Luận văn Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh bacillus megaterium

Chitosan còn cung cấp cho cây một số dưỡng chất, giúp cây phát triển,kích kháng cho cây trồng. Vi sinh vật Trichoderma: có tác dụng kháng, làm giảm sự sinh sản trứng của tuyến trùng, vì thế cần bón nhiều phân chuồng hoại mục có bổ sung Trichoderma hay Pseudomonas thường xuyên sẽ làm giảm được đáng kể lượng tuyến trùng. NEMA Săn Tuyến Trùng: là loại chế phẩm sinh học mới nhất chống lại tuyến trùng, có khả năng tìm và tiêu diệt tuyến trùng hại cây trồng, sản phẩm được phối hợp 5 chủng vi nấm Arthrobotrys oligospora, Verticillium sp, Peacilomyces sp, Paenibacillus chitinolyticus, Bacillus sp. Tác dụng chính của 5 chủng trong sản phẩm NEMA là chuyên săn mồi, mỗi chủng được huấn luyện và thích nghi ở 1 điều kiện khác nhau. Nên ở bất kỳ thời tiết nào vẫn đảm bảo NEMA hoạt động tốt. NEMA Săn tuyến trùng không gây hại bộ rễ, nó sẽ bảo vệ được sự phát triển tự nhiên của bộ rễ và làm cho rễ phát triển dài hơn, sâu hơn. Các enzyme tái tổ hợp có khả năng ức chế tuyến trùng: Một số enzyme liên quan đến quá trình ký sinh của nấm vào tuyến trùng như collagenase và protease đóng vai trò quan trọng. Proteases, chitinases và lysosymes là enzyme sản xuất và tiết ra bởi nấm kí sinh tuyến trùng. Trong đó vai trò tiềm năng của chitinase trong nấm kí sinh trứng tuyến trùng đầu tiên được nghiên cứu. Nhiều nghiên cứu cho thấy enzyme chitinase đóng vai trò rất quan trọng trong đấu tranh sinh học, Chitinase ngoại bào từ các loài nấm kí sinh tuyến trùng có khả năng phân hủy màng trứng tuyến trùng và phân hủy vách tế bào của các loài vi nấm gây hại. Nấm kí sinh côn trùng có khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ của côn trùng bằng cách sản xuất ra nhiều enzyme ngoại bào nhằm phân giải protein và chitin tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập vào lớp biểu bì và gây nhiễm trùng. Ở tuyến trùng Brugia malayi sử dụng chitinase để phá vỡ lớp vỏ chitin bảo vệ và lớp niêm mạc để xâm nhập vào cơ thể muỗi kí sinh [7]. 18 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ PHÊ 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Mặc dù vi khuẩn nội sinh thực vật đã được nghiên cứu từ rất lâu nhưng gần đây, chúng mới được chú ý trên cây cà phê và đã thu được những kết quả ban đầu rất khả quan. Vi khuẩn nội sinh được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây cà phê ở khắp nơi trên thế giới với thành phần rất đa dạng: 87 dòng nội sinh cây cà phê chè ở Colombia, Hawaii và Mexico (Vega et al., 2005) [40], 200 dòng vi khuẩn nội sinh rễ cà phê vối tại Ethiopia (Mekete et al., 2009) [41], 18 dòng vi khuẩn nội sinh quả tại Brazil (Miguel et al., 2013) [42], 217 dòng vi khuẩn nội sinh lá, cành và rễ cà phê chè và cà phê vối ở Pedreira, Mococa, Pindorama và Brazil (Silva et al., 2012) [43]. Các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây cà phê chủ yếu thuộc các chi: Pseudomonas, Enterobacter, Agrobacterium, Stenotrophomonas và Bacillus, trong đó chủ yếu là các vi khuẩn Gram (-) (Mekete et al., 2009) [41]. Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh cây cà phê tuỳ thuộc vào chế độ canh tác của vườn cà phê. Những vườn cà phê thâm canh cao, sử dụng nhiều phân hoá học và thuốc bảo vệ thực vật hoá học thì tính đa dạng của nhóm vi khuẩn nội sinh giảm. Ngoài ra, các yếu tố vô sinh như: nhiệt độ, lượng mưa, hàm lượng hữu cơ trong đất, kỹ thuật canh tác và cải tạo đất cũng ảnh hưởng đến thành phần và mật độ vi khuẩn nội sinh (Hallmann et al., 1997 [18], Garbeva et al., 2004 [44], Berg and Hallmann, 2006 [45], Mekete et al., 2009 [41]. Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh trong quả còn tuỳ thuộc vào các giai đoạn phát triển khác nhau của quả, đạt cao nhất vào giai đoạn quả xanh và thấp nhất vào giai đoạn quả chín (Miguel et al., 2013) [42]. Trong mùa mưa, mật độ vi khuẩn nội sinh cao hơn, đạt 5,2 x 103 - 2,07 x 106 CFU/g rễ tươi) với thành phần đa dạng lên đến 201 dòng; trong khi đó ở mùa khô, mật độ chỉ đạt 2,7 x 103 - 1,23 x 104 CFU/g rễ tươi và chỉ có 114 dòng (Mekete et al., 2009) [41]. Tính đa dạng của vi khuẩn nội sinh còn phụ thuộc vào hình thức canh tác, với chỉ số đa dạng Shannon (H) giảm dần theo các hình thức canh tác cà phê như sau: canh tác tự nhiên, bán tự nhiên, canh tác bán thâm canh và 19 thâm canh cao. Sự khác biệt này chủ yếu là do những khác nhau về các kỹ thuật canh tác. Nhìn chung, với hình thức canh tác đồn điền lớn, cây cà phê được thâm canh, tăng cường sử dụng phân và thuốc hóa học, máy móc cơ giới, do đó ảnh hưởng tiêu cực đến tính đa dạng của nhóm vi khuẩn nội sinh (Mekete et al., 2009) [41]. Một số chủng vi khuẩn nội sinh đã thể hiện khả năng thúc đẩy sinh trưởng cây cà phê như Acinetobacter calcoaceticus 161G, 163G, 160G, 150G và Salmonella enteric 109G. Chủng thể hiện khả năng thúc đẩy sinh trưởng cây cà phê tốt nhất (Escherichia fergusonii 85G) có hoạt tính phân giải phosphat, tổng hợp siderophores và IAA trong điều kiện in vitro. Những đặc tính này hứa hẹn tiềm năng của chủng Escherichia fergusonii 85G trong việc thúc đẩy sinh trưởng phát triển của cây cà phê vì sự hiện diện của các siderophores (đại thực bào chứa sắt) làm gia tăng hàm lượng sắt dễ tiêu để rễ hấp thu còn IAA ảnh hưởng trực tiếp đến các bộ phận trên không của cây (Silva et al., 2012) [43]. Phần lớn các loài vi khuẩn nội sinh quả cà phê phân lập và tái thiết lập được quần thể bên trong cây cà phê vối đều thuộc chi Bacillus, bao gồm: B. subtilis, B. megaterium, B. licheniformis, B. cereus và B. thuringiensis. Đáng chú ý là B. thuringiensis, loài vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, cũng được ghi nhận nội sinh quả cà phê (Miguel et al., 2013) [42]. Khi nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh rễ cây cà phê, Mekete et al. (2009) [41] cho biết 33% số chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ rễ cây cà phê có hoạt tính đối kháng với tuyến trùng nốt sưng M. incognita, trong đó, đáng chú ý là các loài Bacillus pumilus và B. mycoides có khả năng làm giảm 39% khả năng sinh sản của tuyến trùng và giảm 33% số bướu rễ gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne incognita (Mekete et al., 2009) [41]. Những kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy một số loài vi khuẩn nội sinh cây cà phê (Bacillus lentimorbus và Bacillus cereus) có tiềm năng trong việc ức chế khả năng nảy mầm và phát triển của bào tử hạ nấm Hemileia vastatrix gây bệnh gỉ sắt cà phê (Shiomi et al., 2006 [46], Silva et al., 2012) [43]). 20 Thời điểm chủng vi khuẩn nội sinh cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả ức chế các tác nhân gây bệnh. Chủng các vi khuẩn nội sinh Brevibacillus choshinensis 64R và 137G vào cây cà phê ở thời điểm 72h hoặc 24h trước khi chủng nấm H. vastatrix gây bệnh gỉ sắt đã làm giảm chỉ số bệnh gỉ sắt lần lượt là 100% và 97% nhưng nếu chủng đồng thời cả vi khuẩn nội sinh và tác nhân gây bệnh, chỉ số bệnh không giảm (Shiomi et al., 2006 [46], Silva et al., 2012 [43]). Việc chủng các vi khuẩn nội sinh trước khi chủng các tác nhân gây bệnh sẽ đảm bảo khả năng xâm chiếm tế bào biểu mô và nội mô của các chủng thích hợp kích thích tính kháng hệ thống cảm ứng ISR nhờ làm nhạy cảm các mô, tăng cường cạnh tranh không gian và dinh dưỡng trên bề mặt lá. Vi khuẩn nội sinh tiêu diệt các tác nhân gây bệnh thông qua quá trình phân huỷ hoặc ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm nhờ các chất kháng sinh do vi khuẩn sản sinh. Trong điều kiện in vitro , ở 24oC, các chủng B. megaterium, A. radiobacter và C. davisae cho hiệu quả diệt tuyến trùng tuổi 2 Meloidogyne incognita trên 90%. Các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê như: Agrobacterium radiobacter, Bacillus l icheniform is, B. pumilus, B. mycoides, B. megaterium, Pseudomonas syringae, Pantoea agglomerans, Paenibacillus pabuli, Cellulomonas fimi và Pseudomonas coronafaciens khi được chủng vào cây cà chua đã làm giảm hơn 54% số lượng u sưng trên rễ gây ra bởi tuyến trùng Meloidogyne incognita. Tuy nhiên, các chủng này lại không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh trưởng của cây, ngoại trừ P. coronafaciens có khả năng làm tăng khối lượng thân tươi 51%. Hiệu quả diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita của các chủng vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê dao động từ 38 - 98%. Trong đó, các chủng Agrobacterium radiobacter, Bacillus pumilus, B. brevis, B. megaterium, B. mycoides, B. licheniformis, Chryseobacterium balustinum, Cedecea davisae, Cytophaga johnsonae, Lactobacillus paracasei, Micrococcus luteus, Pseudomonas syringae và Stenotrophomonas maltophilia, M. halobius cho hiệu quả diệt tuyến trùng > 80% trong điều kiện in vitro (Mekete et al., 2009) [41]. Trong số các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê phân lập được, chủng Bacillus spp. được coi là tác nhân sinh học tiềm năng để kiểm soát 21 tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. vì chúng sản sinh nội bào tử có khả năng chịu được điều kiện nóng và khô (Kloepper et al., 2004) [47]. Chủng Bacillus pumilus và B. mycoides hiệu quả nhất trong việc làm giảm số lượng khối trứng và u sưng do tuyến trùng M. incognita gây ra trên cây cà chua trồng trong nhà lưới (33 và 39%, một cách tương ứng) (Mekete et al., 2009) [41]. Bacillus cereus làm giảm đến hơn 50% số lượng khối trứng và u sưng gây ra bởi M. incognita, M. javanica và M. arenaria (Mahdy et al., 2000, dẫn theo Mekete et al., 2009) [41]. Cơ chế đối kháng tuyến trùng của vi khuẩn nội sinh B. pumilus và B. mycoides được cho là tương tự như đối với các vi khuẩn vùng rễ và nội sinh khác, bao gồm: giảm khả năng xâm nhập, sản sinh chất kháng sinh trực tiếp hoặc kháng hệ thống cảm ứng ISR (Sikora et al., 2007) [48]. Trong một tổng hợp gần đây, Kloepper và Ryu (2006) [49] đánh giá B. pumilus là một trong những vi khuẩn nội sinh quan trọng nhất gây ra kháng hệ thống cảm ứng đối với nhiều loại bệnh khác nhau. Vi khuẩn nội sinh kích kháng hệ thống cảm ứng để kiểm soát hiệu quả một số tuyến trùng kí sinh thực vật như G. pallida và M. incognita (Mekete et al., 2009) [41]. Trong một nghiên cứu khác, B. cereus được ghi nhận là có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh gỉ sắt cà phê (Vega et al., 2005) [40]. Tuy nhiên, các tác giả chưa ghi nhận được bất kì sự liên hệ nào giữa các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà phê có khả năng thúc đẩy sinh trưởng với các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng đối kháng các tác nhân gây bệnh (Silva et al., 2012) [43]. Do đó, việc nghiên cứu chủng có đặc tính tốt để sử dụng là cần thiết nhằm vừa giúp cây sinh trưởng, phát triển tốt vừa khồng chế tác hại của bệnh. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Tại Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Tây Nguyên trong những năm qua đã tiến hành nghiên cứu và phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trên cả cà phê chè và cà phê vối. Trên cà phê chè ở Lâm Đồng, Nguyễn Ngọc Mỹ (2012) [50] đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ và tuyển chọn được chủng B. cereus 22 M15 là chủng có hoạt tính cố định N và phân giải P cao nhất. Hàm lượng N và P trong lá cây con cà phê chè khi được xử lý với chủng này tăng 52% và 33,3% so với đối chứng. Kết quả nghiên cứu bước đầu khi chủng nhiễm chủng vi khuẩn này vào hạt cà phê rồi trồng trong nhà lưới cho thấy các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà phê chè giai đoạn vườn ươm như: chiều cao cây, đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với đối chứng. Trong rễ cây cà phê vối tại Đắk Lắk, 37 chủng vi khuẩn nội sinh cũng đã được phân lập, trong các đó chủng B. subtilis EK17 và Enterobacter cloace EK19 được tuyển chọn có khả năng cố định đạm và phân giải lân cao nhất. Kết quả thử nghiệm bước đầu của các chủng này trên cây con cà phê vối TR4 cho thấy hàm lượng đạm và lân trong lá cà phê đều cao hơn gấp 1,5 lần so với đối chứng. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây cà phê con như: chiều cao cây, đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với đối chứng (Trương Vĩnh Thới, 2012) [51]. Ngô Văn Anh và cs. (2017) [52] đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ cây cà phê vối. Trong điều kiện invitro, các dòng Bacillus sp. BMT11 (1,574 μg/ml), B. pumilus BMT4 (1,493 μg/ml), Bacillus sp. BMT8 (1,474 μg/ml), BH8 (1,434 μg/ml), Bacillus cereus BMT7 (1,399 μgm/l) và Bacillus sp. Cư8 (1,372 μg/ml) có hoạt tính cố định đạm cao nhất. Các dòng có hoạt tính phân giải lân cao nhất là Bacillus sp. BMT11 (12,25 μg/ml), Bacillus sp. Cư8 (11,46 μg/ml) và Cư2 (11,25 μg/ml). Ngoài ra, các chủng này còn có khả năng sinh tổng hợp IAA khá cao: Bacillus sp. BMT11 (9,048 μg/ml), BH8 (8,876 μg/ml), Bacillus sp. Cư8 (8,153 μg/ml), B. pumilus BMT4 (5,624 μg/ml). Tóm lại, vi khuẩn nội sinh đóng vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật do chúng có những đặc tính tốt như có khả năng cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan giúp cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng, sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng, tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh và giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc nghiên cứu chúng để sản xuất phân vi sinh ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp bền vững là vấn đề đang được quan tâm hiện nay. 23 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 nằm trong bộ sưu tập của phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Đây là chủng vi sinh vật nội sinh được phân lập từ rễ cây cà phê thu tại tỉnh Đăk Lăk, đã được định danh bằng 16S (là kết quả nghiên cứu của đề tài mã số TN16/C02 thuộc chương trình Tây Nguyên giai đoạn 2016-2020). - Cây cà phê in vitro do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp - Tuyến trùng Meloidogyne incognita ký sinh gây hại trên cây cà phê 2.2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Thời gian nghiên cứu: Từ 15/08/2018 đến 30/08/2020 - Địa điểm thu mẫu: Các mẫu đất, rễ, tuyến trùng đã được thu thập tại vùng trồng cà phê bao gồm: Lô 8, vùng 36, đội 4 Eapok; Lô 3 vùng 51, đội 3 Eapok; Lô 4 vùng 19, đội 4 Eapok, Lô 2 vùng 51, đội 3 Eapok; Lô 1, vùng 6, tái canh 2012 Eapok, Đăk Lăk. - Địa điểm tiến hành thí nghiệm trồng cà phê ngoài đồng ruộng: Thí nghiệm được tiến hành tại hộ gia đình ông: Nguyễn Quốc Bình, số CMND: 250568156. Địa chỉ: Tổ 7, xóm Sóc Sơn, xã Nam Hà, huyện Lâm Hà, tỉnh Lâm Đồng. - Thí nghiệm phân lập, đánh giá khả năng diệt tuyến trùng, đánh giá hoạt tính: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nội dung 1: Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 24 - Nội dung 2: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng trên cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 - Nội dung 3: Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 2.4. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.4.1. Thiết bị chính Kính hiển vi quang học Olympius, Model CHD (Nhật Bản); máy đo pH, Metter Toledo (Thụy Sỹ); cân điện tử AB 204, Metter Toledo (Thụy Sỹ); máy lắc ổn nhiệt (Hàn Quốc); các loại pipetman Gilson, Biohit; nồi khử trùng ướt (Trung Quốc); tủ sấy khô (Sellab - Mỹ); tủ lạnh, Hàn Quốc; máy đo OD; lò vi sóng; ống đong: 100 ml, 500 ml, 1000 ml; cốc đong: 100 ml, 200 ml, 1000 ml, 2000 ml; máy sục khí; các dụng cụ khác 2.4.2. Hóa chất chính Cao thịt (Merck- Đức); cao nấm men (Merck - Đức); pepton (Merch - Đức); thạch (Merck- Đức); bột xenluloza (Nhật); CMC; tinh bột tan, các loại đường: D-glucoza, saccaroza, D-fructoza, (Merck- Đức); các hóa chất vô cơ khác: NaCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3 + Bộ kit chuẩn hóa sinh 50 API CHB 2.4.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường MPA (g/l): Cao thịt 3; pepton 5; NaCl 5; agar 20; nước cất 1.000ml. Môi trường gelatin: Môi trường MPA + 0,4 % gelatin; khử trùng ở 121oC trong 20 phút. 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật [53] 2.5.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn  Đặc điểm hình thái 25 Đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.  Nhuộm Gram vi khuẩn [53] Xác định xem các vi khuẩn phân lập được thuộc Gr (-) hay (+) căn cứ vào màu thuốc nhuộm bắt màu trên tế bào vi khuẩn. Nếu vi khuẩn bắt màu hồng là Gr (-), màu tím là Gr (+).  Đặc điểm sinh lý, sinh hóa  Khả năng sinh tổng hợp enzym Thủy phân tinh bột: Cấy chấm điểm vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung thêm 1% tinh bột. Nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh trưởng [6]. Thủy phân xenluloza: Cấy vi khuẩn trên môi trường MPA bổ sung 1% bột giấy. Nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ và thử bằng thuốc thử Lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân xenluloza chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn sinh trưởng. Làm loãng gelatin: Cấy vi khuẩn vào môi trường gelatin đã vô trùng, nuôi ở nhiệt độ 30oC, sau 72 giờ lấy ra cho vào tủ lạnh 4oC để trong 2 giờ. Sau 2 giờ môi trường trong ống nghiệm không bị đông lại chứng tỏ chủng đó có khả năng làm loãng gelatin.  Khả năng sử dụng các nguồn đường, cacbon [5]. Nuôi vi sinh vật trên môi trường có bổ sung 1% nguồn đường, cacbon. Xác định khả năng phát triển của chúng bằng chỉ số OD620 nm.  Khả năng chịu NaCl, chịu nhiệt, pH Thay đổi nồng độ NaCl và nuôi ở các thang nhiệt độ, pH khác nhau. Theo dõi khả năng sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số OD620 nm. 26 2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn [53] + Ảnh hưởng của thời gian: Trong quá trình nuôi cấy khi không thay đổi môi trường thì thời gian nuôi cấy quyết định sự thay đổi của các tế bào vi sinh vật. Vì vậy, sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào thời gian, tùy từng thời điểm lượng enzym sinh ra cũng khác nhau. Tiến hành thí nghiệm bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MPA, nuôi ở 37oC, điều kiện lắc 200 vòng/phút trong 60 giờ. Cứ sau 6 giờ lấy mẫu một lần, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm). + Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể. Sau đó, cấy các chủng vi sinh vật trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ: 25; 30; 35; 45; 55. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm). + Ảnh hưởng của pH: Sử dụng môi trường MPA có pH ban đầu là: 3; 4; 5; 6; 7; 8; và 9. Cấy vi sinh vật, nuôi ở 37oC, sau 48 giờ xác định khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD620 nm. + Ảnh hưởng của nồng độ NaCl: Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường MPA sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 0,3; 1; 3; 5; 7; 9 và 11 nuôi ở 37 oC trong 48 giờ. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số (OD620nm). + Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn trên các nguồn cơ chất khác nhau. Trên môi trường cơ sở có bổ sung tinh bột, CMC-Na, glucoza, saccaroza, lactoza, rỉ đường.Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm). + Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Giống vi sinh vật được cấy vào môi trường cơ sở có bổ sung các nguồn nito khác nhau: pepton, cao men, cao thịt, KNO3 và (NH4)2SO4. Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường MPA trong 27 48 giờ. Sau khoảng thời gian đó, kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn bằng chỉ số (OD620nm). 2.5.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym Phương pháp đường khử: Làm các mẫu đường chuẩn với các nồng độ: 0.5; 1; 1.5; 2; 3 (mg/ml). Pha loãng dịch enzym trong đệm ít nhất 2 nồng độ đến khi xấp xỉ nồng độ 0,5 mg/ml đường (thể tích dịch sau khi pha loãng bằng 1 ml). Bổ sung 1 ml cơ chất, mix đều và ủ ở 37oC trong 10 phút, sau đó thêm 3 ml DNSA, mix đều rồi đun sôi các mẫu enzym, đường chuẩn, EB và S cùng nhau (khoảng 30 phút). Sau đó làm lạnh bằng cách ủ vào đá rồi đo OD (540 nm). Chỉnh S về 0 rồi đo các mẫu tiếp. Công thức pha hóa chất: Spectro zero: 1 ml cơ chất, 1 ml đệm, 3 ml DNSA. Đường chuẩn: 1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 0,5 ml đường. Enzym blank: 1 ml cơ chất, 3 ml DNSA, 1 ml enzym. Đệm PBS 6,8: (a): NaH2PO4 0,2 M: cân 27,8 g và định mức đến 1.000 ml, (b) NaH2PO4.7H20 0,2 M: cân 53,05 g và định mức đến 100 ml, dung dịch đệm bằng tổng của 51 ml (a) và 49 ml (b) định mức đến 200 ml. DNSA: DNSA 10,6 g, NaOH 19,8, Na2S2O5 8,3 g, N- K-tatarat 306 g, phenol 7,6 ml. Kết quả thu được áp vào đường chuẩn hình 2.1 tính hoạt độ chitinase. y = 2.8096x + 0.1064 R 2 = 0.9982 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Đồ thị đường chuẩn glucose (mg/ml) O D 5 4 0 n m Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld [54] 28 2.5.2. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với thực vật của chủng Bacillus megaterium 18 Do thời gian sinh trưởng của cây cà phê khá dài (ít nhất 6 tháng) do vậy tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sinh trưởng đối với thực vật của chủng Bacillus megaterium 18 trên cây thuốc lá (thời gian sinh trưởng giai đoạn cây con đến khi xuất vườn là từ 40-60 ngày) nhằm đảm bảo tiến độ thực hiện luận văn. 2.5.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng cây thuốc lá Hạt thuốc lá sau khi khử trùng được ủ nhiễm với dung dịch vi khuẩn B.megaterium 18 mật độ quang OD đạt 0,6-1,0 trong thời gian 2 giờ. Hạt thuốc lá sau đó được thấm khô trên giấy thấm vô trùng và đặt lên môi trường ½ MS (Murashige và Skoog, 1962) đặc có bổ sung sucrose 10 g/L [55]. Hạt nảy mầm được quan sát hàng ngày, các chỉ tiêu về sinh trường như số lá, chiều dài rễ, chiều dài thân được đo 2 tuần 1 lần. Mỗi công thức thí nghiệm được thực hiện trên 5 cây cà phê. Các chỉ tiêu theo dõi được đo đếm như sau: + Chiều dài thân (cm): đo từ gốc cây cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây + Số cặp lá (cặp lá/cây): đếm toàn bộ số cặp lá trên cây + Chiều dài rễ (cm): đo bằng thước có khắc vạch, chính xác đến mm. 2.5.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vườn ươm. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng phát triển cây cà phê được triển khai tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp như sau: tiến hành lây nhiễm vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 vào cây cà phê in vitro (cây gieo hạt, 20 ngày tuổi) bằng cách nuôi cấy các cà phê này trên môi trường thủy canh có bổ sung chế phẩm chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 với nồng độ 1% trong 28 ngày. Theo dõi các 29 chỉ tiêu về chiều cao thân, số cặp lá mới mọc/cành, chiều dài rễ chính và số rễ nhánh của cây như sau: + Chiều cao thân (cm): đo từ gốc cây cà phê đến đỉnh sinh trưởng của cây + Số cặp lá mới mọc/cành (cặp lá/cành): đếm toàn bộ số cặp lá mới mọc/cành + Chiều dài rễ chính (cm): đo bằng thước có khắc vạch, chính xác đến mm + Số rễ nhánh (n): đếm toàn bộ số rễ nhánh trên cây. Sau 28 ngày kiểm tra những cây cà phê nào có nồng độ vi sinh vật nội sinh đạt 102 thì được lựa chọn để trồng vào các công thức thí nghiệm như sau: - Công thức Đối chứng (ĐC): Cây cà phê không được lây nhiễm vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18, sau đó được trồng trên đất và không bổ sung phân bón; - Công thức Thí nghiệm 1 (TN1): Cây cà phê không lây nhiễm vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18. Sau đó được bón phân hóa học và chăm sóc theo quy trình của ngành nông nghiệp 10TCN 478-2001 và cẩm nang khuyến nông của sở nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đắk Lắk. - Công thức Thí nghiệm 2 (TN2): Cây cà phê đã được lây nhiễm vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18, sau đó được trồng trên đất nhưng không được bón phân hóa học mà sử dụng chế phẩm vi sinh vật Bacillus megaterium 18 với nồng độ 1g/100g đất và phun bổ sung chế phẩm này với nồng độ 1%, cách phun ướt đẫm lá cây cà phê, phun trong 28 ngày. Theo dõi các chỉ tiêu về chiều cao cây và số cặp lá/cây của cây cà phê sau 3, 6 và 9 tháng trồng trong vườn ươm. 2.5.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng cây cà phê giai đoạn cây con và giai đoạn cây 1,5 tuổi Cây cà phê * Đối tượng nghiên cứu: - Cây cà phê vối (Robusta); Tuổi cây cà phê 1,5 năm tuổi, cây đang mang quả bói; tán lá cây phủ rộng > 0,5m. 30 - Thí nghiệm được thực hiện trên 20 cây cà phê/ công thức thí nghiệm, các cây cà phê được trồng đồng đều nhau với khoảng