Luận văn Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng (Rheum officinale Baill.)

việc sử dụng thang pH vẫn được phát triển trong HSCCC. Điều chỉnh nhiệt độ trong điều kiện tốt nhất, các tác giả [15] đã phân tách được 5 hydroxyantraquinon và axit xinamic từ dịch chiết thô của cây đại hoàng: STT R1 R2 Tên 1 H COOH Rhein 2 CH3 OH Emodin 3 H CH2OH Aloe-emodin 4 H CH3 Chrysophanol 5 CH3 OCH3 Physcion 1.3.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đại hoàng (Rheum sp.) *Cây đại hoàng thuộc loại cây thuốc của y học dân gian Việt Nam kết hợp với một số cây thuốc khác làm thang thuốc chữa được rất nhiều loại bệnh. Ở Việt Nam đã chiết xuất được axit chrysophanic từ cây đại hoàng (Rheum pulmatuml L.) để điều chế ra cream chrysophanic có khả năng chống nấm [6]. *Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc từ rễ cây đại hoàng (Rheum officinale Baill.) các nhà khoa học đã phân lập được 5 hợp chất hydroxyantraquinon có khả năng chống vi khuẩn: Rhein > emodin > aloe-emodin> chrysophanola> physicion. Trong đó emodi là tác nhân chống virus SARS [17]. 1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOẠT TÍNH CỦA CÂY ĐẠI HOÀNG (Rheum sp.) [2] Trong cây đại hoàng có 2 chất có tác dụng trái ngược nhau là hợp chất thu liễm và hợp chất có tác dụng tẩy. 1.4.1. Loại hợp chất có tính thu liễm - Là hợp chất có tannin (rheotanno glucozit). Thành phần chủ yếu trong các rheotanno glucozit là glucogalin. Khi thủy phân glucogalin sẽ cho axit galic và glucoza. Ngoài ra còn có axit galic, catechin và tetrain. Khi tetrain chịu tác động của axit loãng sẽ cho glucozareosmin (rheomin), axit xinamic và axit galic. 1.4.2. Loại hoạt chất có tác dụng tẩy Reoantragucozit có các chất chủ yếu sau đây: Chrysophanol : C15H10O4 Aloe - emodin : C15H10O5 Rhein : C15H10O6 Emodin hay Rheum emodin : C15H10O5 Emodin - monometyl ete : C16H12O5 Tỉ lệ các antraglucozit toàn bộ trong cây đại hoàng vào chừng khoảng 2 - 4.5%, trong đó một phần tồn tại ở trạng thái tự do, một phần ở trạng thái kết hợp. Ở đại hoàng tươi (theo Wasicky và Hein) chỉ có antraglucozit ở dạng kết hợp. Chương 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là rễ của cây đại hoàng được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam. Mẫu được cung cấp bởi tiến sĩ Lê Thị Thu Nhạn - Viện Y học Cổ truyền Trung Ương vào tháng 7 năm 2006. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 2.1.2.1. Xác định tên khoa học của cây đại hoàng Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định cây đại hoàng nghiên cứu có tên khoa học là Rheum officinale Baill. và gọi là dược dụng đại hoàng. 2.1.2.2. Định tính các hợp chất có trong rễ cây đại hoàng. 2.1.2.3. Phân lập và nhận dạng một số cấu tử có trong rễ cây đại hoàng.Tách bằng phương pháp ngâm chiết, sắc ký cột, sắc ký lớp bản mỏng, tinh chế. Sử dụng một số phương pháp vật lý hiện đại để xác nhận cấu trúc hợp chất tách được. 2.1.2.4. Thử hoạt tính sinh học đối với một số chất phân lập được từ các dịch chiết. 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu + Sử dụng phương pháp ngâm chiết để tách chất khỏi rễ cây. + Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân tích, phân tách hỗn hợp và phân lập các hợp chất như: Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS), Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS), sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, tinh chế bằng dung môi... + Sử dụng các các phương pháp vật lý hiện đại để xác định công thức phân tử, công thức cấu tạo của các hợp chất như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ 1H-NMR, 13C-NMR và 2D-NMR + Xác định hoạt tính sinh học đối với vi sinh vật kiểm định. 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 2.2.1. Thiết bị + Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi đặt ở bộ môn Hóa hữu cơ. + Phổ hồng ngoại FT-IR ghi trên máy IMPACT-410 dưới dạng viên nén với KBr đo tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. + Sắc ký khí ghép khối phổ liên hợp GC- MS 196D + Thiết bị đo cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500 MHz (1H-NMR; 13C-NMR; DEPT; HMBC;HSQC). + Các kết quả đo được phân tích dựa theo các tài liệu [8], [15]. 2.2.2 Dụng cụ +) Sắc ký cột (Ø = 25mm, d=600mm), (Ø = 28mm, d=800mm) chất hấp phụ là silicagel (hãng Merck-60), kích thước hạt 40-60(µm). Hệ dung môi rửa giải là: n-hexan-etyl axetat, n-hexan-axeton tăng dần độ phân cực. +) Sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel (Merck). Hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng là n-hexan-etyl axetat, n-hexan-axeton, etyl axetat-metanol với tỉ lệ phù hợp để khả năng tách tốt nhất. +) Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2.2.3. Hóa chất +) Dung môi: Metanol, n-hexan, etyl axetat (EtOAc), axeton, butanol... +) Thuốc hiện hình: Vanilin trong H2SO4 đặc. +) Hóa chất khác: H2SO4, NaOH, FeCl3 5%, bột Mg, dung dịch HCl đặc, dung dịch CH3COOH 5%, anhidrit axetic, thuốc thử Dragendorf... 2.3. THỰC NGHIỆM 2.3.1. Thu nhận dịch chiết Rễ cây sau khi thu mua được làm sạch và sấy khô ở 400C, đập nhỏ và ngâm chiết bằng metanol công nghiệp. Dịch thu được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết tổng. Cặn chiết tổng được xử lý theo sơ đồ sau đây: Sơ đồ 2.1: Thu nhận các chiết phẩm từ mẫu khô. Mẫu khô Ngâm trong Metanol Dịch tổng 1.Cất đuổi dung môi 2.Lọc hút chân không Kết tủa A Dịch chiết B Chiết với nước và n-hexan Dịch nước 1 Cất đuổi dung môi Cặn n-hexan(C) Chiết với Clorofom Cất đuổi dung môi Cặn clorofom(D) Dịch nước 2 Chiết với etyl axetat Cất đuổi dung môi Cặn etyl axetat(E) Dịch nước 3 Chiết với Butanol Cất đuổi dung môi Cặn butanol(F) Dịch nước 4 Chúng tôi lấy 1kg mẫu khô, sau khi lấy được dịch tổng, cất quay chân không thu được dung môi và dịch cất quay (không cần đến khô kiệt). Để kết tinh, đem lọc hút chân không thu được dịch chiết B và 16,341 g kết tủa A. Đối với dịch chiết B: + Dịch chiết B đem chiết với nước và n-hexan (Vnước: Vn-hexan = 1:1) thu được dịch nước 1 và dịch n-hexan (chiết đến khi n-hexan không xuất hiện màu). + Dịch nước 1 đem đi chiết với clorofom (Vnước: Vclorofom = 1:1) thu được dịch nước 2 và dịch clorofom (chiết đến khi clorofom không xuất hiện màu). + Dịch nước 2 đem đi chiết với etyl axetat (Vnước: Vetyl axetat = 1:1) thu được dịch nước 3 và dịch etyl axetat (chiết đến khi etyl axetat không xuất hiện màu). + Dịch nước 3 đem đi chiết với butanol (Vnước: Vbutanol = 1:1) thu được dịch nước 4 và dịch butanol (chiết đến khi butanol không xuất hiện màu). 2.3.2. Định tính các lớp chất trong cặn chiết 2.3.2.1. Định tính Sterol Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đến khô. Hòa tan cặn trong 3ml CHCl3, lấy dịch clorofom để làm phản ứng với các Sterol bằng thuốc thử Liebeman-Bourchardt (hỗn hợp gồm 1ml anhydrit axetic + 1ml clorofom để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử dung dịch xuất hiện màu xanh bền trong một thời gian là dương tính. 2.3.2.2. Phát hiện ankaloit Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều lọc qua giấy lọc, lấy vào ba ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước lọc axit: Ống 1: 1-2 giọt dung dịch silicostungtich axit 5%, nếu có kết tủa trắng và nhiều là dương tính. Ống 2: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorf, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống 3: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. Ở đây chúng tôi chỉ dùng thuốc thử Dragendorf. 2.3.2.3. Phát hiện Flavonoit Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 10ml CH3OH đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút đến khi xuất hiện kết tủa màu đỏ nâu hoặc hồng là dương tính với Flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện Cumarin Dịch thử định tính chuẩn bị như mục 2.3.2.3. Lấy vào ống nghiệm mỗi ống 2ml dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ống không có kiềm có thể coi là dương tính. Nếu đem axit hóa ống có kiềm bằng một vài giọt axit HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong suốt mất màu vàng, xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính. 2.3.2.5. Định tính Saponin Chuẩn bị dịch thử như mục 2.3.2.3. Lấy 2ml dịch thử vào ống nghiệm rồi thêm 5ml nước cất. Bịt miệng ống nghiệm và lắc trong 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3-4 cm và bền vững 15 phút là có dấu hiệu dương tính. 2.3.2.6. Định tính Tanin Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 10ml nước cất quấy đều cho tan, nhỏ 2-3 giọt FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu xanh hoặc lục đen là dương tính. 2.3.2.7. Định tính glucozit trợ tim Phản ứng Keller-Kilial: thuốc thử gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100ml CH3COOH loãng + 1ml dung dịch FeCl3 5%. Dung dịch 2: 100ml H2SO4 đậm đặc + 1ml dung dịch FeCl3 5%. Cách tiến hành: Lấy 0,01 g cặn tổng cho vào ống nghiệm, thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết. Nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu đỏ nâu giữa các lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu đỏ nâu là phản ứng âm tính với các glucozit trợ tim, vì glucozit luôn luôn có mặt của các deoxysacarit. 2.3.3. Xử lý phần kết tinh A Phần kết tủa A rửa sạch, sấy khô với áp suất thấp ở khoảng 40oC thu được m = 16,341 g. Chúng tôi tiến hành kiểm tra chất kết tủa A trên sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi sau: + Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 8:2 thì nhận thấy trên bản mỏng cho 7 chấm tròn với 6 chấm màu vàng có độ đậm nhạt khác nhau và có giá trị Rf là Rf x 100 = 75; 66; 63; 51; 49; 36. Một chấm phát hiện bằng đèn tử ngoại có giá trị Rf là Rf x 100 = 79. +Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 1:1, chúng tôi không thu được chấm tròn nào. + Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1, chúng tôi thấy có những chấm màu không thể phân tách, chiếu bằng đèn tử ngoại thấy có một chấm sáng tách ra hẳn với những chấm màu với giá trị Rf là Rf x 100 = 88. Như vậy quá trình chiết tách được thực hiện theo sơ đồ 2.2: (Để thuận tiện chúng tôi ký hiệu n-hexan là H và etyl axetat là E) Sơ đồ 2.2: Quá trình chiết tách kết tủa A Kết tủa A 1.Cột sắc kí (Ø= 28mm,d=600mm) 2.Chất hấp phụ silicagel (0,063÷0,2)mm 3.n-hexan:Etyl axetat(H:E) H: E 99:1 H: E 99:1 H: E 99:1 H: E 99:1 H: E 99:1 H: E 99:1 H: E 99:1 A7 A6 A5 A4 A3 A2 A1 T3 T1 T4 T2 + Một gam kết tủa A được tiến hành trên sắc ký cột sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan - Etyl axetat với tỷ lệ 100 ÷ 0 theo độ tăng dần của hệ dung môi phân cực thu được các phân đoạn A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7. + Phân đoạn A1 thu được ở hệ dung môi chạy cột n-hexan: Etyl axetat = 99:1 có xuất hiện kết tinh hình kim, màu vàng da cam. Rửa sạch, sấy khô, kiểm tra sắc ký lớp mỏng, chúng tôi chỉ thu được duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra thuốc thử vanilin - H2SO4 đặc vẫn chỉ thu được một chấm tròn với giá trị Rf1 x 100 = 88 (Rf1 là giá trị Rf trong hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1) và có nhiệt độ nóng chảy là 196 ÷ 1970C. Chúng tôi ký hiệu là chất T1(II.16). + Phân đoạn A2 thu được khi chạy với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 98: 2 có xuất hiện kết tủa màu vàng da cam có khối lượng là 0,042 g. Rửa sạch, sấy khô, kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9: 1, chúng tôi thu được 2 chấm tròn với giá trị Rf x 100 = 88; 79. Kết tủa này có nhiệt độ nóng chảy là 191,70C ÷ 195,10C, và được ký hiệu là A2. So sánh kết tủa với chất T1 bằng sắc ký bản mỏng, chúng tôi nhận thấy trong A2 có chứa chất T1 (chất 1). Chúng tôi tiến hành sắc ký cột (Ø = 25mm, d =600mm) kết tủa A2 sử dụng hệ dung môi rửa giải n-hexan - Axeton với tỷ lệ 100 ÷ 0 theo độ tăng dần của dung môi phân cực thu được các phân đoạn A2.1; A2.2; A2.3 theo sơ đồ 2.3 sau: Sơ đồ 23: Quá trình phân lập kết tủa A2 KÕt tña A2 1.Cét s¾c ký(ø=25mm,d=600mm) 2.ChÊt hÊp phô silicagel (0,063÷0,2)mm 3.n-hexan: Axeton A2.1 A2.3 A2.3 n-hexan: Axeton 100:0 n-hexan: Axeton 199:1 n-hexan: Axeton 99:1 T1 T2 Phân đoạn A2.1 ở hệ dung môi n-hexan: Axeton = 100:0 thu được chất T1. Phân đoạn A2.3 thu được ở hệ dung môi n-hexan: Axeton = 99:1 có xuất hiện kết tinh hình kim, màu vàng tươi. Rửa sạch, sấy khô, chấm lại bản mỏng với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1 thu được một chấm tròn màu vàng có giá trị Rf2 x 100 = 79, thử thuốc hiện hình vanilin- H2SO4 vẫn chỉ có một chấm tròn màu vàng. Kết tinh thứ 2 có nhiệt độ nóng chảy là 208,2÷ 2090C và ký hiệu là T2 (chất 2). + Phân đoạn A3 chạy với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 95:5 thu được một kết tinh màu vàng tươi, kiểm tra sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy. Chúng tôi kết luận kết tinh này là T2. + Phân đoạn A5 chạy với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 4:1 có xuất hiện kết tinh dạng bông, màu vàng da cam. Rửa sạch, sấy khô, kiểm tra bản mỏng với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1 thu được một chấm tròn màu vàng có giá trị Rf3 x 100 = 70, nhiệt độ nóng chảy là 159,9÷160,80C, kết tinh này cũng không có phản ứng với thuốc thử vanilin - H2SO4. Chúng tôi ký hiệu kết tinh ở phân đoạn này là T3 (chất 3). + Phân đoạn A6 với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 2:1 có kết tinh hình kim, màu trắng. rửa sạch, sấy khô, chấm bản mỏng dùng thuốc hiện hình vanilin - H2SO4 thu được chấm tròn màu tím nhạt có giá trị Rf4 x 100 = 64. Vì lượng kết tinh quá ít, chỉ dính thành lọ nên chúng tôi chưa đo được nhiệt độ nóng chảy, chất này ký hiệu là T4 (chất 4). 2.3.4. Xử lý cặn chiết butanol (F) Sau khi cất đuổi dung môi, chúng tôi thu được 56,6 g cặn chiết và thử sắc ký lớp mỏng F với hệ dung môi chạy sắc ký là: + Etyl axetat: Metanol = 5:1, thấy có 2 chấm tròn màu vàng có giá trị Rf x 100 = 98; 95 và có một vệt đen kéo dài với khoảng giá trị Rf x 100 = 10÷64. + N - hexan: Etyl axetat = 1:1 có xuất hiện 2 chấm tròn màu vàng có Rf x 100 = 64; 44 và chấm đen thì không chạy lên được. Vì vậy chúng tôi tiến hành sắc ký cột, rửa giải với 2 hệ dung môi là n-hexan: Etyl axetat = 100 ÷ 0 và Etyl axetat: Metanol = 100 ÷ 0 theo độ tăng dần của dung môi phân cực. Do thời gian hạn hẹp nên chúng tôi chỉ mới tiến hành được trong hệ dung môi n-hexan - Etyl axetat với sơ đồ sau: Sơ đồ 2.4: Quá trình tách chiết cặn butanol (F) CÆn butanol F 1.Cét s¾c ký (Ø =28mm,d=800mm). 2.ChÊt hÊp phô silicagel (0,063÷0,2)mm 3.n-hexan: Etyl Axetat(n-H:EtOAc)=100: 0 F2 F3 F4 F5 n-H:EtOAc 4:1 n-H:EtOAc 3:1 n-H:EtOAc 2:1 n-H:EtOAc 1:1 n-H:EtOAc 1:2 T3 T5 F1 Với sơ đồ trên chúng tôi đã thu được kết quả như sau: + Phân đoạn F1, F2 chúng tôi thu được kết tinh dạng bông, màu vàng da cam. Qua các phép so sánh chúng tôi kết luận kết tinh ở phân đoạn này là chất T3. + Phân đoạn F4, chúng tôi thu được kết tinh hình kim, màu trắng. Rửa sạch, sấy khô, chấm sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n-hexan - etyl axetat = 1:4, thu được chấm đen có Rf5 x 100 = 32. Ký hiệu là T5 (chất 5). 2.3.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.3.5.1. Thử hoạt tính kháng sinh Từ chất sạch mà chúng tôi tiến hành thử kháng vi sinh vật kiểm định (altimicrobial activity). Bước 1: Thử định tính theo phương pháp khuyết tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn. Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm có: - Hai vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli, P. aeruginosa. + Escherichia coli: thường sống trong đường ruột, ít nhạy cảm với chất kháng sinh, gây một số bệnh cho người như ỉa chảy, viêm ruột, viêm đường tiết niệu. +Pseudomonas aeruginosa: là trực trùng mủ xanh, thường gây nhiễm trùng, lở loét, khó điều trị đối với các vết thương. Ngoài ra còn có thể gây sốt, mụn nhọt, ỉa chảy và viêm thận. - Hai vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. + Bacillus subtilis: Sống dai, ít gây bệnh. + Staphylococcus aureus: là khuẩn tụ cầu gây bệnh ở người chủ yếu là các bệnh ngoài da, nhiễm khuẩn huyết xảy ra khi cơ thể suy yếu. Khi bị nhiễm độc tụ cầu này người ta thường bị nôn mửa, ỉa chảy, giảm nhiệt độ cơ thể, choáng. - Một chủng nấm men: Candida albicans. Candida albicans là loại nấm men thường mọc ở biểu mô miệng, gây bệnh tia lưỡi ở trẻ em hay còn gọi là đẹn sữa. Ngoài ra nó còn có thể sống ở âm đạo gây bệnh nấm và khí hư cho phụ nữ. Bước 2 Các mẫu có hoạt tính (+) ở trên bước 1 được tiến hành thử tiếp bước 2 để tính ra nồng độ ức chế IC50 theo phương pháp Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) tiến hành trên phiếm vi lượng 96 giếng. 2.3.5.2. Thử hoạt tính chống oxi hóa: Phương pháp đưa chất thử với enzym peroxydaza máu người. Peroxydaza là một nhóm các enzym oxy hóa khử, có mặt nhiều trong bạch cầu hạt của máu, nó có vai trò xúc tác cho phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ khi có hydro peroxit hay các peoxit khác. Phản ứng này xảy ra trong cơ thể làm sinh ra các gốc tự do nội sinh có hại cho cơ thể, gây đột biến vật liệu di truyền. Từ đó nó gây ra rất nhiều bệnh khác nhau. Đồng thời so sánh với curcumin là chất có hoạt tính oxi hóa rất tốt. Các thí nghiệm này được tiến hành tại viện thử hoạt tính sinh học ở Viện Hóa Học, Viện KH&CN Việt Nam. 2.3.6. Một số đặc trưng vật lý của các chất phân lập được 2.3.6.1. Hợp chất T1 - Trạng thái: rắn, hình kim, màu vàng da cam. - Dung môi hòa tan: n-hexan, etyl axetat... - Nhiệt độ nóng chảy: 196-1970C * Các dữ kiện phổ của chất T1: - Phổ IR xem phụ lục 1.1 - Phổ 1H-NMR xem phụ lục 1.2. - Phổ 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC xem phụ lục 1.3, 1.4; 1.5; 1.6. - Phổ MS xem phụ lục 1.7. 2.3.6.2 Hợp chất T2 - Trạng thái: rắn, hình kim,vàng tươi. - Dung môi hòa tan: n-hexan, etyl axetat. - Nhiệt độ nóng chảy: 208,2 - 2090C. * Các dữ liệu phổ của hợp chất T2: - Phổ IR xem phụ lục 2.1 - Phổ 1H-NMR xem phụ lục 2.2 - Phổ MS xem phụ lục 2.3. 2.3.6.3. Hợp chất T3 - Trạng thái: rắn, dạng bông, vàng da cam. - Dung môi hòa tan: n-hexan, etyl axetat, clorofom. - Nhiệt độ nóng chảy: 159,9 - 160,80C. * Các dữ kiện phổ của chất T3: - Phổ IR xem phụ lục 3.1 - Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC xem phụ lục 3.2; 3.3; 3.4; 3.5. - Phổ MS xem phụ lục 3.6 2.3.6.4. Hợp chất T4 - Trạng thái: rắn, hình kim, màu trắng - Dung môi hòa tan: etyl axetat, clorofom. * Các dữ kiện phổ của chất T4: - Phổ 1H-NMR xem phụ lục 4.1 - Phổ MS xem phụ lục 4.2 2.3.6.5. Hợp chất T5 - Trạng thái: rắn, hình kim, màu trắng. - Dung môi hòa tan: butanol, etyl axetat, clorofom, axeton. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cây đại hoàng mà chúng tôi thực nghiệm được cung cấp vào khoảng tháng 7 năm 2006 và xác định sơ bộ tên khoa học của cây đại hoàng là Rheum officinale Baill. bởi tiến sĩ Lê Thị Thu Nhạn - Viện Y học Cổ truyền Trung ương. Rễ cây đại hoàng khô được dùng để nghiên cứu thành phần hóa học theo phương pháp chiết tách, chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng (như mô tả ở chương II). Hình 3.1: Cây Đại Hoàng Dược Dụng (Rheum officinale Baill.) 3.1. KHẢO SÁT ĐỊNH TÍNH CÁC LỚP CHẤT CÓ TRONG CÂY ĐẠI HOÀNG Lấy 0,01 g cặn chiết tổng cho mỗi lần thử. Tiến hành thực nghiệm như ở chương 2. Kết quả thu được như ở bảng sau: Bảng 3.1: Kết quả khảo sát định tính các lớp chất trong rễ cây đại hoàng STT Nhóm chất Thuốc thử Kết quả 1 Sterol Lieberman-Buchardat + 2 Ankaloit Dragendorf + 3 Flavonoit Mg, HCl đặc + 4 Cumarin NaOH, HCl + 5 Sponin Tạo bọt - 6 Tanin FeCl3 + 7 Glucozit trợ tim Legal Keller-Killani + Ghi chú: Dương tính (+) Âm tính (-). Nhận xét: Kết quả định tính cho thấy trong dịch chiết của cây đại hoàng có Sterol, Ankaloit, Flavonoit, Cumarin, Tanin, Glucozit trợ tim và không có Saponin. 3.2. PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT TỪ RỄ CÂY ĐẠI HOÀNG 3.2.1. Phân lập và nhận dạng các hợp chất từ kết tủa A Chúng tôi phân lập các hợp chất từ kết tủa A theo sơ đồ 2 và 3 ở chương 2 thu được chất T1, T2, T3 và T4. Các hợp chất được nhận dạng như sau: 3.2.1.1. Nhận dạng hợp chất T1 a. Hợp chất T1 có những đặc trưng vật lý sau: Ký hiệu chất Dạng kết tinh màu sắc Rf(9: 1) Tn/c(0C) T1 Rắn, hình kim,vàng da cam 0.88 196-197 b. Các đặc trưng phổ của T1 Phổ FT-IR (xem phụ lục 1.1) + Ở vùng trên 3000 cm-1có vân hấp thụ ở 3436 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm -OH. Chúng tôi nhận thấy vân tù chứng tỏ nhóm OH chịu liên kết với nước hoặc với O bên cạnh. Vân cực đại hấp thụ ở 3058 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm C-H thơm. + Ở vùng 3000 cm-1 - 1500 cm-1: Vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm CH3 no là 2936 cm-1; υ = 1678 cm-1 ở mức trung bình đặc trưng cho dao độnghóaá trị của nhóm C = O của quinon ; υ = 1624 cm-1, mạnh và 1566 cm-1 là đặc trưng cho vân dao động hóa trị của nhân thơm. + Ở vùng 1500 cm-1 - 700 cm-1 ; υ = 1453 cm-1, 1368 cm-1, trung bình đặc trưng cho vân dao động biến dạng của CH3. Vân hấp thụ ở 1266 cm-1 mạnh đặc trưng vân cho dao động biến dạng nhóm OH. Phổ 1H-NMR. Hợp chất T1 có cấu trúc như sau: (Đánh số trong vòng ngưng tụ, chúng tôi dựa theo tài liệu [9] và để tiện cho việc phân tích phổ chúng tôi đánh số như trên) Phổ 1H-NMR của T1 được trình bày ở phụ lục 1.2. Bảng 3.2: Các số liệu phổ 1H-NMR của chất T1 Vị trí Hiđrô Nhóm Giá trị δ (ppm), độ bội, J (Hz) Chất T1 Chrysophanol [15] Chrysophanol [8] 11 OH 12.12(1H,s) 12.14 (1H,s) 12.10 (1H,s) 13 OH 12.01 (1H,s) 12.031 (1H,s) 11.99 (1H,s) 12 CH3 2.47 (3H,s) 2.47 (3H,s) 2.49 (3H,s) 2 CH 7.10 (1H,s) 7.1 (1H,s) 6.87 (1H,s) 4 CH 7.68 (1H,s) 7.66 (1H,s) 7.65 (1H,s) 5 CH 7.82-7.83 (1H, dd, J5,7= 1.5; J5,6= 7.5) 7.83 (1H,d) 7.80 (1H,s) 6 CH 7.65-7.67(1H,m) 7.68 (1H,m) 7.46 (1H,s) 7 CH 7.28-7.30 (1H,dd,J5,7 = 1.5; J6,7= 8.5) 7.30 (1H,d) 7.06 (1H,d) Trên phổ 1H-NMR, chúng tôi nhận thấy có 10 H và các hidro được phân chia thành 8 nhóm tín hiệu: + Pic có độ dịch chuyểnhóaá học là δ = 2.47 ppm (3H, s) là tín hiệu cộng hưởng của CH3. + 2 pic của 2 nhóm OH là vân có δ = 12.12 ppm (1H, s) là tín hiệu cộng hưởng của OH ở vị trí số 1 và pic có δ = 12.01 ppm (1H, s) là tín hiệu cộng hưởng của OH ở vị trí số 8. + 5 tín hiệu của proton thơm có độ dịch chuyển hóa học trong cùng 7-9 ppm. Trong đó có 1 pic 7.69 ppm (1H,s) đặc trưng cho tín hiệu cộng hưởng của H ở vị trí số 4, tín hiệu cộng hưởng của CH ở vị trí số 5 chịu sự tương tác spin - spin của H6 và H7 là vân kép có sự dịch chuyển hóa học là: 7.83 - 7.82 ppm (1H, dd,J5,7 = 1.5 Hz;J5,6= 7.5 Hz); tín hiệu cộng hưởng của H6 có độ dịch chuyển hóa học là 7.67 - 7.65 ppm (1H, m); tín hiệu cộng hưởng của H7 chịu sự tương tác của H6 và H5 có độ dịch chuyển hóa học là 7.30 - 7.28 ppm (1H, dd,J5,7= 1.5 Hz,J6,7= 8.5 Hz). H2 có độ dịch chuyển hóa học là 7.11 - 7.10 ppm (1H, s). Nhận xét: Phổ 1H-NMR của T1 phù hợp với phổ 1H-NMR của chrysophanol. * Phổ 13C-NMR của T1 (phụ lục 1.3) Bảng 3.3: Các số liệu phổ 13C-NMR của chất T1 Vị trí Cacbon Nhóm Giá trị δ (ppm), độ bội Chất T1 Chrysophanol [8] 10 C=O 182.04 181.80 8a C 115.94 115.90 9 C=O 192.61 192.50 9a C 113.80 113.70 3 C 149.37 149.20 4 CH 121.39 121.80 5 CH 119.96 119.80 6 C 136.92 136.80 12 CH3 22.28 22.20 10a C 133.32 133.30 4a C 133.72 133.60 1 C-OH 162.48 162.40 8 C-OH 162.78 162.70 2 CH 124.39 124.30 7 CH 124.59 124.50 Trên phổ và bảng 2.2 chúng tôi thấy phân tử T1 có 15 Cacbon. Căn cứ trên độ chuyển dịch hóa học chúng tôi thấy có 1 nhóm CH3 có độ dịch chuyển hóa học δ = 22.28 ppm. Hai nhóm C=O của vòng quinon có độ dịch chuyển hóa học là δ = 192.61 ppm và δ = 182.04 ppm. Còn lại là 12 là cacbon của nhân thơm. Nhận xét: Phổ 13C-NMR của T1 phù hợp với phổ 13C-NMR của chrysophanol. Phổ DEPT-135 và DEPT-90.(phụ lục 1.4) Nhìn trên phổ DEPT-90 chúng tôi thấy phân tử có 1 nhóm CH3 và 5 nhóm CH. Nhìn trên phổ DEPT-135 chúng tôi thấy phân tử không có CH2, và có 9 cacbon bậc 4. Kết quả DEPT-90 và DEPT-135 phù hợp phân tích phổ 13C-NMR và 1H-NMR Nhận xét: Các kết quả trên đều cho thấy sự phù hợp giữa T1 và chrysophanol. Phổ HSQC (phụ lục 1.5) Phổ HSQC thể hiện các tương tác giữa cacbon và hiđrô liên kết trực tiếp với nó. Các số liệu trình bày trên bảng 2.3: Bảng 3.4: Số liệu của phổ HSQC của chất T1 Vị trí Cacbon C (d, ppm) H (d, ppm) 12 (CH3) 22.28 2.47 5 (CH) 119.96 7.83 6 (CH) 121.39 7.67 2 (CH) 124.39 7.10-7.11 7 (CH) 124.59 7.28-7.30 4 (CH) 136.98 7.69 Phổ HMBC (phụ lục 1.6) Phổ HMBC là phổ 2 chiều thể hiện sự tương tác gián tiếp giữa C và H cách nhau nhiều nhất là 4 liên kết. Trên phổ HMBC chúng tôi thấy rõ sự phù hợp của tín hiệu phổ qui kết: + Tương tác của H (CH3) với δ = 2.47 ppm (3H,s) với C4 (δ= 121.39 ppm), C3 (δ = 149.37 ppm), C2 (d= 124.392 ppm). + Nhóm C=O ở vị trí số 9 có độ dịch chuyểnhóaá học là δ = 192.61 ppm không tương tác với bất kì Hiđrô nào. + Tương tác của C=O ở vị trí số 10 có độ dịch chuyểnhóaá học là δ = 182.04 ppm với H4 (d= 7.69 ppm); H5(d= 7.28-7.30 ppm). Nhận xét: Kết quả phổ 2 chiều phù hợp với kết quả phân tích của 1H-NMR và 13C-NMR. Phổ MS: Trên phổ MS cho pic ion phân tử [M+H]+ với số khối m/z = 255, như vậy MT1 = 254 phù hợp với công thức phân tử của hợp chất là C15H10O4. Kết luận: Qua phân tích phổ chúng tôi có thể kết luận hợp chất T1 là chrysophanol. 3.2.1.2. Nhận dạng hợp chất T2 a.Hợp chất T2 có những đặc trưng vật lý sau: Ký hiệu chất Dạng kết tinh màu sắc Rf(9: 1) Tn/c(oC) T2 Rắn, hình kim, vàng tươ