giải trình tự, trong đó 11/27 mẫu (3 nữ,
8 nam) không phát hiện sự thay đổi trình tự, 16/27 mẫu có ít nhất 1 sự thay
đổi trình tự. Chúng tôi thấy tần số xuất hiện biến thể IVS và 5’UTR khá cao,
68
trong đó có 13/27 BN (48,1%) mang biến thể IVS6-22 C>T, 12/27 BN
(44,4%) mang biến thể IVS4-16A>G, 10/27 BN (37%) mang biến thể 5’UTR-
10 C>T và 5/27 BN (18,5%) mang cả 3 biến thể trên, trong đó có 2 trường
hợp là nữ, đều mang các biến thể này ở thể đồng hợp tử. Ngoài ra còn phát
hiện biến thể IVS1+17 A>G và 5’UTR -12G>A.
Hình 3.2: Hình ảnh biến thể 5’UTR -12G>A
Trong nghiên cứu này người bệnh mã số FB64 và VN.06 đều có đột biến
ở vùng mã hóa (exon 1) ở vị trí 178, thay thế nucleotide C bằng nucleotide T,
dẫn đến thay đổi acid amin ở vị trí 60 là Prolin thành Serin.
Hình 3.3: Kết quả đột biến c.178C>T, (p.Pro60Ser) của người bệnh
mã số FB64
Nhận xét: Tại vị trí c.178 xuất hiện 1 đỉnh màu đỏ rõ nét (T), thay thế
cho đỉnh màu xanh (C) ở người bình thường, làm thay đổi bộ ba CCA mã hóa
acid amin Prolin chuyển thành TCA, mã hóa cho acid amin Serin.
69
Khi tra cứu trên hệ thống dữ liệu đột biến có sẵn như Clinvar hoặc
HGMD, chúng tôi nhận thấy đột biến này chưa từng được công bố trước đây.
Do đó, chúng tôi đã dùng các phần mềm tin sinh học là SIFT, PolyPhen-2 và
MutationTaster để dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến này. Kết quả thu
được như sau:
Bảng 3.7 Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến bằng các phầm mềm
tin sinh học
SIFT PolyPhen-2 MutationTaster
Điểm 0,00 1,00 74
Dự đoán
Khả năng gây bệnh
rất cao
Khả năng gây bệnh
rất cao
Gây bệnh
Kết quả khi sử dụng cả 3 phần mềm đều cho dự đoán khả năng gây bệnh
của đột biến này là rất cao.
Hình 3.4: Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ PolyPhen-2 để dự đoán khả
năng gây bệnh của đột biến c.178C>T
Hình 3.4 mô tả kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến
c.178C>T bằng phần mềm PolyPhen-2: đột biến có khả năng gây bệnh rất cao
với số điểm 1,00.
70
Hình 3.5: Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ MutationTaster để dự đoán
khả năng gây bệnh của đột biến c.178C>T
Hình 3.5 mô tả kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến
c.178C>T bằng phần mềm MutationTaster cho thấy đây là đột biến có khả
năng gây bệnh.
Kết quả giải trình tự gen chia nhóm người bệnh nghi ngờ mắc Fabry
thành ba nhóm: nhóm có đột biến exon là vùng có mã hóa acid amin; nhóm
có đột biến gen GLA nhưng ở vùng không mã hóa acid amin (vùng intron
hoặc 5'UTR); nhóm không có đột biến gen GLA. Bảng 3.7 thể hiện hoạt độ
enzyme GLA trung bình của 3 nhóm:
Bảng 3.8: Kết quả hoạt độ enzyme theo loại đột biến
Kết quả
giải trình tự gen
Không có đột
biến
Đột biến vùng
không mã hóa
Đột biến vùng
mã hóa
N 13 12 1
Hoạt độ enzyme trung
bình
1,05±0,53 1,11±0,72 0,17
Gây bệnh
71
Nhận xét: Nhóm có đột biến ở vùng mã hóa có kết quả hoạt độ enzyme
thấp nhất, tuy nhiên khi so sánh với 2 nhóm còn lại chúng tôi nhận thấy sự
khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Khi so sánh hoạt độ enzyme trung bình của nhóm có đột biến vùng
không mã hóa và nhóm không có đột biến, chúng tôi cũng nhận thấy sự khác
biệt không có ý nghĩa thống kê với p>0,05.
Đồ thị phân tích kết quả đo hoạt độ enzyme của 3 nhóm này được trình
bày trong hình 3.8
Biểu đồ 3.3: Đồ thị phân tích hoạt độ enzyme GLA theo kết quả
giải trình tự gen
3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các người bệnh nghi ngờ Pompe
Chúng tôi tiến hành phân tích gen cho 14 người bệnh có triệu chứng
nghi ngờ Pompe và 2 cặp vợ chồng có tiền sử sinh con Pompe. Sau khi lấy
mẫu, DNA được tách chiết từ mẫu máu toàn phần theo hướng dẫn của nhà sản
xuất, sau đó được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng cách đo quang phổ
trên máy Nanodrop. Những mẫu DNA đạt nồng độ và độ tinh sạch ≥1,8 thì
được sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
72
3.3.2.1. Kết quả khuếch đại gen GAA
DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại gen GAA bằng cặp
mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose.
M: marker
1-7: các mẫu bệnh phẩm của người bệnh mã số Pom16-Pom22
Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon14 gen GAA
Nhận xét: băng điện di rõ nét, đúng kích thước, đủ tiêu chuẩn cho các
phản ứng tiếp theo
3.3.2.2. Kết quả giải trình tự gen
Sau khi tiến hành giải trình tự gen bằng phương pháp giải trình tự trực
tiếp cho 14 người bệnh và 02 cặp vợ chồng có tiền sử sinh con Pompe, chúng
tôi thu được kết quả như sau:
73
Bảng 3.9: Kết quả giả trình tự gen GAA của các đối tượng nghiên cứu
Mã số
người
bệnh
Thay đổi nucleotid
Thay đổi
acid amin
Vị trí
Loại
đột
biến
Đồng
hợp/dị
hợp tử
Ghi chú
Pom7.0
c.625T>C
c.1933G>C
p.Tyr209His
p.Asp645His
E3
E14
Sai
nghĩa
Sai
nghĩa
Đồng
hợp tử
Dị hợp
tử
Mới
Đã công
bố118
Pom8.0
c.625T>C
c.2818-
2819delTCinsCAG
p.Tyr209His
p.Ser940fs
E3
E20
Sai
nghĩa
Dịch
khung
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Mới
Mới
Pom9.0
c.2818delT
c.2818-
2819delTCinsCAG
p.Ser940fs
E20
E20
Dịch
khung
Dị hợp
tử
Mới
Mới
Pom10.0
c.625T>C
c.2818-
2819delTCinsCAG
p.Tyr209His
p.Ser940fs
E3
E20
Sai
nghĩa
Dịch
khung
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Mới
Mới
Pom11.0
c.1933G>C
c.1933G>A
p.Asp645His
p.Asp645Asn
E14
E14
Sai
nghĩa
Sai
nghĩa
Dị hợp
tử
Dị hợp
Đã công
bố118
Đã công
bố118
Pom12.0
c.1933G>C
c.2040+1G>T
p.Asp645His
E14
Intron 14
Sai
nghĩa
Chỗ
nối
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Đã công
bố118
Đã công
bố116,117
Pom14.0
c.736delT
c.1933G>C
p.Leu246fs*22
p.Asp645His
E4
E14
Dịch
khung
Sai
nghĩa
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Đã công
bố119
Đã công
bố118
Pom16.0 c.1933G>C p.Asp645His E14
Sai
nghĩa
Đồng
hợp tử
Đã công
bố118
Pom17.0 c.1933G>C p.Asp645His E14
Sai
nghĩa
Đồng
hợp tử
Đã công
bố118
Pom18.0
c.1933G>C
c.2173C>T
p.Asp645His
p.Arg725Trp
E14
E15
Sai
nghĩa
Sai
nghĩa
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Đã công
bố118
Đã công
bố56
74
Mã số
người
bệnh
Thay đổi nucleotid
Thay đổi
acid amin
Vị trí
Loại
đột
biến
Đồng
hợp/dị
hợp tử
Ghi chú
Pom19.0
c.1735G>A
c.2040+1G>T
p.Glu579Lys
E12
Intron14
Sai
nghĩa
Chỗ
nối
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Đã công
bố56
Đã công
bố120,121
Pom20.0
c.1735G>A
c. 1411_1414del
p.Glu579Lys
p.Glu471Pfs*5
E14
E9
Sai
nghĩa
Dịch
khung
Dị hợp
tử
Dị hợp
tử
Đã công
bố56
Đã công
bố122
Pom21.0 c.625T>C p.Tyr209His E3
Sai
nghĩa
Đồng
hợp tử
Mới
Pom22.0 c.1933G>C p.Asp645His E14
Sai
nghĩa
Đồng
hợp tử
Đã công
bố118
VN
0055.0
c.2040+1G>T
Intron14
Vị trí
nối
Dị hợp
tử
Đã công
bố120,121
VN
0055.1
c.2040+1G>T
Intron14
Vị trí
nối
Dị hợp
tử
Đã công
bố120,121
VN
0056.1
c.2563 G>C p.Gly855Arg E18
Sai
nghĩa
Dị hợp
tử
Đã công
bố123
VN
0056.2
c.2563 G>C p.Gly855Arg E18
Sai
nghĩa
Dị hợp
tử
Đã công
bố123
Nhận xét: Tất cả các mẫu giải trình tự gen GAA đều phát hiện đột biến.
Các loại đột biến gặp trong nghiên cứu chủ yếu là các đột biến sai nghĩa, thay
thế 1 nucleotid dẫn đến thay thế acid amin ngoài ra còn gặp các đột biến dịch
khung. Ngoài những đột biến đã được báo cáo trong y văn, chúng tôi nhận
thấy sự xuất hiện của các đột biến mới với tần suất khá cao như: c.625T>C
(p.Tyr209His) gặp ở 4/14 người bệnh, đột biến c.2818-2819del TCinsCAG
(p.Ser940fs) gặp ở 2/14 người bệnh. 7/14 người bệnh mang đồng thời 2 đột
biến ở thể dị hợp tử (dị hợp tử kép).
Các đột biến được phân bố trên các exon 3,4,9,14,15, 18 và intron 14.
75
Đột biến sai nghĩa
Hình 3.7: Hình ảnh đột biến gen của người bệnh mã số Pom11.0
Nhận xét: Kết quả giải trình tự được đối chiếu trên Genebank cho thấy
người bệnh Pom11.0 có biến đổi ở vị trí c.1933 trên DNA từ nucleotid G
(đỉnh màu đen) thành C (màu xanh lam) và G thành A (màu xanh lá). Sự biến
đổi này dẫn đến sự thay đổi acid amin từ Aspartat (GAT - D) thành Histidin
(CAT - H) và thành Asparagine (AAT - N) ở vị trí p.645 (p.Asp645His,
p.Asp645Asn), đây là một đột biến sai nghĩa nằm trong vùng mã hóa exon 14
của gen GAA.
Đột biến dịch khung
Người bình thường
Người bệnh Pom20.7
Người bệnh Pom20.4
Hình 3.8: Hình ảnh kết đột biến c.1411-1414delGAGA ở người bệnh
Pom20.4 và Pom20.7
76
Nhận xét: Tại vị trí c.1411-1414 trên exon 9 của người bệnh mã số
Pom20.4 và Pom20.7 bị thiếu mất 1 đoạn gồm 4 nucleotid so với hình ảnh
của người bệnh mã số Pom.20.3, gây ra sự dịch khung sau codon 471.
Đột biến vị trí nối: c.2040+1G>T
Hình 3.9: Hình ảnh đột biến chỗ nối trên intron 14 của người bệnh
mã số Pom12.0
Nhận xét: Tại vị trí c.2040+1 trên intron 14 có sự thay thế nucleotid G
(đỉnh màu đen) bằng nucleotid T (đỉnh màu đỏ). Tuy nhiên ta vẫn quan sát
được 1 đỉnh G nên đây là đột biến thể dị hợp tử.
Bảng 3.10. Tần suất xuất hiện các đột biến trong nghiên cứu
Thay đổi nucleotid Thay đổi acid
amin
Vị trí Loại đột
biến
Tần suất
c.625T>C p.Tyr209His E3 Sai nghĩa 4
c736delT p.Leu246fs E4 Dịch khung 1
c. 1411_1414del p.Glu471Profs E9 Dịch khung 1
c.2040+1G>T Intron 14 Vị trí nối 1
c.1933G>C p.Asp645His E14 Sai nghĩa 7
c.1933G>A p.Asp645Asn E14 Sai nghĩa 1
c.1735G>A p.Glu579Lys E14 Sai nghĩa 1
c.2173C>T p.Arg725Asn E15 Sai nghĩa 1
c.2818-
2819delTinsCAG
p.Ser940fs E20 Dịch khung 3
77
Nhận xét: đột biến xuất hiện với tần suất cao nhất là đột biến c.1933G>C
(p.Asp654His) với 7/14 trường hợp, tiếp đó là đến đột biến c.625T>C
(p.Tyr209His) với 4/14 trường hợp.
Các đột biến được phát hiện trong nghiên cứu sẽ được tra cứu trên hệ thống
dự liệu đột biến có sẵn ClinVar ( và cơ sở
dữ liệu về bệnh Pompe (https:// pompevariantdatabase.nl/ pompe_mutations), để
xác định đột biến đã công bố và khả năng gây bệnh. Đối với các đột biến mới,
chúng tôi sử dụng các phần mềm dự đoán tin sinh học (in silico) để dự đoán
khả năng gây bệnh.
Hai đột biến tìm được trong nghiên cứu là những đột biến chưa được
công bố, trong đó có 1 đột biến sai nghĩa là c.625T>C, đột biến này làm thay
đổi trình tự acid amin nhưng không làm ảnh hưởng đến chiều dài của phân tử
protein. Do đó, để dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến sai nghĩa này
chúng tôi đã sử dụng các công cụ phân tích in silico bằng cách dùng phần
mềm MutationTaster, SIFT và công cụ Polyphen-2.
Bảng 3.11. Kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C
bằng các phần mền tin sinh học
SIFT PolyPhen-2 MutationTaster
Điểm 0,14 1,0 83
Dự đoán Lành tính Khả năng gây bệnh
rất cao
Gây bệnh
Kết quả dự đoán đột biến c.625T>C bằng phần mềm PolyPhen-2 và
MutationTaster đều cho rằng đây là đột biến có khả năng gây bệnh, tuy nhiên,
phần mềm SIFT lại cho rằng đột biến này lành tính với số điểm là 0.14.
78
Hình 3.10: Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của
đột biến c.625T>C bằng phần mềm PolyPhen2.
Hình 3.10 cho thấy kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến
c.625T>C bằng phần mềm PolyPhen-2 là rất cao với số điểm là 1.00.
Hình 3.11: Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của
đột biến c.625T>C bằng phần mềm MutationTaster.
Kết quả dự đoán bằng phần mềm MutationTaster cho thấy đột biến
c.625T>C là đột biến có khả năng gây bệnh.
Có thể gây bệnh
Gây bệnh
79
3.4. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh
3.4.1. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người
bệnh Fabry.
Trong nghiên cứu này chúng tôi phát hiện người bệnh mã số FB64 và
trẻ mã số VN.06 (có mẹ là người Việt Nam và bố là người Đài Loan có hoạt
độ enzyme GLA thấp, được phát hiện thông qua chương trình sàng lọc sơ sinh
ở Đài Loan) đều mang đột biến tại vùng mã hóa của gen GLA. Tuy nhiên, gia
đình người bệnh Fb64 không muốn tham gia nghiên cứu. Chúng tôi tiến hành
lấy mẫu máu của các thành viên trong gia đình bên ngoại của trẻ VN.06 để
phân tích. Bà ngoại, bố mẹ và người bệnh đều sống tại Đài Loan nên chúng
tôi tiến hành đo hoạt độ enzyme từ huyết thanh, kết quả hoạt độ enzyme như
sau:
Bảng 3.12: Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA từ mẫu máu toàn phần
STT
Mã số
người bệnh
Quan hệ với
người bệnh
Hoạt độ enzyme (nmol/h/mL)
Ref: 5,41-17,99 (nmol/h/mL)
1 VN.03 Bà ngoại 8,14
2 VN.04 Bố 9,25
3 VN.05 Mẹ 7,08
4 VN.06 Người bệnh 3,53
Nhận xét: Người bệnh mã số VN.06 có hoạt độ enzyme thấp hơn giá trị
bình thường, trong khi bố, mẹ và bà ngoại của người bệnh có hoạt độ enzyme
trong khoảng giá trị tham chiếu.
Các thành viên còn lại trong gia đình người bệnh sống tại Việt Nam
nên chúng tôi thu thập máu bằng giấy thấm khô DBS, hoạt độ enzyme GLA
được đo bằng phương pháp đo khối phổ song song. Kết quả được thể hiện
trong bảng:
80
Bảng 3.13: Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA từ giấy thấm DBS
STT
Mã số người
bệnh
Mối quan hệ với
người bệnh VN.06
Hoạt độ enzyme (µmol/h/L)
Ref: 2,05- 7,46 µmol/h/L
1 VN.01 Cụ ngoại (cụ bà) 2,46
2 VN.02 Ông ngoại 0,6
3 VN.07 Dì 0,5
4 VN.08 Em trai họ (con dì) 0,47
5 VN.09 Em trai họ (con dì) 0,65
Nhận xét: Kết quả cho thấy trong gia đình có người bệnh, ông
ngoại, dì và 2 con trai của dì có hoạt độ enzyme thấp hơn dải tham chiếu
(2,05- 7,46 µmol/h/L), cụ ngoại của người bệnh có hoạt độ enzyme trong
giới hạn bình thường.
Từ người bệnh mã số VN. 06, chúng tôi tiến hành giải trình tự gen exon
1 cho các thành viên trong gia đình. Sau khi có kết quả giải trình tự gen chúng
tôi lập được phả hệ của gia đình như sau:
81
Hình 3.12: Phả hệ của gia đình mã số VN.06
- Người bệnh VN.06 (IV-1) mang đột biến c.178 C>T làm thay đổi acid
amin ở vị trí 60 là prolin thành serin trên exon 1 của gen GLA.
- Gia đình có 8 thành viên tham gia vào nghiên cứu gồm: cụ ngoại
(I-1), ông ngoại (II-3), bà ngoại (II-4), bố đẻ (III-1), mẹ (III-2), cậu (III-3),
dì (III-4) 2 người cháu em họ là con của dì (IV-2, IV-3). Tại thời điểm
nghiên cứu, các thành viên trong gia đình chưa được chẩn đoán Fabry và
không có biểu hiện bệnh lý tim mạch.
- Kết quả phân tích gen GLA tại vị trí exon 1 đã phát hiện có 6 thành
viên mang đột biến giống người bệnh là ông ngoại (II-3), mẹ đẻ (III-2), dì (III-
4) và 2 người em họ (IV-2 và IV-3) là con của dì (III-4). Các thành viên nữ
mang đột biến đều ở thể dị hợp tử.
- Đột biến gen GLA xuất hiện ở cụ ngoại (I-2) đã truyền cho ông ngoại (II-
3), rồi từ ông ngoại truyền cho mẹ (III-2) và dì (III-4). Đột biến này ở mẹ (III-2)
82
đã truyền cho người bệnh (IV-1) và ở dì (III-4) đã truyền cho 2 con trai (IV-2 và
IV-3). Như vậy đột biến này đã xuất hiện ở 4 thế hệ trong gia đình người bệnh
VN.06.
Kết quả hoạt độ enzyme và kết quả giải trình tự gen:
Khi tổng hợp kết quả giải trình tự gen và kết quả đo hoạt độ enzyme,
chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.14: Kết quả đo hoạt độ enzyme và kết quả giải trình tự exon 1 của
gia đình người bệnh mã số VN.06.
Mã số người
bệnh
Giới
Quan hệ
với người
bệnh
Đột biến
gen
Hoạt độ enzyme
GLA
VN.01 Nữ Cụ c.178 C>T 2,46
VN.02 Nam Ông ngoại c.178 C>T 0,6
VN.03 Nữ Bà ngoại - 8,14
VN.04 Nam Bố - 9,25
VN.05 Nữ Mẹ c.178 C>T 7,08
VN.06 Nam Người bệnh c.178 C>T 3,53
VN.07 Nữ Dì c.178 C>T 0,5
VN.08 Nam Em họ c.178 C>T 0,47
VN.09 Nam Em họ c.178 C>T 0,65
Nhận xét: Cụ ngoại và mẹ của người bệnh có đột biến gen nhưng có hoạt
độ enzyme trong giới hạn bình thường, trong khi dì của người bệnh cũng
mang đột biến thì lại có hoạt độ enzyme thấp. Các thành viên nam có đột biến
đều có hoạt độ enzyme thấp hơn so với giá trị bình thường.
83
3.4.2. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh
Pompe
Từ 07 người bệnh Pompe đã xác định được đột biến và 1 cặp vợ chồng
có tiền sử sinh con mắc bệnh Pompe, chúng tôi tiến hành lấy mẫu và phân
tích trình tự gen cho các thành viên trong gia đình để lập phả hệ, xác định
người lành mang gen.
3.4.2.1. Gia đình người bệnh mã số Pom16
Người bệnh mã số Pom16 mang đột biến c.1933G>C (p.Asp645His) ở
exon 14, đồng hợp tử, nên với các thành viên trong gia đình người bệnh
chúng tôi chỉ tiến hành giải trình tự exon 14.
Hình 3.13: Phả hệ gia đình mã số Pom16
- Người bệnh Pom16 (III-3) mang đột biến đồng hợp tử biến c.1933G>C
dẫn đến thay thế acid amin Aspartat thành acid amin Histidin ở vị trí p.645
nằm trên vùng mã hóa exon 14.
84
- Có 14 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1),
bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), 2 bác ruột (II-1 vàII-3), bố đẻ (II-
4), mẹ đẻ (II-5), dì (II-6), cậu (II-5), anh họ (III-3), 2 chị họ (III-1, III-2), em
họ (III-5).
- Kết quả phân tích gen GAA tại vị trí exon 14 đã phát hiện ra 10 thành
viên mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) giống người bệnh gồm: ông
nội (I-1), ông ngoại (I-3), 2 bác ruột (II-1 và II-3), bố đẻ (II-4), mẹ đẻ (II-5),
cậu (II-6), dì (II-7), 2 chị họ (III-1, III-2), em họ (III-5). Các thành viên mang
đột biến đều ở thể dị hợp tử.
- Đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) xuất hiện ông nội đã di truyền
cho bố và bác gái, xuất hiện ở ông ngoại đã di truyền cho mẹ, cậu và dì.
Đột biến này ở bố và mẹ đã di truyền cho người con gái là người bệnh
Pome16. Đột biến ở bác đã di truyền cho 2 con gái của bác (là chị họ của
người bệnh), và đột biến ở dì đã di truyền cho con gái của dì, là em họ của
người bệnh. Tuy nhiên, các thành viên trong gia đình mang đột biến gen
thể dị hợp tử nên không có biểu hiện bệnh.
3.4.2.2. Gia đình người bệnh mã số Pom17
Người bệnh mã số Pom17 mang đột biến trên exon 14: c.1933G>C
(p.Asp645His) đồng hợp tử, với các thành viên trong gia đình chúng tôi tiến
hành giải trình tự exon 14 để tìm đột biến.
85
Hình 3.14: Phả hệ gia đình mã số Pom17
- Người bệnh Pom17 (III-1) mang đột biến đồng hợp tử biến c.1933G>C
dẫn đến thay thế acid amin Aspartat thành acid amin Histidin ở vị trí p.645
nằm trên vùng mã hóa exon 14.
- Có 10 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1),
bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác ruột (II-1), bác rể (II-2), bố đẻ
(II-3), mẹ đẻ (II-4), dì (II-5), cậu (II-6).
- Kết quả phân tích gen GAA tại vị trí exon 14 đã phát hiện ra 6 thành
viên mang đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) giống người bệnh gồm: ông
nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác ruột (II-1), bố đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4) và dì (II-5).
Các thành viên mang đột biến đều ở thể dị hợp tử.
- Đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) xuất hiện ông nội đã di truyền
cho bố và bác gái, xuất hiện ở ông ngoại đã di truyền cho mẹ và dì. Đột
biến này ở bố và mẹ đã di truyền cho người con trai là người bệnh Pome17.
Tuy nhiên, các thành viên trong gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử
nên không có biểu hiện bệnh.
86
3.2.4.3. Gia đình người bệnh mã số Pom18
Hình 3.15: Phả hệ gia đình mã số Pom18
- Người bệnh Pom18 (III-1) mang 2 đột biến là c.1933G>C
(p.Asp645His) trên exon 14 và đột biến c.2173C>T (p.arg725Trp) trên exon
15, đều ở thể dị hợp tử. Có 7 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu
gồm: ông nội (I-1), bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bố đẻ (II-1),
mẹ đẻ (II-2), và em trai của người bệnh (III-2).
- Kết quả phân tích gen GAA tại vị trí exon 14 và exon 15 đã phát hiện
ra 5 thành viên mang đột biến, gồm bà nội (I-2) và bố (II-1) của người bệnh
mang đột biến c.2173C>T (p.Arg725Trp) thể dị hợp, ông nội (I-1), ông ngoại
(I-3) và mẹ (II-2) của người bệnh cùng mang đột biến c.1933G>C
(p.Asp645His). Các thành viên mang đột biến đều ở thể dị hợp tử.
- Đột biến (c.1933G>C (p.Asp645His) xuất hiện bà nội đã di truyền cho
bố, xuất hiện ở ông ngoại đã di truyền cho mẹ. Đột biến này ở bố và mẹ đã di
truyền cho người con gái là người bệnh Pome18. Tuy nhiên, các thành viên
trong gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên không có biểu hiện bệnh.
Người bệnh mang cả 2 đột biến ở thể dị hợp và có biểu hiện bệnh.
87
3.4.2.4. Gia đình người bệnh mã số Pom19
Hình 3.16: Phả hệ gia đình mã số Pom19
- Người bệnh Pom19 (III-3) mang đồng thời 2 đột biến thể dị hợp tử là
c.1735G>A dẫn đến thay thế acid amin Glutamat thành acid amin Lysin ở vị
trí p.579 nằm trên vùng mã hóa exon 12 và đột biến c.2040+1G>T thể dị hợp
trên intron 14.
- Có 12 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1),
bà nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), cô ruột (II-1), chồng cô (II-2), bố
đẻ (II-3), mẹ đẻ (II-4), dì (II-6), cậu (II-5), anh họ (III-3), 3 em họ - con cô
(III-1, III-2, III-3), anh ruột (III-5) và em họ con dì (III-6).
- Kết quả phân tích gen GAA tại vị trí exon 12 và intron 14 đã phát
hiện ra 5 thành viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-1) và bố đẻ (II-3) cùng
mang đột biến c.2040+1G>T, ông ngoại (I-3) mẹ đẻ (II-4) và anh trai ruột
(III-4) cùng mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys). Các thành viên mang
đột biến đều ở thể dị hợp tử.
88
- Đột biến c.2040+1G>T xuất hiện ông nội đã di truyền cho bố, đột biến
c.1735G>A (p.Glu579Lys) xuất hiện ở ông ngoại đã di truyền cho mẹ. Đột biến
này ở bố và mẹ đã di truyền cho người con trai là người bệnh Pom e19 và đột
biến của mẹ di truyền cho anh trai (III-4). Tuy nhiên, các thành viên trong gia
đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên không có biểu hiện bệnh.
3.4.2.5. Gia đình người bệnh mã số Pom20
Hình 3.17: Phả hệ gia đình mã số Pom20
- Người bệnh Pom20 (III-1) mang đồng thời 2 đột biến thể dị hợp tử là
c.1411-1414del (p.Glu471Profs) trên exon 9; c.1735G>A (p.Glu579Lys) trên
exon 12.
- Có 7 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: bà nội (I-2), bà
ngoại (I-3), ông ngoại (I-4), bố đẻ (II-1), mẹ đẻ (II-2), dì (II-4) và cậu (II-3).
- Kết quả phân tích gen GAA tại vị trí exon 9 và exon 12 đã phát hiện
ra 5 thành viên mang đột biến, gồm: bà nội (I-2) và bố đẻ (II-2) cùng mang
đột biến c.1411-1414del (p.Glu471Profs), bà ngoại (I-3), mẹ đẻ (II-1) và cậu
(III-3) cùng mang đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys). Các thành viên mang
đột biến đều ở thể dị hợp tử.
89
- Đột biến c.1411del (p.Glu471Profs) xuất hiện bà nội đã di truyền cho
bố, đột biến c.1735G>A (p.Glu579Lys) xuất hiện ở bà ngoại đã di truyền
cho mẹ và cậu. 2 đột biến ở bố và mẹ đã di truyền cho người con gái là
người bệnh Pom20. Tuy nhiên, các thành viên trong gia đình mang đột biến
gen thể dị hợp tử nên không có biểu hiện bệnh.
3.4.2.6. Gia đình người bệnh mã số Pom21
Hình 3.18: Phả hệ gia đình mã số Pom21
- Người bệnh Pom21 (III-2) mang đột biến thể đồng hợp tử là c.625T>C
dẫn đến thay thế acid amin Tyrosin thành acid amin Histidin ở vị trí p.209
trên exon 3.
- Có 13 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1), bà
nội (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác – chị gái bố (II-1), chồng bác (II-2),
2 cô ruột (II-3, II-4), bố đẻ (II-5), mẹ đẻ (II-6), cậu (II-7) và anh họ (III-1).
- Kết quả phân tích gen GAA tại vị trí exon 3 đã phát hiện ra 7 thành
viên mang đột biến, gồm: ông nội (I-1), ông ngoại (I-3), bác – chị gái bố (II-
1), cô (II-3), bố đẻ (II-5), mẹ đẻ (II-6), cậu (II-7) và anh trai họ (III-1) cùng
mang đột biến giống người bệnh. Các thành viên mang đột biến đều ở thể dị
hợp tử.
90
- Đột biến c.625T>C (p.Tyr209His) xuất hiện ông nội đã di truyền cho
bác, cô và bố, xuất hiện ở ông ngoại đã di truyền cho mẹ. Đột biến này ở
bố và mẹ đã di truyền cho người con trai là người bệnh Pome20 và đột biến
của bác (II-2) di truyền cho anh họ (III-1). Tuy nhiên, các thành viên trong
gia đình mang đột biến gen thể dị hợp tử nên không có biểu hiện bệnh.
3.4.2.7. Gia đình người bệnh mã số Pom22
Hình 3.19. Phả hệ gia đình mã số Pom22
- Người bệnh Pom22 (III-1) mang đột biến c.1933G>C thể đồng hợp tử
làm thay thế Aspartat bằng Histidin ở vị trí p.645 trên exon 14.
- Có 8 thành viên gia đình tham gia vào nghiên cứu gồm: ông nội (I-1), bà
ngoại (I-2), ông ngoại (I-3), bà ngoại (I-4), bác – chị gái bố (II-1), bố đẻ (II-2),
mẹ đẻ (II-3)