Luận văn Đánh giá đặc tính thành thành phần tinh dầu một số loài Bạch đàn (Eucalyptus) trồng ở Việt Nam và mối liên hệ của nó với một số vấn đề sinh thái môi trường điển hình

của máy sắc ký khí - Cơ chế phát hiện các chất của detectơ FID Ngọn lửa trong detectơ được tạo ra bởi hỗn hợp của khí hyđrô và oxy. Khi chưa có chất phân tích đi vào detectơ thì thành phần trong ngọn lửa của detectơ chỉ có hyđrô, oxy và khí mang. Khi đó ngọn lửa tạo ra rất ít các electron. Dưới tác dụng của một điện trường các electron này được chuyển động về các điện cực trái dấu và sinh ra một dòng điện có cường độ rất nhỏ khoảng 10-12A gọi là dòng điện nền. Khi có chất phân tích đi vào detectơ (các hydrocacbon) chúng sẽ bị năng lượng nhiệt của ngọn lửa bẻ gẫy mạch tạo thành các nhóm CH*, các nhóm CH* này sẽ bị oxy hóa bởi oxy có trong ngọn lửa tạo thành các gốc CHO+ và e-. Khi đó cường độ dòng điện sẽ tăng đột biến và chúng được khuếch đại, ghi lại dưới dạng các đỉnh pic. Mỗi pic đó là một chất. Ví dụ cơ chế phát hiện benzen khi phân tích của detector FID như sau: C6H6 → 6CH* 6CH* + 3O2 → 6CHO+ + 6e- Khi đó số lượng các điện tử tăng lên đột biến làm cường độ dòng điện nền tăng lên đột biến và được ghi lại dưới dạng đỉnh pic ứng với một thời gian lưu nhất định. 1.4.2.2. Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detecơ khối phổ Phổ khối lượng - MS (mass spectrometry) là phương pháp được sử dụng rộng rãi hiện nay trong nghiên cứu hóa học, môi trường, sinh học, độc học và rất nhiều ngành khoa học khác nhau,... Nguyên tắc chung của phương pháp là khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có năng lượng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra một hay 2 electron và nó trở thành các ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2 ABC + e → ABC+* + 2e (1) ABC + e → ABC+2 + 3e (2) Loại ion (1) được gọi là ion gốc hay ion phân tử. Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các gốc hoặc các phân tử trung hòa khác nhau, quá trình này được gọi là quá trình phân mảnh (fragmentation) ABC+* → A+ + BC* ABC+* → AB+ + C* AB+ → A+ + B Năng lượng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30-100 eV, cao hơn năng lượng ion hóa phân tử (8-15 eV). Quá trình biến các phân tử trung hòa thành các ion gọi là sự ion hóa. Các ion có khối lượng m và điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng [5]. Việc so sánh phổ khối lượng của chất nghiên cứu với thư viện phổ được lưu giữ trong máy tính sẽ xác định được công thức cấu tạo của chất. Như vậy với kỹ thuật phân tích GC/MS khi các chất trong hỗn hợp được tách ra khỏi nhau sau khi lần lượt đi ra khỏi cột sắc ký khí chúng đi vào hệ thống khối phổ. Khí mang sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và đi vào vùng chân không để được hút ra ngoài. Chất nghiên cứu sẽ được bắn phá để tạo thành các mảnh ion có số khối khác nhau sau đó sẽ thu được phổ khối lượng của từng chất, từ đó qua thư viện phổ sẽ xác định được công thức cấu tạo của chất. 1.5. Phương pháp đánh giá hoạt chất sinh học của chất Phổ hoạt tính sinh học của chất (Biological activity spectra – BAS) mô tả sự sự phức hợp của các hiệu ứng dược lý, sinh lý học và cơ chế hóa sinh của các tác động đặc biệt (đột biến, sinh ung thư, quái thai) có thể biểu lộ trong các tương tác với hệ sinh thái của chất. BAS mô tả thuộc tính bên trong của chất phụ thuộc vào cấu trúc đặc biệt của nó. Một chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau. Một số hoạt tính có thể được tìm thấy trong nghiên cứu lý thuyết, một số hoạt tính được phát hiện ra trong các thử nghiệm lâm sàng, một số hoạt tính được phát hiện trong nhiều năm kể từ khi chúng được sử dụng làm thuốc. Ví dụ như Fluorouracil có 10 hoạt tính được lần lượt khám phá ra kể từ năm 1962 đến 1997 được mô tả ở Bảng 4 [15]. Hoạt tính sinh học là kết quả của sự tương tác giữa hợp chất hóa học với thực thể sinh học. Trong nghiên cứu lâm sàng, thực thể sinh học là con người, trong nghiên cứu tiền lâm sàng nó được thử nghiệm trên cơ thể sống là động vật (in vivo) hoặc thử nghiệm trong ống nghiệm (in vitro). Hoạt tính sinh học phụ thuộc vào những nét đặc trưng của hợp chất (về cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý), thực thể sinh học (loài, tuổi, giới tính, ...) và cách tiến hành nghiên cứu (liều lượng, con đường nghiên cứu,..). Bảng 4. Hoạt tính sinh học của Fluorouracil [15] STT Hoạt tính Năm tìm ra Chống ung thư 1962 Độc phôi 1966 Kháng vi rút 1971 Ức chế tổng hợp Thimidine Tiriphosphate 1971 Ức chế chuyển hóa RNA 1980 Ức chế tổng hợp protein 1987 Điều chỉnh chất chuyển hóa Lipit 1990 Ức chế miễn dịch 1990 Ức chế chất chuyển hóa 1991 Kháng vi rút 1996 Nhiều chất có phổ hoạt tính sinh học rộng với nhiều hiệu ứng khác nhau. Một số hiệu ứng được sử dụng trong điều trị bệnh nhưng cũng có một số hiệu ứng có gây độc. Tổ hợp tất cả các hiệu ứng sinh học của chất gây ra đối với các thực thể sinh học được gọi là phổ hoạt tính sinh học của chất . Phổ hoạt tính sinh học có 4535 hoạt tính sinh học bao gồm các hiệu ứng dược lý cơ bản, cơ chế tác động và các độc tính đặc trưng. Như vậy để xác định chính xác được hoạt tính sinh học của một chất thì nghiên cứu cuối cùng phải tiến hành đưa chất đó vào thử nghiệm. Tuy nhiên một chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau và có những hoạt tính mà nó chưa có điều kiện được bộc lộ, do vậy các nhà nghiên cứu hóa sinh sẽ gặp rất nhiều khó khăn để tìm ra các hoạt tính bằng con đường thử nghiệm lâm sàng. Vì vậy nếu bằng tính toán mà có thể dự đoán được hoạt tính sinh học của chất thì nó là cơ sở lý thuyết rất quan trọng và giảm bớt được rất nhiều công sức cho các nhà nghiên cứu hóa sinh khi đưa vào thử nghiệm lâm sàng trên sinh vật. Để dự đoán phổ hoạt tính sinh học của chất (BAS) hiện nay người ta sử dụng phầm mền tính toán PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity=f(Structure)). Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất mới có thể xác định được nếu như chất mới có tác dụng đặc biệt. Chương 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là: - Đánh giá được đặc tính thành phần hóa học tinh dầu trong lá một số loài Bạch đàn trồng ở Miền Bắc Việt Nam; - Bước đầu xác định, đánh giá mối liên hệ của thành phần chất trong tinh dầu Bạch đàn với một số vấn đề sinh thái môi trường. 2.2. Đối tượng và giới hạn nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận văn là tinh dầu trong lá của ba loài Bạch đàn: Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis); Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) và Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) được trồng tại miền Bắc Việt Nam. Mỗi một loài Bạch đàn nghiên cứu ở một cấp tuổi và tại một thời điểm nhất định trong năm. 2.3. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện được các mục tiêu trên đề tài tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: 1. Khảo sát các phương pháp tách chiết tinh dầu từ lá Bạch đàn; 2. Xác định và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chất chính có trong tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu; 3. Bước đầu đánh giá một số ảnh hưởng của tinh dầu Bạch đàn đến môi trường sinh thái. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu thập và kế thừa tài liệu Các tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu ở trong và ngoài nước được thu thập, chọn lọc và sử dụng để phân tích, đánh giá thực trạng trồng rừng Bạch đàn ở nước ta. Các nghiên cứu về thành phần và đặc tính tinh dầu Bạch đàn trên thế giới cũng được nghiên cứu sử dụng để so sánh, đánh giá cùng với kết quả nghiên cứu của đề tài. Trong nghiên cứu còn tham khảo các phương pháp phân tích tinh dầu bằng phương pháp phân tích Sắc ký khí và Sắc ký khí ghép nối khối phổ. 2.4.2. Phương pháp điều tra, lấy mẫu ngoài thực địa Căn cứ vào tài liệu thu thập được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát tại hai địa phương có trồng các loài Bạch đàn đó là thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ thành phố Hà Nội và tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang. Từ đó chọn ra các loài Bạch đàn đặc trưng để lấy mẫu về phòng thí nghiệm tách chiết tinh dầu và phân tích thành phần hóa học của nó. Trước khi lấy mẫu cần tiến hành khảo sát toàn bộ khu vực trồng rừng Bạch đàn. Công việc khảo sát bao gồm quan sát đánh giá một cách định tính sự đa dạng thành phần các loài cây dưới tán. Tại rừng thực nghiệm của trường Đại học Lâm nghiệp, loài Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) 20 năm tuổi và loài Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) 20 năm tuổi đã được lựa chọn để lấy mẫu nghiên cứu, Hình 2. Hình 2. Lấy mẫu lá tại rừng thực nghiệm tại Xuân Mai, Hà Nội Tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) đã được lựa chọn để lấy mẫu lá nghiên cứu. Mẫu lá của mỗi loài được lấy trên cùng một cây nhưng lấy ở ba tầng khác nhau gồm tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán dưới. Mẫu lá ở mỗi tầng này có số lượng bằng nhau và được tách riêng biệt, đựng trong túi nilon, mã hóa và bảo quản ở nhiệt độ tử 2 - 40C. Thời điểm tiến hành lấy mẫu nghiên cứu trong tháng 8 năm 2010. Ngoài mẫu lá đề tài còn tiến hành lấy thêm mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng để nghiên cứu đánh giá tìm hiểu về sự có mặt của các chất hóa học tương ứng với tinh dầu mẫu lá của nó. Mẫu rễ được lấy trên cùng một cây lấy mẫu lá và cũng được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 40C trước khi phân tích. 2.4.3. Phương pháp tách chiết và phân tích tinh dầu 2.4.3.1. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu - Hoá chất + Diclometan, Merck (CHLB Đức); + Nước cất 2 lần; + Na2SO4 khan. - Thiết bị, dụng cụ + Máy sắc ký khí Master GC sử dụng detectơ FID, Italya; + Máy sắc ký khí Hewlet Parkard 6890 sử dụng detector MS, Mỹ; + Xylanh bơm mẫu dung tích 10 µl, 20 µl; + Thiết bị chiết dòng ngưng liên tục; + Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước; + Cân phân tích có sai số d = 0,1 mg; + Bếp ổn nhiệt, nhiệt độ max 3000 C; + Nhiệt kế có nhiệt độ tối đa 3000 C của Nga; + Micro pipet 20 μl; 100 μl; 1000 μl; + Đá bọt; + Lọ đựng mẫu 2 ml. 2.4.3.2. Tách chiết tinh dầu Bạch đàn - Chuẩn bị dụng cụ Dụng cụ dùng cho chuẩn bị mẫu xác định các chất ở lượng vết, máy sắc ký có độ nhạy cao 10-11- 10-12g nên để tránh nhiễu kết quả thì khâu chuẩn bị dụng cụ có ý nghĩa rất quan trọng. Tất cả các dụng cụ thủy tinh được làm sạch theo các bước sau: + Rửa sạch bằng xà phòng; + Tráng nhiều lần bằng nước thường; + Tráng 3 lần bằng nước cất 2 lần; + Tráng 3 lần bằng dung môi CH2Cl2; + Sấy toàn bộ dụng cụ trong tủ sấy ở nhiệt độ 2000C trong 2 giờ; Tất cả các dụng cụ trước khi sử dụng phải được tráng lại nhiều lần bằng bằng dung môi CH2Cl2 hoặc n – hexan. - Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu lá dùng để phân tích là mẫu tổ hợp của ba loại mẫu lấy ở tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán trộn lại với nhau theo cùng một tỷ lệ. Trước khi phân tích mẫu lá và rễ được rửa bằng nước lạnh rồi được bảo quản trong tủ lạnh sâu có nhiệt độ -180C. - Tách tinh dầu Đề tài sử dụng hai phương pháp cất lôi cuốn hơi nước và chiết dòng ngưng liên tục để tách chiết tinh dầu trong mẫu nghiên cứu. + Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước Phương pháp này cho phép chiết khá triệt để các chất có mặt trong các bộ phận của cây. Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước tốn ít thời gian, không gây độc đối với môi trường. Hệ thống cất lôi cuốn hơi nước (Hình 3) gồm hai bình nối tiếp nhau, bình trên đựng mẫu cần chiết, bình dưới đựng nước. Khi đun sôi nước ở nhiệt độ 2000C sẽ tạo ra một luồng hơi nước nóng có áp suất cao sục qua mẫu lá làm cuốn đi các thể tinh dầu đến ống sinh hàn. Tại đây hơi nước và tinh dầu được làm lạnh rồi ngưng tụ vào phần thu mẫu tinh dầu. Quá trình phân lớp xảy ra tại đây. Tinh dầu có tỉ khối nhẹ hơn nước nên nổi lên phía trên còn nước chìm xuống phía dưới. Tách nước ta sẽ thu được phần tinh dầu của mẫu nghiên cứu. Hình 3. Thiết bị cất lôi cuốn hơi nước Trong suốt quá trình cất tinh dầu nhiệt độ của bếp đun được giữ ổn định ở 2000C, hơi nước đo được có nhiệt độ 980C. Đề tài tiến hành cất lôi cuốn trong các khoảng thời gian khác nhau cho các mẫu khác nhau để đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học trong tinh dầu theo thời gian cất, xác định tỉ khối và hàm lượng phần trăm của tinh dầu trong mẫu nghiên cứu. Khối lượng mẫu lá (lá tươi) cho một lần cất hơi nước là 200 g. Thời gian tiến hành cất lôi cuốn hơi nước cho mỗi loại mẫu (mẫu lá Bạch đàn trắng và mẫu lá Bạch đàn xanh) thực hiện trong 5 khoảng thời gian khác nhau, đó là: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ và 5 giờ kể từ lúc nước sôi. + Phương pháp cất dòng ngưng liên tục Hệ thống cất dòng ngưng liên tục được bố trí như hình 4. Sinh hàn Bình 1 Bình 2 Hình 4. Thiết bị cất dòng ngưng liên tục Hệ thống cất dòng ngưng gồm 2 bình cầu đặt song song cùng nối vào ống sinh hàn. Mẫu lá tổ hợp được cắt nhỏ có kích thước 1x3 cm, cân lấy 5 gam mẫu cho vào bình cầu đựng mẫu (bình 1) và mẫu được ngâm trong nước cất 2 lần đến khoảng 3/5 bình, bình cầu còn lại (bình 2) cho vào 7 ml dung môi điclometan. Cả hai bình cầu này được nối với cùng một ống sinh hàn. Khi đung nóng bình cầu với nhiệt độ của bếp là 1000C làm sôi nước trong bình cầu, bình cầu đựng điclometan được cấp nhiệt ở 600C. Hơi nước trong bình cầu đựng mẫu sẽ bay lên cuốn theo cả các phân tử tinh dầu cùng với dung môi điclometan cũng được bay lên và gặp nhau ở bề mặt sinh hàn. Tại đây quá trình chiết bắt đầu xảy ra, tinh dầu sẽ tự động hòa tan vào dung môi điclometan và tách ra khỏi nước. Cả tinh dầu, điclometan và nước được làm lạnh và ngưng lại phần thu. Điclometan nặng hơn nước lên chìm xuống dưới còn nước nổi lên trên. Phần nước sẽ quay ngược lại bình cầu đựng mẫu còn phần điclometan chứa tinh dầu sẽ quay lại bình cầu đựng đựng điclometan. Quá trình cứ thế diễn ra trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào từng nghiên cứu. Mỗi một loài Bạch đàn cũng tiến hành nghiên cứu cất nhiều mẫu của cùng một loài trong các khoảng thời gian khác nhau như phương pháp lôi cuốn hơi nước để khảo sát đánh giá khả năng tách chiết của phương pháp theo thời gian. Đối với mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng đề tài lựa chọn phương pháp cất dòng ngưng liên tục để nghiên cứu. Khối lượng của mẫu rễ trong mỗi lần chiết là 10 gam, tiến hành chiết liên tục 3 mẫu rồi gộp toàn bộ 3 phần dung thu được thành một mẫu, đem đi làm giầu xuống còn 1,0 ml. Mẫu này được dùng để phân tích trên GC/FID và GC/MS. Tất cả các mẫu thu được trước khi phân tích trên các hệ thống máy sắc ký đều được cho chạy qua cột Na2SO4 khan đã được sấy khô để loại nước. 2.4.3.4. Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn - Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật GC/FID Đây là phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi để xác định các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, bền nhiệt. Mẫu tinh dầu sau khi tách chiết được hòa tan vào trong dung môi n-hecxan để bơm vào hệ thống sắc ký GC-Master của Italia tại trường Đại học Lâm nghiệp. Phương pháp này sẽ phát hiện được số các hợp chất có trong tinh dầu ở mức hàm lượng rất nhỏ cỡ ppm đến ppb đồng thời sử dụng để khảo sát các chương trình phân tích mẫu trước khi phân tích trên hệ thống GC/MS Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký như sau: + Cột mao quản DN 17, nhiệt độ cao nhất 3500C, kích thước cột: 30m x 320µm x 0,25 µm (chiều dài x đường kính trong x bề dầy lớp hấp phụ); + Chương trình nhiệt độ của cột tách: nhiệt độ ban đầu 600C giữ trong 1 phút, nâng lên đến 900C với tốc độ gia nhiệt 30C/phút, nâng tiếp lên 1200C với tốc độ gia nhiệt 150C/phút, nâng tiếp lên 2000C với tốc độ gia nhiệt 50C/phút, giữ trong 10 phút; + Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C + Nhiệt độ của detectơ: 2500C + Khí mang: N2 (99,9999%) + Tốc độ dòng khí mang: 1,3 ml/phút + Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24 + Thể tích bơm mẫu: 1 µl - Phương pháp sắc ký khí với detertơ khối phổ Đây là phương pháp phân tích hiện đại hiện nay trong việc xác định các hợp chất hóa học hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ khác nhau sau khi được tách ra khỏi nhau bằng kỹ thuật sắc ký sẽ được đưa vào hệ thống khối phổ để xác định khối lượng các mảnh ion được bắn phá trong hệ thống ion hóa, trên cơ sở đó có thể xác định được tên và công thức cấu tạo của chất. Thư viện phổ sẽ giúp xác định công thức cấu tạo của hợp chất cần nghiên cứu. Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký khí khối phổ như sau: + Cột mao quản BD-5, 19091z - 413, nhiệt độ cao nhất 3550C , kích thước: chiều dài, đường kính trong, bề dầy lớp hấp phụ tương ứng là 30 m, 320 µm, 0,25 µm; + Chương trình nhiệt độ cột tách: : nhiệt độ ban đầu 600C giữ trong 1 phút, nâng lên đến 900C với tốc độ gia nhiệt 30C/phút, nâng tiếp lên 1200C với tốc độ gia nhiệt 150C/phút, nâng tiếp lên 2000C với tốc độ gia nhiệt 50C/phút, giữ trong 10 phút; + Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C; + Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24; + Thể tích bơm mẫu: 1 µl; + Sử dụng chế độ đo chọn lọc ion; + Ion hóa chất theo nguyên tắc va đập điện tử. 2.4.4. Phương pháp tin sinh học dự đoán hoạt tính sinh học của chất Việc sử dụng phần mềm Phổ dự đoán hoạt tính sinh học của chất - PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity = f(Structure). Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất cần nghiên cứu có thể xác định được. Trong cơ sở dữ liệu của PASS bao gồm khoảng 46000 hợp chất có hoạt tính sinh học, trong đó khoảng 16000 chất đã được sử dụng làm thuốc, 30000 chất đang được đề nghị cho kiểm tra lâm sàng hoặc tiền lâm sàng. Hình 2.4. Sơ đồ quá trình phát triển của PASS Chương trình tính toán PASS có thể dự đoán đồng thời 400 loại hoạt tính cùng một lúc với độ chính xác đạt 85% bằng cách dựa trên công thức cấu tạo của hợp chất. Trong cơ sở dữ liệu của PASS chứa tới 6825 loại hoạt tính sinh học bao gồm các hiệu ứng dược lý, cơ chế hóa sinh của các tác động, các độc tính cụ thể. Một vài hoạt tính có mặt trong cơ sở dữ liệu của PASS chỉ có ở một hoặc hai hợp chất và những hoạt tính này không nằm trong phổ dự đoán của PASS. Sau khi đưa thông tin về cấu trúc phân tử của hợp chất nghiên cứu hoạt tính sinh học vào chương trình tính toán của PASS, phần mềm tính sẽ so sánh cấu trúc của phân tử này với cấu trúc của các chất có trong cơ sở dữ liệu với các hoạt tính sinh học đã được mô tả để từ đó sẽ tự động tính toán đưa ra xác suất xuất hiện các hoạt tính sinh học khác nhau của chất nghiên cứu trên cơ sở phương pháp xác suất Bayesian. Sai số dự đoán cực đại (MEP - maximal error of prediction) được tính toán qua tất cả các chất có trong cơ sở dữ liệu với các hoạt tính của nó. MEP trung bình cỡ 0,137 và như vậy độ chính xác trung bình của dự đoán cỡ 0,863. Độ chính xác như vậy là đủ đảm bảo yêu cầu sử dụng chương trình tính toán PASS. Kết quả của phép dự đoán PASS còn tính ra xác suất có mặt (Pa) và xác suất không có mặt (Pi) một tính chất nào đó của chất, đồng thời còn chỉ ra cả số các chất có tính chất đó. Độ tin cậy của dự đoán khi Pa > 0,7 đồng thời số các chất có hoạt tính đó > 5 chất. Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thời gian chiết tối ưu và khối lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu Sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước để xác định khối lượng (tính trên mẫu lá tươi) và tỉ khối của tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu. Đối với mỗi loài Bạch đàn đề tài đã khảo sát hiệu quả của phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian. Kết quả nghiên cứu được nêu trong các Bảng 5, Bảng 6 và Bảng 7. Đối với loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) trồng tại Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, thành phố Hà Nội được thu hái vào ngày 2 tháng 8 năm 2010, kết quả nghiên cứu được mô tả trong Bảng 5. Bảng 5. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian Mẫu Khối lượng mẫu lá (gam) Thời gian chiết (giờ) Khối lượng tinh dầu (gam) Thể tích tinh dầu (ml) Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%) Tỉ khối (g/ml) EC-LC01 200 1 0,7826 0,95 0,3913 0,8238 EC-LC02 200 2 0,8240 0,96 0,4120 0,8583 EC-LC03 200 3 1,0020 1,17 0,5010 0,8546 EC-LC04 200 4 1,0632 1,24 0,5316 0,8610 EC-LC05 200 5 1,0630 1,24 0,5315 0,8609 Qua bảng số liệu trên nhận thấy với thời gian chiết là 4 giờ thì tỷ lệ % về khối lượng của tinh dầu trên khối lượng lá tươi đạt giá trị cực đạt là 0,5316%, tỉ khối của tinh dầu đạt cực đại ở thời gian này, điều đó chứng tỏ rằng những cấu tử nhẹ sẽ được lôi cuốn đi trước mặc dù sự thay đổi này là không đáng kể. Đối với loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) trồng tại xã Trường Sơn, huyện Lục Lam, tỉnh Bắc Giang được thu hái vào ngày 10 tháng 8 năm 2010, kết quả nghiên cứu được mô tả trong Bảng 6. Bảng 6. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn chanh thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian Mẫu Khối ượng mẫu (gam) Thời gian chiết (giờ) Khối lượng tinh dầu (gam) Thể tích tinh dầu (ml) Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%) Tỉ khối (g/ml) ECI-LC01 200 1 2,0200 2,67 1,01 0,7501 ECI-LC02 200 2 2,2000 2,93 1,10 0,7508 ECI-LC03 200 3 2,3800 3,17 1,19 0,7510 ECI-LC04 200 4 2,6000 3,34 1,33 0,7670 ECI-LC05 200 5 2,6000 3,34 1,33 0,7670 Từ bảng số liệu trên cho thấy thời gian chưng cất tối ưu là 4 giờ sẽ thu được khối lượng tinh dầu lớn nhất. Tỉ lệ tinh dầu thu được sau thời gian này là 1,33 % tính trên mẫu lá tươi. Tỉ khối thay đổi không nhiều, từ 0,7501 g/ml đến 0,7670 g/ml và nhẹ hơn tinh dầu của loài Bạch đàn trắng. Đối với loài Bạch đàn xanh (E. globulus) trồng tại Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, thành phố Hà Nội được thu hái vào ngày 20 tháng 08 năm 2010, kết quả nghiên cứu được nêu trong Bảng 7. Từ số liệu này cho thấy cũng giống như loài E. camaldulensis, loài E. globulus sau khi cất lôi cuốn 4 giờ thu được khối lượng tinh dầu cực đại từ mẫu nghiên cứu, đạt 0,3250 % tính trên mẫu lá tươi. Tỉ khối của mẫu tinh dầu thu được dao động từ 0,7508 g/ml đến 0,7784 g/ml. Bảng 7. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn xanh thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian Mẫu Khối lượng mẫu (gam) Thời gian chiết (giờ) Khối lượng tinh dầu (gam) Thể tích tinh dầu (ml) Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%) Tỉ khối (g/ml) EG-LC01 200 1 0,5050 0,6675 0,2525 0,7508 EG-LC02 200 2 0,5500 0,7325 0,2750 0,7509 EG-LC03 200 3 0,5950 0,7925 0,2975 0,7566 EG-LC04 200 4 0,6500 0,8350 0,3250 0,7784 EG-LC05 200 5 0,6500 0,8350 0,3250 0,7784 Qua kết quả khảo sát khối lượng tinh dầu thu được trong các khoảng thời gian chưng cất khác nhau đã xác định được khối lượng tinh dầu đạt cực đại của hai loài Bạch đàn cùng với tỷ trọng của nó khi cất lôi cuốn bằng hơi nước ở 980C trong 4 giờ được mô tả ở Bảng 8, trong đó tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu tính trên mẫu lá tươi. Bảng 8. Phần trăm khối lượng và tỉ khối của tinh dầu trong lá các loài Bạch đàn nghiên cứu Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) Bạch đàn xanh (E. globulus) Bạch đàn chanh (E. citriodora) Phần trăm khối lượng (%) Tỉ khối (g/ml) Phần trăm khối lượng (%) Tỉ khối (g/ml) Phần trăm khối lượng (%) Tỉ khối (g/ml) 0,5010 0,8610 0,3250 0,7784 1,33 0,7670 Hình 5. Mầu của tinh dầu các loài Bạch đàn thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước Mầu của tinh dầu Bạch đàn khá khác nhau (Hình 5). So sánh tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu của ba loài Bạch đàn nghiên cứu tính trên khối lượng mẫu lá tươi thì loài Bạch đàn chanh (E. citriodora) có khối lượng tinh dầu là lớn nhất đạt 1,33%, tiếp đến là loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) đạt 0,5316 % và thấp nhất là loài Bạch đàn xanh (E. globulus) đạt 0,3250 %. Về tỉ khối tinh dầu của loài Bạch đàn trắng có tỉ khối nặng nhất là 0,8610 g/ml, tiếp đó đến tinh dầu loài Bạch đàn xanh đạt 0,7784 g/ml và thấp nhất là tinh dầu của loài Bạch đàn chanh, đạt 0,7670 g/ml. Tỉ lệ khối lượng tinh dầu loài Bạch đàn trắng là 0,51 %, cao hơn so với nghiên cứu công bố của Lã Đình Mỡi (0,14 đến 0,28 %), còn loài Bạch đàn chanh trong nghiên cứu này là 1,33 %, thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng (1,8 đến 2,0 %). Nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy tỉ lệ khối lượng của tinh dầu Bạch đàn chanh từ 0,5 % đến 2,0 %, còn với loài Bạch đàn xanh tinh dầu chiếm từ 1,0 đến 2,9 %. Trong nghiên cứu này cho tỉ lệ khối lượng tinh dầu Bạch đàn xanh chỉ có 0,35 %. Sự khác biệt về tỉ lệ khối lượng tinh dầu như đã nói trên do ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như nguồn giống, phương pháp trồng và chăm sóc, thời điểm thu hái và điều kiện thổ nhưỡng. 3.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạch đàn 3.2.1. Thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn trắng Sản phẩm tinh dầu Bạch đàn thu được bằng hai phương pháp cất dòng ngưng liên tục và cất lôi cuốn hơi nước đều được sử dụng để phân tí