Luận văn Đánh giá độc tính của sodium benzoate, propyl gallate, tartrazine, amaranth, monosodium glutamate và formaldehyde trên mô hình phát triển phôi cá ngựa vằn

i rồi được được rửa nhiều lần bằng môi trường E3 để loại bỏ các chất bẩn cùng những phôi không được thụ tinh. Việc ghép cá thường được thực hiện với ít nhất 3 bể và chỉ phôi ở những bể có tỉ lệ thụ tinh trên 90% mới được sử dụng cho thí nghiệm. 2.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất Thí nghiệm của chúng tôi được xây dựng dựa theo hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất trên phôi cá ngựa vằn của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (OECD 236 công bố ngày 26/7/2013) và hướng dẫn đánh giá chất lượng nước thải theo ISO 15088:2007. Theo đó, việc phơi nhiễm phôi nên được thực hiện sớm nhất có thể và muộn nhất là không quá 3 giờ sau thụ tinh (giai đoạn 128 tế bào) [62]. 23 Sau khi được rửa sạch, phôi thụ tinh giai đoạn 4 đến 32 tế bào được chuyển vào đĩa 6 giếng đã có sẵn hóa chất thí nghiệm (trên 25 phôi/một nồng độ/giếng). Những phôi khỏe mạnh, phát triển bình thường sẽ được chọn dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại tối thiểu là 20x. Giai đoạn phân cắt từ 4 tế bào trở đi, phôi chất lượng tốt có thể dễ dàng phân biệt với phôi không thụ tinh hoặc bất thường dựa vào sự trong suốt, đĩa phôi được phân cắt đồng đều, đối xứng, màng phôi và khối noãn hoàng nguyên vẹn. Những phôi tốt được chuyển ngẫu nhiên mỗi phôi vào một giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng đã có sẵn 1ml hóa chất ở mỗi giếng theo sơ đồ bố trí nồng độ thí nghiệm như Hình Error! No text of specified style in document..5. Hóa chất thí nghiệm được pha theo một dải từ sáu đến tám nồng độ sử dụng môi trường E3. Dải này thu được sau nhiều thí nghiệm kiểm tra giới hạn tác động (limit test) với mục đích tìm ra khoảng nhỏ nhất có chứa nồng độ gây chết toàn bộ phôi và nồng độ không quan sát thấy ảnh hưởng sau khi kết thúc thí nghiệm. Mỗi nồng độ được tra vào 20 giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng, 4 giếng còn lại là đối chứng nội là dung môi hòa tan các chất thử (trong thí nghiệm này là môi trường E3) (Hình Error! No text of specified style in document..5). Hình Error! No text of specified style in document..5. Phân bố nồng độ trên đĩa 24 giếng T: các giếng có cùng nồng độ hóa chất thí nghiệm, C: đối chứng Cứ sau 24 giờ, mỗi giếng trong các đĩa thí nghiệm lại được thay khoảng 700µl/giếng bằng dung dịch mới có nồng độ hóa chất tương ứng. Quy trình được 24 tiến hành tương tự với đĩa đối chứng (môi trường E3) để so sánh đối chiếu. Toàn bộ thí nghiệm được giữ ở nhiệt độ 260C ± 10C. Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. 2.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phôi dựa trên hình thái và sức sống Tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi sẽ quan sát phôi dưới kính hiển vi soi nổi và đánh giá theo các tiêu chí như Bảng Error! No text of specified style in document..4. Việc đánh giá hình thái phôi sẽ dựa vào các đặc điểm phôi cá ngựa vằn theo mô tả của Kimmel và cộng sự (Hình Error! No text of specified style in document..6) [40]. Kết quả của thí nghiệm chỉ được chấp nhận khi tỷ lệ phôi còn sống của đối chứng ở thời điểm kết thúc thí nghiệm đạt trên 90%. Bảng Error! No text of specified style in document..4. Một số tiêu chí đánh giá sự phát triển phôi cá ngựa vằn Tiêu chí Miêu tả Thời gian (giờ sau thụ tinh) 24 48 72 96 Tiêu chí gây chết Đông tụ Phôi màu trắng đục và không nhận rõ cấu trúc x x x x Tim không đập Không quan sát thấy tim đập x x Tiêu chí dị dạng Cong vẹo trục cơ thể Trục cơ thể bị uốn cong ở một vài điểm Dị tật đuôi Đuôi ngắn hoặc cong so với bình thường x x Sắc tố Giảm sắc tố mắt và thân x x Phù màng bao tim Màng bao ngoài tim bị phù x x Phù túi noãn hoàng Màng bao noãn hoàng xuất hiện túi chứa dịch x x x 25 Noãn hoàng xù xì Bề mặt khối noãn hoàng xù xì x Phù đầu Hoại tử Phần đầu xuất hiện túi chứa dịch Đầu hoặc thân xuất hiện khối tế bào chết x x x x x Nghẽn mạch máu Chưa nở Xuất hiện các điểm máu tụ trên cơ thể Phôi còn sống nhưng chưa thoát khỏi lớp màng phôi x x x x Tiêu chí đánh giá trên được xây dựng dựa theo tiêu chí được mô tả bởi Nagel và cộng sự năm 2002 [54]. Hình Error! No text of specified style in document..6. Hình thái phôi cá ngựa vằn ở một số giai đoạn theo Kimmel [40] Nhiệt độ môi trường khi quan sát 28oC. Thanh kích thước chuẩn có độ dài 250 µm, 26 hpf: giờ sau thụ tinh; tb: tế bào 27 2.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa vằn Phôi cá ngựa vằn giai đoạn 4 đến 32 tế bào sẽ được phơi nhiễm với các nồng độ hóa chất và đối chứng E3 trên đĩa 6 giếng; 10 phôi mỗi nồng độ/giếng. Nhịp tim của ít nhất 5 trên 10 phôi này (chọn ngẫu nhiên) sẽ được ghi lại bằng máy quay phim dưới dạng các video có độ dài một phút và thí nghiệm sẽ được tiến hành hai lần. Số nhịp tim của phôi/ấu thể cá khi phơi nhiễm với hóa chất sẽ được đếm và so sánh thống kê với phôi/ấu thể đối chứng của chính lô thí nghiệm đó theo tỷ lệ phần trăm sử dụng phần mềm GraphPad Prism 6.07. 2.3.5. Phân tích thống kê Các phép tính toán cơ bản được tính bằng công cụ Microsoft Excel 2013. Phần mềm GraphPad Prism 6.07 thực hiện tất cả các phân tích thống kê bao gồm các phép hồi quy và các so sánh giữa các lô thí nghiệm với lô đối chứng. Kết quả của thí nghiệm về tỷ lệ phôi còn sống cũng như tỷ lệ phôi dị dạng sẽ xử lý hồi quy với dạng bốn tham số của phương trình Sigmoidal: Trong đó: Top và Bottom là giá trị cao nhất và thấp nhất của Y Y là tỷ lệ phôi chết/sống hoặc dị dạng X là log của nồng độ thí nghiệm XC50 có thể là giá trị LC50 hoặc EC50 HillSlope thể hiện độ dốc của đường cong Từ đó, phần mềm cho phép đưa ra biểu thức và đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ thí nghiệm và sự ảnh hưởng của hóa chất đối với sự phát triển phôi cá ngựa vằn đồng thời tính các chỉ số độc tính LC50 – nồng độ gây chết 50% phôi thí nghiệm và EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi hoặc ấu thể. Dựa trên kết quả thu được, chỉ số gây quái thai TI (Teratogenic index) sẽ được xác định bằng tỷ 28 số LC50/EC50. Một chất được cho là gây quái thai khi TI >1 và được cho là gây chết phôi khi TI < 1 [69]. Phương pháp Mann Whitney test được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa lô đối chứng và các nồng độ thí nghiệm về tỷ lệ phôi nở ở 72 giờ cũng như số nhịp tim/phút. Sự khác biệt được cho là có ý nghĩa khi p < 0,05. Chỉ số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất thí nghiệm cao nhất không có ảnh hưởng đáng kể đến phôi thí nghiệm và chỉ số LOEC (Lowest observed effect concentration) cho biết nồng độ thấp nhất tác động đáng kể đến phôi thí nghiệm theo các tiêu chí đã nêu ở trên được xác định bằng Dunnett’s test với độ tin cậy 95%. 29 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế ISO đã đưa ra các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất sử dụng phôi cá ngựa vằn (OECD 236 và ISO 15088:2007). Dựa vào đó, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng quy trình thí nghiệm áp dụng trong điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm và ứng dụng trong đánh giá độc tính của ba dung môi là ethanol, dimethyl sulfoxide và acetone [1]. Kết quả thu được có độ tương đồng cao với kết quả được đưa ra bởi OECD. Phương pháp sử dụng trong luận văn này giống với phương pháp trong nghiên cứu trên chứng tỏ kết quả đưa ra có thể được chấp nhận và có độ tin cậy cao. Để xác định dải nồng độ cho thí nghiệm đánh giá độc tính của các chất, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với nhiều nồng độ để tìm ra một khoảng nồng độ hẹp nhất mà vẫn đảm bảo giá trị dưới không gây bất kì ảnh hưởng nào đến phôi, ấu thể thí nghiệm và giá trị trên gây chết toàn bộ phôi sau khi thí nghiệm kết thúc (96 giờ sau thụ tinh). Dung dịch gốc của các chất thử nghiệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan từ dạng bột (với Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Tartrazine, Monosodium glutamate) và từ dạng dung dịch Formaldehyde 36% trong môi trường E3 sau đó cũng được pha loãng thành các dải nồng độ bằng môi trường E3. Ở một vài thử nghiệm đầu, hóa chất sẽ được đánh giá ở những dải nồng độ rộng rồi thu hẹp dần dựa trên kết quả thu được của thí nghiệm trước đó. Sự tác động của các hóa chất đến sinh vật thường tuân theo phương trình Sigmoidal với giá trị nồng độ biểu diễn theo thang logarit. Do đó, chúng tôi chia khoảng nồng độ đã xác định thành một dải gồm sáu đến tám nồng độ dựa theo một cấp số nhân với giá trị công bội tùy thuộc vào từng chất thí nghiệm. Cuối cùng, chúng tôi thu được các dải nồng độ đánh giá cho từng chất như Bảng 3.1. 30 Bảng Error! No text of specified style in document..5. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất Tên hóa chất Kí hiệu Độ tan trong 100 ml nước Đơn vị pha loãng Dải nồng độ thí nghiệm Sodium benzoate E211 62,87 g mg 25 45 80 145 260 350 500 650 Propyl gallate E310 350 mg mg 15 20 26 35 45 60 75 Amaranth E123 5 g g 0,1 0,2 0,5 1 2 4 8 Tartrazine E102 14 g g 0,25 0,5 1 2 4 8 16 Monosodium glutamate E621 10 g g 2 5 10 15 25 40 60 Formaldehyde E240 37-40 g ppm 140 170 200 240 290 350 420 31 3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHÔI CÁ NGỰA VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA 3.1.1. Hình thái phôi cá ngựa vằn đối chứng Hình thái của phôi, ấu thể cá ngựa vằn ở lô đối chứng cũng được ghi nhận và được sử dụng như một tiêu chuẩn để xác định sự dị dạng khi phơi nhiễm với hóa chất. Ở 24 giờ sau thụ tinh, bên trong phôi đã xuất hiện những chuyển động tự phát. Mắt, đá tai đã hình thành, đồng thời đuôi đã phát triển dài và tách khỏi khối noãn hoàng. Phần mở rộng của noãn hoàng cũng đã thấy rõ ràng (Hình Error! No text of specified style in document..7). Ở 48 giờ sau thụ tinh, chúng ta có thể dễ dàng quan sát thấy rõ nhịp đập đều đặn của tim cùng với dòng vận chuyển máu dọc theo trục cơ thể và trên noãn hoàng. Sắc tố cũng hình thành đầy đủ ở mắt và dọc theo cơ thể đến tận cuối của đuôi. Các chất trong noãn hoàng được sử dụng làm chất dinh dưỡng nuôi cơ thể nên kích thước của noãn hoàng giảm đi rõ rệt so với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, ấu thể đã thoát ra khỏi lớp màng phôi và có thể bơi tự do. Lúc này, trục cơ thể đã trở nên thẳng, vây bơi hình thành, khối hoãn hoàng thon gọn, sắc tố trên thân tập trung nhiều quanh khu vực hình thành bóng bơi nên vùng này sậm màu hơn các vùng khác. Ngoài ra, miệng ấu thể cũng đã nhô về phía trước (Hình Error! No text of specified style in document..7). 32 Hình Error! No text of specified style in document..7. Hình thái phôi và ấu thể cá ngựa vằn đối chứng A: 24 giờ sau thụ tinh; B: 48 giờ sau thụ tinh; C: 96 giờ sau thụ tinh 3.1.2. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu 3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102) Khi phơi nhiễm với Tartrazine, chỉ sau hai giờ phơi nhiễm với các nồng độ từ 8 g/l trở lên, sự phát triển phôi cá ngựa vằn đi theo hai hướng rõ ràng. Hướng thứ nhất, phôi có hình thái và sự phát triển không có nhiều khác biệt so với đối chứng. Những phôi này vẫn sẽ tiếp tục phát triển bình thường qua thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Chiều hướng thứ hai là phôi cá sẽ hình thành nhiều bất thường như đĩa phôi xù xì, các phôi bào có thể tách nhau ra, không còn liên kết thành một khối trên cực động vật, hoặc cả đĩa phôi sau đó khối noãng hoàng sẽ bị tan ra dẫn đến việc chúng không thể sống đến thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in document..8). Hình Error! No text of specified style in document..8. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l Sau 2 giờ phơi nhiễm, một số phôi xù xì mất đi sự liên kết giữa các phôi bào (A) và sẽ tan ra khi quan sát ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (B) Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, sức sống của phôi thí nghiệm chỉ bị ảnh hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 8g/l trở lên. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của 33 hai nồng độ 8g/l và 16 g/l lần lượt là khoảng 10% và 90%. Tiếp tục phơi nhiễm đến 72 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết gần như không tăng thêm. Các đường đồ thị tương quan giữa nồng độ E102 và sức sống phôi ở ba thời điểm đầu quan sát trong Hình Error! No text of specified style in document..9 (đường màu đỏ) gần như trùng khít lên nhau cũng thể hiện điều này. Hiện tượng này có thể giải thích do đích tác động gây chết của Tartrazine tập trung chủ yếu ở thời điểm phát triển phôi sớm trước thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, vì thế ở các giai đoạn tiếp sau, khi mà các cơ quan đã tương đối hoàn thiện thì chất này không gây chết thêm phôi. Các dị dạng trên phôi cá ngựa vằn quan sát được ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh là phù túi noãn hoàng, tụ máu và chỉ xuất hiện khi phơi nhiễm với Tartrazine ở nồng độ từ 8 g/l trở lên. Vị trí tụ máu thường quan sát được sự tụ máu là phía trên phần phình noãn hoàng, trên đầu hay cả ở đuôi sát với phần kéo dài của noãn hoàng (Hình Error! No text of specified style in document..10 A, B, C). Hình Error! No text of specified style in document..9. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau thụ tinh Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm 34 Hình Error! No text of specified style in document..10. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine A, B, C: nồng độ 8 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; D, E, F, G nồng độ 1g/l ở 96 giờ sau thụ tinh e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử Ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi nhận thấy vài điểm đặc biệt khi phơi nhiễm với Tartrazine. Thứ nhất là mức độ dị dạng của phôi cá khi phơi nhiễm với E102 ở nồng độ thấp hơn lại nặng nề hơn nhiều so với phơi nhiễm nồng độ cao trong dải nồng độ thí nghiệm. Cụ thể ở đây là nồng độ 1-2 g/l và nồng độ 8 g/l trở lên. Hình Error! No text of specified style in document..10D-G cho thấy rằng nồng độ 1 g/l gây ra hiện tượng phần phình của khối noãn hoàng của ấu thể không còn giữ được hình dạng elip mà có thể bị tách ra thành nhiều phần nhỏ, hoặc phù nề nghiêm trọng kèm theo việc xuất hiện một khối hoại tử bên trong. Do bị phù, màng noãn hoàng lúc này rất yếu và rất dễ vỡ làm các thành phần bên trong, kể cả khối hoại tử tràn ra ngoài. Noãn hoàng phình to, dị dạng kéo theo hiện tượng trục cơ thể của ấu thể cũng bị cong, gập tại vị trí đó. Hiện tượng phù nề không chỉ bắt gặp ở khối noãn hoàng mà cả ở phần thân cạnh noãn hoàng, trên đầu, dưới mắt và cả vây ngực. Ngoài ra, ấu thể còn bị dị tật phần cuối đuôi, hoại tử trên cơ thể cũng như bị tụ máu. Trong khi đó, phôi được phơi nhiễm với nồng độ 8g/l chỉ phù màng bao h h, e h h h h e e e n 35 tim, hoại tử và phù nhẹ màng bao noãn hoàng, tụ máu, một vài trường hợp bị cong đuôi. Hiện tượng nêu trên có thể là một bằng chứng của hiệu ứng liều thấp (low dose effect) – mức độ ảnh hưởng ở nồng độ thấp nghiêm trọng hơn nồng độ cao. Một vài lý do được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này là chất thử nghiệm có cấu trúc tương tự một loại hormone nào đó nên cũng tương tác với các thụ thể hoặc ảnh hưởng đến quá trình tạo hormone, đến các con đường di chuyển hormone [88]. Thứ hai, hiện tượng tụ máu là kiểu dị dạng phổ biến nhất khi phơi nhiễm với Tartrazine (Hình Error! No text of specified style in document..22C). Từ thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, chúng tôi thấy việc tăng đáng kể tế bào máu đỏ xuất hiện quanh khối noãn hoàng. Có thể vì thế nên dẫn tới sự tắc nghẽn mạch máu trên vài phôi ở thời điểm này và hầu hết ấu thể ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh. Ấu thể có thể bị một hoặc một vài điểm, ở nhiều vị trí và hình thức khác nhau. Điểm tụ máu quan sát được có thể ngay dưới miệng, ở noãn hoàng gần sát vùng tim hoặc bên trong noãn hoàng gần phần cơ, trên đầu hoặc dưới đuôi. Hình thức có thể là một khối nhỏ màu đỏ hoặc tăng mạnh lượng tế bào máu đỏ tại một vị trí nào đó cũng có thể khiến cả phần phù nề ở noãn hoàng có màu hồng hơn bình thường (Hình Error! No text of specified style in document..10 E). Hiện tượng tụ máu bắt gặp nhiều có thể do Tartrazine đã tác động đến các gen liên quan đến quá trình đông máu hoặc làm tăng sự hình thành, phát triển mạch máu. Tuy nhiên vẫn cần thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu để khẳng định giả thuyết này. Thứ ba, bên cạnh những phôi bị dị dạng, ở hầu hết các nồng độ trong dải nồng độ thí nghiệm đều tồn tại một vài phôi không quan sát thấy bất kì sự ảnh hưởng nào đến hình thái phôi sau 96 giờ phơi nhiễm. Hiện tượng này được thể hiện trong Hình Error! No text of specified style in document..11 với tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine không đạt tới 100% hay tỷ lệ các loại dị dạng kể cả dị dạng hay gặp nhất là tụ máu cũng không đạt được 100% phôi còn sống (Hình Error! No text of specified style in document..22C). Vậy cơ chế nào bảo vệ những phôi này chống lại tác động của E102? 36 Thứ tư, tỷ lệ phôi dị dạng cũng như tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với Tartrazine dường như không tuân theo quy luật thông thường (Hình Error! No text of specified style in document..11, Phụ lục 1). Hai tỷ lệ này không tăng liên tục theo chiều tăng nồng độ mà chững lại ở khoảng nồng độ 4 đến 8 g/l. Do nồng độ 1 g/l và 2 g/l ảnh hưởng nghiêm trọng đến hình thái phôi ngay sau khi phôi nở ở 72 giờ sau thụ tinh nên đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, hai nồng độ này làm chết nhiều phôi hơn nồng độ 4 và 8 g/l. Nồng độ 12 và 16 g/l đã gây tác động lớn ngay từ thời điểm hai giờ sau phơi nhiễm nên tỷ lệ chết tính tới thời điểm 96 giờ sau thụ tinh vẫn cao hơn các nồng độ còn lại. Tỷ lệ ấu thể dị dạng ở nồng độ 2 g/l là cao nhất (khoảng 93%) trong khi ở nồng độ 12 g/l chỉ khoảng 72%. Hình Error! No text of specified style in document..11. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm 3.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123) Sự tác động của Amaranth đến sự phát triển phôi cá ngựa vằn khá giống với Tartrazine nhưng sự ảnh hưởng xuất hiện khi phơi nhiễm với nồng độ thấp hơn. Sau 2 giờ phơi nhiễm, phôi cá phơi nhiễm với Amaranth nồng độ từ 4 trở lên cũng quan sát thấy hiện tượng làm tan đĩa phôi và noãn hoàng cùng với hệ quả gây chết sau 24 37 giờ sau thụ tinh (Phụ lục 2). Sở dĩ Amaranth và Tartrazine gây ra tác động nhanh chóng như vậy là vì chúng không bị hoặc rất ít bị ngăn cản bởi màng phôi. Tính thấm qua màng phôi bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố; một trong số đó là đặc tính ưa lipit (Lipophilicity) của chất được thử nghiệm. Những chất này có thể dễ dàng đi qua lớp màng phôi để ảnh hưởng trực tiếp đến phôi [28] và hai phụ gia E102 và E123 đều có đặc tính này. Sức sống của phôi thí nghiệm ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh chỉ bị ảnh hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 4 và 8 g/l. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của hai nồng độ này lần lượt là 55% và 100%. Ở 48 giờ sau thụ tinh, Amaranth không gây chết thêm phôi so với 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in document..12, Phụ lục 3). Cùng với đó, E123 rất ít gây ảnh hưởng đến hình thái phôi thí nghiệm ở hai thời điểm này. Hình Error! No text of specified style in document..12. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Amaranth Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm Sau khi phôi cá ngựa vằn nở, Amaranth lại tác động rất lớn đến cả hình thái cũng như sức sống của ấu thể. Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 0,5 g/l và 38 1 g/l đã làm chết lần lượt khoảng 17% và 35% ấu thể còn nồng độ 4g/l gây chết đến 82%. Ở 96 giờ sau thụ tinh, mức độ ảnh hưởng của ba nồng độ này tương ứng là 31,7%; 60,1% và 93% (Hình Error! No text of specified style in document..12). Hình thái phôi cũng bị biến đổi rất nhiều ở thời điểm này. Hiện tượng phơi nhiễm ở nồng độ thấp hơn lại ảnh hưởng đến hình thái ấu thể nhiều hơn khi phơi nhiễm với nồng độ cao hơn trong dải thí nghiệm cũng được ghi nhận ở các nồng độ 0,5 g/l; 1 g/l và 4 g/l. Kiểu dị dạng quan sát được cũng tương tự như ảnh hưởng của Tartrazine: noãn hoàng biến dạng, trục cơ thể bị cong, phù đầu và tụ máu (Hình Error! No text of specified style in document..13). Sự biến dạng noãn hoàng do Amaranth gây ra có hơi khác với Tartrazine: khối noãn thường bị hoại tử nhiều và có thể bị chia thành nhiều phần, sự phù túi noãn hoàng cũng ít gặp hơn và hiếm thấy có khối hoại tử bên trong và Amaranth không gây ra hiện tượng tụ máu nhiều như Tartrazine. Tỷ lệ phôi chết và dị dạng ghi nhận được do tác động của E123 vẫn tăng khi nồng độ tăng. Hình Error! No text of specified style in document..13. Phôi cá ngựa vằn sau 96 giờ phơi nhiễm với Amaranth A, B, C, D: phôi bị dị dạng khi phơi nhiễm với E123 nồng độ 0,5 và 1 g/l; E, F: phôi phơi nhiễm với nồng độ 4 g/l c: cong vẹo trục cơ thể; e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử e h c e c c n e, n h n 39 3.1.3. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất bảo quản 3.1.3.1. Phơi nhiễm với sodium benzoate (E211) Sau 24 giờ phơi nhiễm với dải gồm tám nồng độ thí nghiệm là 25; 45; 80; 145; 260; 350; 500 và 650 mg/l, Sodium benzoate không ảnh hưởng lớn đến hình thái cũng như sức sống của phôi cá ngựa vằn. Ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, E211 không gây chết thêm phôi thí nghiệm nhưng tác động nhiều đến hình thái của phôi. Kiểu dị dạng phổ biến nhất quan sát được là hoại tử noãn hoàng khi phơi nhiễm với nồng độ từ 80 mg/l trở lên. Từ nồng độ 260 mg/l, phôi bị phù túi noãn hoàng cùng với tụ máu. Hiện tượng phù màng bao tim chỉ bắt gặp từ nồng độ 650 mg/l trở lên (Hình Error! No text of specified style in document..14 A, B). Hình Error! No text of specified style in document..14. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Sodium benzoate A, B: phôi phơi nhiễm với nồng độ 650mg/l ở 48 giờ sau thụ tinh; C, D: phôi phơi nhiễm với nồng độ 145mg/l ở 96 giờ sau thụ tinh c: cong đuôi; e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử e c n n e h 40 Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 350 mg/l đã cho thấy sự tác động đến sức sống của phôi/ấu thể, cụ thể là làm chết 10%. Đến nồng độ 650 mg/l, 23% phôi còn sống và 3% khi phơi nhiễm 850 mg/l. Ở 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi quan sát thấy có thêm hai kiểu dị dạng là hoại tử phần đầu và cong vẹo hoặc dị tật đuôi (Hình Error! No text of specified style in document..14 C, D). Hoại tử phần noãn hoàng vẫn là kiểu phổ biến nhất khi phơi nhiễm với E211và được quan sát từ nồng độ 45 mg/l trên 16,7% ấu thể. Hiện tượng phù màng bao tim, phù noãn hoàng và hoại tử cũng được bắt gặp từ nồng độ 145 mg/l. Ngoài ra, phần kéo dài của noãn hoàng có thể không có hoặc bị gián đoạn. Mặc dù sự dị dạng đã xảy ra từ nồng độ 45 mg/l nhưng phải đến nồng độ 145 mg/l, chúng tôi mới quan sát thấy tác động gây chết phôi đáng kể (khoảng 15%). Nồng độ 650 mg/l làm chết gần như toàn bộ ấu thể (Hình Error! No text of specified style in document..15, Phụ lục 4). Hình Error! No text of specified style in document..15. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Sodium benzoate Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm 41 Sau 96 giờ phơi nhiễm với Sodium benzoate ở nồng độ cao thì số loại và tỷ lệ các dị dạng có xu hướng tăng. Như đã đề cập ở trên, hoại tử noãn hoàng là kiểu phổ biến nhất, chiếm 100% ở nồng độ 350 và 500 mg/l. Có một điều khá thú vị, hoại tử phần đầu và tụ máu là hai loại dị dạng đều bắt đầu hình thành ở nồng độ 145 mg/l và tỷ lệ của hai loại này luôn bằng nhau ở các nồng độ thí nghiệm (Hình Error! No text of specified style in document..22A). Có thể, Sodium benzoate đã tác động đến một gen/protein nào đó mà hệ quả là gây ra cả hai loại dị dạng cùng lúc. Tuy nhiên, cần thực hiện nhiều thí nghiệm chuyên sâu hơn để chứng minh cho giả thuyết này 42 3.1.3.2. Phơi nhiễm với propyl gallate (E310) Khác với Sodium benzoate, Propyl gallate lại ảnh hưởng khá nhiều ở giai đoạn sớm. Ở 24 giờ sau thụ tinh, nồng độ 26 mg/l đã gây chết 3% còn nồng độ 75 mg/l làm chết 99% tổng số phôi thí nghiệm. Tác động gây dị dạng đã quan sát thấy từ nồng độ 35 mg/l trên 15% phôi; con số này ở nồng độ 60 mg/l lên tới 88% (Hình Error! No text of specified style in document..16, Phụ lục 5). Ở thời điểm này, phôi thường có dấu hiệu hoại tử cả phần đầu và thân ngoại trừ khối noãn hoàng cùng với đuôi bị ngắn và xù xì (Hình Error! No text of specif