Luận văn Góp phần nghiên cứu tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế

MỞ ĐẦU I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Bò sát là động vật có nhiều đặc điểm sống khá phong phú và hấp dẫn đồng thời có nhiều lợi ích. Từ nhiều thế kỷ trước, khoa học đã dành khá nhiều thời gian và công sức để tìm hiểu về nhóm động vật có số lượng không nhiều này, nhưng vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tìm hiểu của con người. Ở Việt Nam, các loài bò sát đã được chú ý dùng làm thuốc chữa bệnh từ thế kỉ XIV, nhưng mãi đến thời kỳ thực dân Pháp xâm lược nước ta mới có những công trình nghiên cứu thực sự về Bò sát của các tác giả người nước ngoài, đặc biệt là R.Bourret và cộng sự trong thời gian từ năm 1924 – 1944. Tuy nhiên từ sau năm 1945 đến nay các công trình nghiên cứu về Bò sát đã được đẩy mạnh nhiều hơn. Trong số loài thằn lằn được biết ở Việt Nam, Leiolepis belliana (Gray, 1827) là một loài thuộc họ Nhông (Agamidae). Tên phổ thông ở Việt Nam là nhông cát. Nhông cát thường gặp ở các dãi cát ven biển Việt Nam. Từ rất lâu nhân dân ta đã biết sử dụng nhông cát để chữa các bệnh như hen suyễn, ghẻ lở, còi xương ở trẻ con... Ngoài ra nhông cát còn được sử dụng để ngâm rượu làm thuốc bổ như tắc kè và rắn. Do thịt nhông thơm và ngon nên được sử dụng để làm thực phẩm. Mặt khác khi phân tích thành phần thức ăn tự nhiên của chúng thấy có nhiều loài động vật và thực vật khác nhau, trong đó có nhiều loài côn trùng có hại như cào cào, châu chấu, bọ xít, bướm, ruồi. Do đó có thể nói nhông cát được xem là loài động vật phổ biến ở các vùng cát ven biển miền Trung Việt Nam đã cùng với các loài động vật khác trong hệ sinh thái giữ vai trò nhất định, không những đảm bảo nâng dần năng suất sinh học trong thiên nhiên mà còn có vai trò ổn định thế cân bằng trong các hệ sinh thái. Như vậy, nhông cát là một trong những nguồn tài nguyên thiên nhiên có giá trị. Nghiên cứu khai thác, sử dụng và bảo vệ nguồn tài nguyên động vật và thực vật trong đó có nhông cát là rất cần thiết để góp phần vào sự nghiệp phát triển kinh tế, văn hóa, khoa học và đời sống. Trên thế giới và Việt Nam, việc nghiên cứu về nhông cát vẫn chưa nhiều, phần lớn các công trình chỉ tập trung vào các vấn đề đặc điểm sinh học, sinh thái học, phân bố, phân loại dựa vào các đặc điểm về hình thái cấu tạo và các đặc điểm sinh học. Năm 1991, tác giả Ngô Đắc Chứng trong luận án phó tiến sĩ của mình đã mô tả kĩ về đặc điểm hình thái và sinh thái ở hai phân loài của loài Leiolepis belliana là Leiolepis belliana belliana và Leiolepis belliana guttata Cuvier. Luận án đã bổ sung một số hiểu biết về nhông cát mà các tài liệu có được cho đến nay chưa đề cập hoặc đề cập còn ít, cung cấp một số cơ sở khoa học cho việc khai thác, sử dụng chăn nuôi và bảo vệ nguồn lợi này ở nước ta. Tuy nhiên, do yêu cầu, mục đích của luận án và do số liệu chưa đầy đủ nên chưa chứng minh Leiolepis belliana belliana và Leiolepis belliana guttata Cuvier là hai phân loài, loài hay dạng sinh thái mà tác giả chỉ tạm công nhận đó là hai phân loài. Theo xu hướng hiện nay, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu phân loại động, thực vật và vi sinh vật rất phổ biến trên thế giới. Như đã nói ở trên, hai loài nhông cát ở Thừa Thiên Huế đã được nghiên cứu về hình thái học, tuy nhiên vẫn chưa được nghiên cứu ở mức độ phân tử. Chính vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Góp phần nghiên cứu tính đa hình của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế”. II. MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 1. Mục tiêu - Mô tả một số đặc điểm hình thái của nhông sọc Leiolepis belliana guttata Cuvier. - Phân tích ADN của nhông sọc về mặt định tính và định lượng. 2. Nhiệm vụ - Thu mẫu nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier ở Thủy Phù – Hương Thủy - Thừa Thiên Huế. - Mô tả đặc điểm hình thái về trọng lượng thân, chiều dài cơ thể, vẩy môi trên, vẩy môi dưới, lỗ đùi, một số tính trạng kích thước so với chiều dài thân và chiều dài đầu. - Tách chiết và tinh sạch ADN, sau đó xác định nồng độ và chất lượng ADN của nhông cát Leiolepis belliana guttata Cuvier Phần 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU I. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NHÔNG CÁT 1. Trên thế giới Theo E.H. Taylor thì Leiolepis belliana (Gray) được Gray xác định và mô tả lần đầu vào năm 1827 dưới tên là Uromastyx belliana Gray dựa trên hình vẽ của Hardwicke từ mẫu thu ở Penang (Malaysia). Năm 1864, trong “Reptiles of British India”, Gunther gọi là Leiolepis guttata. Tên Leiolepis belliana lại được Gray đặt vào năm1845 trong “Catalogue of the Lizards in the British Museum”. Về sau, nhiều tác giả khác cũng đã sử dụng tên này như: Ridley (1869), Boulenger (1890), Annandale (1900), Laidlaw (1901), Schmidt (1927), Smith (1935), Taylor và Elbel (1950), Nertens (1961),...Tên loài này cũng được một công trình khác của C.H. Pope nhắc đến. Gần đây, trong công trình nghiên cứu về nhiễm sắc thể, A. KynpurHoBa cũng gọi là L.belliana. Đặc biệt trong cuốn “Từ điển tên gọi các loài động vật năm thứ tiếng” (Tiếng Nga) xuất bản năm 1989 đã nêu tên 5 loài thằn lằn thuộc giống Leiolepis trong đó có loài Leiolepis belliana (Gray). Cho đến nay, việc nghiên cứu các mặt của các phân loài và loài trong giống Leiolepis trên thế giới tương đối còn ít. Trong số đó, đáng chú ý là các công trình sau: M. Smith (1935) đã mô tả loài Leiolepis belliana ở Ấn Độ, Miến Điện và Srilanca. Cũng vào năm 1935, trong công trình nghiên cứu Bò sát ở trung Quốc, C.H. Pope trình bày khoá để xác định các giống trong họ Agamidae ở Trung Quốc và các loài trong giống Leiolepis. Theo C.H. Pope thì ở Trung Quốc họ Agamidae có các giống sau: Draco, Phoxophrys, Japalura, Genocephalus, Phisignathus và Leiolepis. Riêng Leiolepis có một loài là Leiolepis belliana (Gray). Loài này phân bố từ nam Miến Điện đến các quần đảo Đông Nam Á và đảo Sumatra thuộc Indonesia, còn ở Trung Quốc đã tìm gặp ở Quảng Châu, Quảng Đông và đảo Hải Nam. Căn cứ vào mẫu vật thu được ở một số vùng thuộc các tỉnh Loei, Kanchanaburi, Rat Buri và Sisaket (Thái Lan), E.H. Taylor và R. Elbel đã giới thiệu một số dẫn liệu hình thái của L. belliana belliana trong một công trình về Ếch nhái – Bò sát ở Thái Lan. Sau đó, trong bài “Các loài thằn lằn của Thái Lan” đăng trên tạp chí “The University of Kansas Science Bulletin”, E.H. Taylor đã mô tả đặc trưng của loài này như sau: “Thân dẹp theo hướng lưng bụng; không có mào lưng; vẩy bình thường, nhỏ, xếp sát nhau, hình nón hay hình tháp, ít nhiều hóa sừng; túi họng không thấy rõ, nhưng có một hoặc hai nếp hầu nằm ngang; cả cá thể đực và cái đều có lỗ đùi; đuôi dài, đôi khi dày lên ở gốc, vảy gần như đồng hình; vảy bụng xếp đè lên nhau, tạo thành những vảy gần như ô vuông”. Theo E.H. Taylor thì có hai phân loài được ghi nhận ở Thái Lan là L. belliana belliana (Gray) và L .belliana rubritaeniata Mertens thuộc các vùng phía Tây và Trung Bắc; còn L.belliana guttata Cuvier có thể gặp ở các vùng xa về phía Đông Thái Lan. Năm 1976, trong luận án của mình, D.C. Leroy có nói đến L.belliana. Theo ông, đặc trưng của chúng là không có mào lưng và sống ở dưới đất. Người ta thường gặp loài này ở vùng Nam Á và Indonesia. Nhìn chung các công trình nói trên chỉ tập trung mô tả các đặc điểm hình thái dùng trong phân loại và sự phân bố địa lí của Leiolepis belliana ở các vùng nghiên cứu và trên thế giới. Ngoài ra có các cồng trình nghiên cứu đối tượng này trên các lĩnh vặc khác như: Về tập tính hoạt động và nơi ở của nhông cát có các dẫn liệu của C.H.Pope và D.C.Leroy. Theo các tác giả trên khi nghiên cứu ở Tây Pakistan và Bắc Ấn Độ thì nhông cát ở trong các hang tự đào vùng đất cát dài từ 2,44 – 2,74 m (8 – 9 feet) và sâu 1,22 – 1,52 m (4 – 5 feet). Những lúc trời rét và ban đêm chúng chui vào hang và lấp kín cửa hang. Đặc điểm cấu tạo giải phẩu đã được A.G.Edmund, R.Hoffstetter và J.P.Gase trình bày trong “Biology of the Reptilia”. Khi nghiên cứu về răng của các loài trong họ Agamidae, A.G.Edmund cho rằng L. belliana có 3 – 4 răng trước hàm, 12 răng hàm và 12 răng ở phần trước xương răng. Các răng ở phần trước xương răng thường lớn và theo kiểu răng nanh. Đặc điểm của cột sống và xương sườn của Leiolepis cũng giống như các loài trong họ Teiidae và Agamidae nhưng có phần thân đốt và phần gian thân đốt không phân biệt rõ. Đặc điểm của các loài trong họ Agamidae cũng như Iguanidae có cấu tạo giống Sphenodon. Còn cấu tạo của xương khẩu cái, xương hàm, xương lá mía và ống đổ của cơ quan Jacobson theo kiểu “lỗ khoan cổ” như nhiều loài thằn lằn khác. Về cấu trúc nhân có công trình nghiên cứu của A.KynpurHoBa, khi nghiên cứu kiểu nhân của ba loài thằn lằn họ Agamidae là Stellio chernovi, Stellio himalayanus và Leiolepis belliana belliana. Kết quả nghiên cứu này cho thấy các loài trên có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36. Về số lượng loài của giống Leiolepis Cuvier, theo công trình của nhiều tác giả mà B.E.CokovoB làm chủ biên cho thấy có năm loài là L.belliana (Gray), L. guttata Cuvier, L. peugensis Peters, L.reevessi (Gray) và L.triploida Peters, tất cả đều sống ở châu Á. Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả loài nhông Leiolepis guentherpetersi (Theo Cuvier, 1829) là Leiolepis belliana guttata Cuvier). Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức phân tử đối với loài này [4]. 2. Ở Việt Nam Tài liệu đầu tiên nói đến nhông cát L.belliana (Gray) của R. Bourret. Trong đó tác giả mô tả đặc điểm của loài và hai phân loài của L.belliana là L.belliana belliana và L.belliana guttata khác nhau về số lượng lỗ đùi ở mỗi bên, Theo tác giả thì L.belliana phân bố ở Nam Miến Điện, Thái Lan, Đông Dương, đảo Hải Nam, Nam Trung Quốc, Malaysia và Sumatra. Ở Việt Nam đã gặp ở Cù Lao Chàm, Nha Trang và Quảng Trị. Căn cứ vào các mẫu vật đã thu được và các công trình đã công bố, Đào Văn Tiến đã công bố danh sách 77 loài thằn lằn hiện có ở Việt Nam cùng với đặc điểm hình thái dùng trong phân loại cũng như khoá định loại các loài thằn lằn đó. Trong số 17 loài thằn lằn thuộc họ Agamidae của danh sách này có hai phân loài của L.belliana là nhông thường L.belliana belliana và nhông gutta L.bellana guttata Cuvier. Năm 1981, trong “Kết quả điều tra cơ bản động vật miền Bắc Việt Nam” của Uỷ ban Khoa học và kĩ thuật Nhà nước do tác giả Trần Kiên, Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc thực hiện đã thu mẫu và xác định L.belliana phân bố ở Hà Tĩnh và Vĩnh Linh (Quảng Trị). Gần đây, theo kết quả điều tra về khi hệ động vật các đảo có nguồn gốc lục địa của Viện Địa lý (Viện HLKH Viễn Đông – Liên Xô) cho thấy có L.belliana ở Cù Lao Chàm trong số các đảo đã khảo sát từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan [4]. Năm 1991, Trong luận án phó tiến sĩ của mình, Ngô Đắc Chứng đã nghiên cứu về các đặc điểm về hình thái và sinh thái của hai phân loài L.belliana belliana và L.belliana guttata Cuvier ở Thừa Thiên Huế. Về đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana belliana, tác giả đã mô tả như sau: “Thân dẹp theo hướng lưng bụng, không có mào lưng, không có gai trên đầu. Vảy nhỏ, phần lớn hoá sừng. Có một hoặc hai nếp họng nhỏ nằm ngang. Lỗ đùi làm thành hai dãy ở vùng mu hai bên lỗ huyệt. Đuôi dày lên ở gốc. Mỗi bàn chân có 5 ngón, các ngón chân dài và có móng nhọn. Bề rộng và bề dài của mõm gần bằng nhau. Bờ mõm được giới hạn bởi hai vảy môi và sáu tấm vảy sau mõm. Lỗ mũi mở trực tiếp ra ngoài, trán và vùng gian ổ mắt đôi khi to; các vảy trên ổ mắt là các vảy chấm rất nhỏ. Màng nhĩ rộng và nông, đường kính của nó gần bằng chiều dài lỗ mắt. Hai bên cổ có những nếp da nằm ngang kéo ngang qua phần gáy. Vẩy lưng nhỏ, hoá sừng; vẩy mặt bụng lớn hơn ở mặt lưng”. Đặc điểm hình thái của con cái tương tự như con đực, chỉ khác ở một số điểm sau: Con cái da ở hai bên sườn không thể bạnh ra khi ở tư thế dọa nạt; ở con đực mặt lưng từ đầu đến đuôi màu phân ngựa với những vùng sẫm ở hai bên, riêng mặt lưng phần thân có những chấm màu vàng viền đen hình mạng lưới, mặt bụng từ đầu đến đuôi màu trắng đục, đặc biệt hai bên thân có hai dải chấm màu da cam thể hiện khá rõ khi nhông bạnh nếp da hai bên sườn, còn con cái các chấm vàng viền đen ở mặt lưng sắp thành bốn dãy dài chạy dọc lưng từ sau gáy tới gốc đuôi, ngoài ra ở hai bên sườn không có các dãy chấm màu da cam. Về tính trạng khối lượng cơ thể, chiều dài thân thì cá thể đực thường lớn hơn cá thể cái (cá thể đực có khối lượng trung bình là 41,17 g và chiều dài thân trung bình là 114,0 mm; trong khi con cái là 30,52 g và 107,4 mm). Số lượng lỗ đùi trung bình của cá thể đực ít hơn cá thể cái (con đực là 17 và con cái là 18). Đặc điểm hình thái của phân loài L.belliana guttata Cuvier cũng tương tự như ở phân loài L.belliana belliana, chỉ khác ở một số tính trạng sau: Mặt lưng của L.belliana guttata Cuvier không có các chấm vàng viền đen mà có các chấm màu phân ngựa hình lục giác, có bốn sọc dài màu vàng nhạt rộng trung bình 3 mm: hai sọc chạy từ sau tai đến gốc đuôi, hai sọc chạy từ gốc chân trước đến gốc chân sau. Mặt bụng màu trắng đục, không có các chấm màu da cam hai bên thân và không có khả năng bạnh da hai bên sườn. L.belliana guttata Cuvier có khối lượng cơ thể trung bình là 56,0g và chiều dài thân trung bình là 120,83 mm. Số lượng lỗ đùi là 20 – 23 Ở Thừa Thiên Huế, nhông cát sinh sống ở hai vùng sinh cảnh khác nhau là vùng cát ven biển và vùng nương rẫy ở đồng bằng các xã Thuỷ Phù, Thuận An và Lộc Hải. Quan sát và theo dõi hoạt động của nhông cát ngoài tự nhiên, tác giả thấy rằng nhông hoa hoạt động ban ngày những hôm trời nắng với nhiệt độ không khí từ 30 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ 33 – 40oC và độ ẩm từ 30 – 78 %. Nhông sọc hoạt động ở nhiệt độ không khí từ 27 – 38oC, nhiệt độ mặt đất từ 27 – 59oC và độ ẩm 30 – 64 %. Chúng hoàn toàn không hoạt động vào những ngày mưa, trời âm u hoặc trước lúc bắt đầu mưa và về mùa đông (từ tháng XI – tháng III) khi nhiệt độ không khí nhỏ hơn 25oC và độ ẩm trên 90 %. Vào những ngày nắng nóng (nhiệt độ tren 38oC) chúng vẫn hoạt động với điều kiện là độ ẩm thấp. Ngoài ra vào những ngày nắng nóng nhiệt độ mặt đất tăng lên quá cao có thể trên 50oC, nhông cát vẫn hoạt động. Lúc đó chúng kiếm ăn trong các bóng râm hoặc chạy rất nhanh trên cát hoặc các cây cỏ khác. Từ tháng XI đến tháng III nhông cát trú đông trong hang. Vào thời kì này nhiệt độ trung bình trong hang xuống thấp từ 18,5 – 24,4oC, độ ẩm trung bình từ 83 – 92oC Về vấn đề sinh sản của nhông cát, tác giả lưu ý một số vấn đề sau: “Đối với loài nhông hoa, kích thước và khối lượng của tinh hoàn và của buồng trứng vào các tháng IV và VI lớn hơn các tháng còn lại. Trong khi đó khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng IV, V và VI và lớn hơn vào các tháng khác. Đối với nhông sọc, khối lượng của buồng trứng vào các tháng IV, VI và VII, trong khi khối lượng thể mỡ lại bé vào các tháng này và lớn hơn vào các tháng khác. Trứng có kích thước lớn hơn 4 mm chỉ thấy xuất hiện vào tháng IV và VI ở phân loài nhông hoa và vào tháng IV, VI và VII ở phân loài nhông sọc. Như vậy mùa sinh sản của nhông hoa là từ tháng IV đến tháng VI, của nhông sọc là từ tháng IV đến tháng VII hàng năm. Đặc biệt, trong tất cả những mẫu vật thu được ở Thuỷ Phù và Lộc Hải không có cá thể nào là đực nên đưa đến khả năng nhông sọc là loài thằn lằn trinh sinh, tức là trứng phát triển không có sự thụ tinh [4]. Tuy nhiên, tác giả cũng nhấn mạnh đây có phải là loài trinh sinh hay không vẫn còn là vấn đề nghi vấn và cần tiếp tục theo dõi. II. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ 1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. Trong những thập kỷ qua, nhờ sự phát triển của các kỹ thuật phân tử, phân loại học phân tử đã có những bước tiến bộ đáng kể. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về lĩnh vực này trên các đối tượng động vật, thực vật và vi sinh vật. Những thành tựu này đặc biệt có ý nghĩa đối với những loài mới được phát hiện hay với những loài đã bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Việc nghiên cứu tính đa hình các cá thể trong một quần đàn, các quần đàn trong một giống, các giống với nhau, các họ với nhau hoặc các bộ với nhau nhằm mục đích cải biến di truyền, chọn giống, hoàn thiện cây tiến hóa, tìm hiểu lịch sử di cư liên quan tới địa lý, nghiên cứu sự liên quan giữa tính đa hình và khả năng chống chịu bệnh tật hoặc dễ nhiễm bệnh và pháp y hình sự. Để nghiên cứu tính đa hình và phân loài người ta thường sử dụng các phương pháp sinh hóa cổ điển như isoenzyme đa hình, hay các phương pháp chỉ thị phân tử hiện đại như ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RADP), ADN đa hình chiều dài các phân đoạn được cắt giới hạn (RELP), ADN đa hình độ dài các phân đoạn được khuếch đại (AFLP), vi vệ tinh, đa hình nucleotide đơn (SNP) hay đọc trình tự rồi trực tiếp so sánh các trình tự ADN với nhau. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng có thể bổ sung cho nhau đêr hoàn thiện kết quả nghiên cứu. Đặc biệt khi các phương pháp phân loại hình thái đã bão hòa không thể đi sâu được nữa, thì các phương pháp sinh học phân tử sẽ trợ giúp một cách có hiệu quả. Năm 1993, Darevsky và Kupriyanova đã nghiên cứu phát hiện và mô tả một loài nhông mới thuộc giống Leiolepis CUVIER, 1829 có nguồn gốc từ Việt Nam là Leiolepis guentherpetersi. Đây là một trong hai loài nhông có mặt ở Thừa Thiên Huế. Các phân tích về hình thái, kiểu nhân và địa lý sinh vật học cho thấy rằng đây là loài tam bội có nguồn gốc từ sự lai tạo tự nhiên. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá ở mức độ phân tử đối với loài này. Turbeville et a. (1991) dựa trên sự phân tích 18S rRNA để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của chân khớp. Cũng bằng phương pháp này, Passhley et al. (1993) đã phân loại Bộ côn trùng biến thái hoàn toàn. Miya và Nishida (1998) đã nghiên cứu sự phát sinh chủng loại và tiến hóa ở mức độ phân tử của các loài cá sống ở vùng biển sâu thuộc giống Sternoptyx dựa trên phân tích gen mã hóa 12S – rRNA và 16S – rRNA ở ty thể. Boyce et al. (1999) nghiên cứu cấp phân loại phụ của quần thể cừu sừng lớn (Ovis canadensis) dựa trên phân tích 515 bp đầu tiên của vùng khởi động ADN ty thể. Nhiều nghiên cứu theo hướng đa dạng di truyền và nhận dạng các loài ở mức phân tử cũng đã được tiến hành (Carvalho et al. 2001; Garrjardo et al. 2002) 2.Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về hai loài nhông cát ở Thừa Thiên Huế. Tuy nhiên các công trình này chỉ nghiên cứu về hình thái, đặc điểm sinh học, đặc điểm quần thể, sinh thái học cũng như hoạt động ngày đêm của chúng (Ngô Đắc Chứng 1986, 1992, 1993, 1994). Ở Việt Nam nói chúng phân loại phân tử vẫn còn là một lĩnh vực mới mẻ. Gần đây một số công trình nghiên cứu theo hướng sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để phân tích đa hình di truyền, xác định quan hệ họ hàng của một số loài đã được công bố. Quyền Đình Thi và cộng sự (2003) đã sử dụng các kỹ thuật microsatellite, mtRFLP, RAPD để phân tích đa hình của các quần thể đàn tôm sú, cá tra nuôi ở Việt Nam. Nhóm nghiên cứu đã tìm được nhiều chỉ thị phân tử đặc trưng như RAPD để phân biệt các quần đàn cá tra nuôi trong các trại cá khác nhau. Những chỉ thị này có thể được nghiên cứu tiếp phục vụ công tác chọn giống [13]. Nguyễn Thị Thanh Bình và cộng sự (2005) đã nghiên cứu đa dạng phân tử của các giống tằm sử dụng trong sản xuất bằng PCR – RAPD. Cũng bằng kĩ thuật này, Đinh Thị Phương Anh (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng của thạch sùng vùng núi Bà Nà, Đà Nẵng [1,3]. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH Có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không giống nhau nhưng có thể bổ sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu. 1. Phương pháp isoenzyme cổ điển Enzyme là những protein có khả năng xúc tác đặc biệt phản ứng hóa học và là chất xúc tác sinh học. Isoenzym là những dạng khác nhau của một enzyme có cùng hoạt tính cơ chất đặc hiệu nhưng lại khác nhau về phương diện di truyền tức là khác nhau về cấu trúc bậc một và do các locus gene khác nhau xác định. Còn allozyme lại là các dạng khác nhau của một isoenzym do chỉ một locus gene xác định (Prakash, 1969) [7,10]. Hiện tượng các phân tử enzym có nhiều biến dạng tồn tại trong quần đàn tự nhiên là kết quả của các đột biến gây ra sự thay thế các acid amin trong cấu trúc bậc một của chuỗi polypeptid. Chính vì vậy khi điện di trên gel agarose, tinh bột thuỷ phân, polyacrylamide cùng với việc phối hợp nhuộm tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của phân tử enzyme, phát hiện các isoenzyme và các allozyme. Các hệ thống isozyne đa hình là các mô hình rất thuận lợi cho việc nghiên cứu, do bản chất di truyền tương đối đơn giản và hầu hết được biểu hiện di truyền đồng trội. Do đó khi sử dụng các dữ kiện về đa hình isozyme không những biết kiểu gen của cá thể mà còn biết mức độ dị hợp của quần đàn. Mặt khác, mỗi biến dạng phân tử enzyme là một “chỉ thị” của gene, nghiên cứu quan hệ họ hàng, nguồn gốc của vật nuôi, gia súc. Dựa trên tần số allele, người ta xác định được khoảng cách di truyền giữa các quần đàn. Nhiều nghiên cứu trên động vật, côn trùng, sử dụng các phương pháp đánh giá trên cho thấy số đo khoảng cách di truyền có tương quan rõ rệt với các thứ hạng phân loại của nhóm sinh vật nghiên cứu (Manwell và Barker, 1970; Namikawa, 1972) [7,10]. Những chỉ thị isozyme chỉ thể hiện ở những giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển cá thể tuỳ thuộc vào cơ chế phức tạp của sự đóng mở gene. Mặt khác do có số lượng không nhiều mà sự biểu hiện lại phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể, không phản ánh chính xác bản chất di truyền của một tính trạng nên chỉ thị isozyme được sử dụng tương đối hạn chế. 2. Các phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử ADN Chỉ thị ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình của ADN. Nó có thể là những dòng gene có sẵn hay dưới dạng những thông tin di truyền được lưu giữ và chuyển tải trong các file dữ liệu máy tính (ví dụ như trình tự các mồi SSR, RAPD, AFLP). Người ta chia chỉ thị ADN thành 3 loại chính: - Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết enzyme hạn chế (RFLP và AFLP). - Chỉ thị dựa trên các trình tự nucleotide ngẫu nhiên (RAPD). - Chỉ thị dựa trên các trình tự ngắn lặp lại nhiều lần (tiểu vệ tinh) 2.1. Phương pháp RAPD RAPD (Ramdon Amplified Polymorphism DNA) là các phân đoạn DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên. Phương pháp này do William (1990). Welsh và cộng sự (1991) phát triển từ phương pháp PCR chuẩn nhưng với một mồi duy nhất có kích trước từ 5 đến 12 nucleotide. Do kích thước bộ gen của một cá thể là rất lớn từ vài trăm triệu với vài tỉ base, là những chuỗi được hình thành từ bốn base duy nhất là adenine, guanine, cytosine, và thymine cho nên sẽ tồn tại nhiều trình tự 5 đến 12 base bắt cặp với trình tự mồi ngẫu nhiên. Sản phẩm PCR với một mồi có trình tự ngẫu nhiên như vậy, ở những điều kiện PCR nhất định sẽ cho một (hoặc vài) phân đoạn DNA (khác nhau) trên điện di đồ. Các cá thể sinh vật cùng loài, giống, họ có bộ gene giống nhau hoàn toàn giống nhau. Kết quả điện di trên điện di đồ sẽ gồm những band vạch DNA có kích thước như nhau. Khi bộ gen của chúng có nhiều trình tự khác nhau, với một mồi ngẫu nhiên nào đó, các sản phẩm PCR của chúng sẽ cho một số band vạch DNA có kích thước khác nhau trên điện di đồ. Phương pháp RAPD cho phép phát hiện tính đa hình giữa các cá thể trong một quần đàn, giữa các quần đàn trong cùng một loài hoặc giữa các loài trong một giống, mà không cần biết trình tự sắp xếp các nucleotide ra sao. Mặt khác mồi RAPD sẽ chỉ ra một đa hình thường xuất hiện nhất [12]. Mồi ngẫu nhiên được thiết kế là những oligonucleotide có kích thước từ 5 đến 12 nucleotide, và được tổng hợp hóa học. Tuỳ theo hãng sản xuất, các mồi có kí hiệu, tên gọi cũng như trình tự rất khác nhau. Yêu cầu cơ bản là mồi phải bắt cặp và bám vào hai đầu của đoạn khuôn, để phân đoạn DNA nằm giữa có kích thước khoảng 50 đến 5000 nucleotide được nhân lên. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao, và do đó số sản phẩm PCR càng nhiều. Ngược lại mồi càng dài thì thì độ bắt cặp chính xác càng lớn, số phân đoạn PCR càng ít đi. Ưu điểm của phương pháp RAPD là thời gian thực hiện nhanh, dễ làm và ít tốn kém, giúp cho xác định tính đa dạng sinh học, nguồn gốc các giống động vật, thực vật và vi sinh vật, còn gọi là phân loại phân tử [12]. 2.2. Phương pháp RFLP RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA) là DNA đa hình chiều dài các phân đoạn DNA được cắt giới hạn. Chỉ thị này lần đầu tiên được biết đến khi Botstein sử dụng nó để lập bản đồ các gen có liên quan đến bệnh ở người. Các RFLD được sinh ra bởi những điểm cắt enzyme giới hạn trong DNA hệ gen. Nó biểu thị sự khác nhau giữa các loại DNA, do những đột biến tự nhiên gây ra như đột biến gene tạo ra đặc điểm riêng biệt ở mọi giống, loài thậm chí mỗi cá thể. Bởi vậy khi sử dụng các enzyme hạn chế để cắt các phân đoạn DNA có kích thước gần như nhau không thể phân biệt được trên điện di đồ, thành các phân đoạn có nhỏ hơn có kích thước khác nhau thì có thể phân biệt được trên điện di đồ. Nếu hai trình tự phân đoạn DNA gần giống nhau hoàn toàn, tức là có một vài nucleotide khác nhau trong trình tự, thì thực sự rất khó phá