Luận văn Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn Streptomyces Dicklowii

cây trồng, người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên biện pháp này còn ít được nghiên cứu, việc ứng dụng trong sản xuất còn hẹp, giá thành cao. Biện pháp sinh học để phòng trừ bệnh cây được nghiên cứu ứng dụng theo 3 hướng sau: 40 Sử dụng các siêu ký sinh (ký sinh bậc 2): đó là các loại nấm, vi khuẩn, thực khuẩn thể, tuyến trùng ăn thịt…Có rất nhiều loài nấm sợi có khả năng gây bệnh cho sâu hại cây trồng như: Aschersoria sp., Beauveria bassiana, Conidiobolus obrus, Zoophthora radicans … đã được sử dụng để sản xuất các loại chế phẩm diệt sâu hại. Những loài được dùng phổ biến là nấm Bạch cương – Beauveria bassiana, nấm Lục cương – Metarrhizium anisoplia. Cơ chế gây hại của các loài nấm này là ký sinh và làm chết nhiều loại côn trùng gây hại (khoảng hơn 100 loài côn trùng) (xem hình 1.26). Một số loại vi khuẩn sống trong đất, phân chuồng như vi khuẩn Achrobacterium, Pseudomonas sống ký sinh trên nấm Fusarium gây bệnh hại cây trồng. Ngoài ra còn có nhiều loại nấm sống trong đất sống ký sinh trên cơ thể tuyến trùng hại cây. Hình 1.26: Sợi nấm Beauveria sp. mọc trên cơ thể côn trùng Sử dụng các vi sinh vật đối kháng và chất kháng sinh: các vi sinh vật đối kháng tiêu diệt hoặc ức chế sự hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu bằng các chất kháng sinh do bản thân vi sinh vật đối kháng sinh ra. Một số sinh vật đối kháng được biết: + Nấm Trichoderma harzianum ức chế nấm Botrytis cinerea hại cà chua, nấm Sclerotium rolfii hại lạc: Người ta thấy những điểm ký sinh và sự 41 quấn sợi nấm lên nấm bệnh Rhizoctonia solani (nguyên nhân gây bệnh khô vằn) (hình 1.27, 1.28) sợi nấm gây bệnh Pythium sp. bị quăn lại và chết từng đoạn khi bị Trichoderma sp. ký sinh và sau đó nấm Trichoderma sp. lấn áp và ức chế sợi nấm bệnh. a b Hình 1.27: a/ Nấm Trichoderma sp. ức chế Pythium sp. b/ Nấm Trichoderma sp ức chế Rhizoctonia solani. (www.vertigo.uqam.ca/.../ mathias_de_kouassi.html) Hình 1.28: Nấm Trichoderma harzianum ký sinh trên sợi nấm Rhizoctonia solani + Tuyến trùng Tylenchulus senipenetrans gây bệnh ở rể cây cam quít bị nấm Arthrobotrys dactyloides sống trong đất bắt bằng vòng tròng do chúng tạo ra và giết chết tuyến trùng. 42 Hình 1.29: Tuyến trùng Tylenchulus senipenetrans bị nấm Arthrobotrys dactyloides bắt bằng các vòng tròng do nó tạo ra và giết chết tuyến trùng. Sử dụng fitonxit: là chất đề kháng của cây, do cây trồng sản sinh ra, có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. Các chất fitonxit được nghiên cứu ứng dụng là từ củ hành, củ tỏi, rau ngải. Cụ thể người ta dùng nước tỏi, nước hành xử lý hạt giống để giảm nguy cơ mắc bệnh cho cây trồng. Xạ khuẩn – vai trò chống nấm gây hại cây trồng: Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật. Theo Kamada, khi điều tra vi sinh vật đối kháng trong đất ở Nhật cho thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn thì ở đó các loài Fusarium biến mất nhanh. Thông thường một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế nhiều loài nấm gây bệnh và được sử dụng như tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng các chủng có hoạt phổ rộng phải chú ý tránh xạ khuẩn ức chế luôn cả khu hệ sinh vật có lợi trong vùng rể. Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện có hoạt tính trong môi trường đất Xạ khuẩn ngoài việc chống nấm bằng cách tiết kháng sinh còn sinh enzym tác động lên hệ vi sinh vật. Ngoài ra, nhiều loại xạ khuẩn còn sinh ra các chất kích thích sinh trưởng đối với thực vật cũng như các loài vi sinh vật có lợi cho đất. 43 Trong số không nhiều các chủng xạ khuẩn vừa kháng được các nấm gây bệnh vừa giết được tuyến trùng hại cây trồng, chủng Streptomyces dicklowii là chủng xạ khuẩn được đánh giá cao trong lĩnh vực bảo vệ cây trồng. Chất kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii có khả năng tiêu diệt hàng loạt các loài nấm gây bệnh cho cây: Fusarium sp., Rhizoctonia solani, Pythium sp., Pyricularia oryzea; đồng thời chất kháng sinh này cũng có tác dụng rộng lên các nhóm tuyến trùng: Ditylenchus, Globodera, Meloidogyne, Tylenchulus,… (Zuckerman, 1996)cụ thể là: - Ức chế sự sinh sản và phát triển của tuyến trùng. - Gây chết tuyến trùng sống ký sinh trong cây và sống tự do trong đất. - Không gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của cây trồng. Với ưu thế chất kháng sinh có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp, phần lớn có tác dụng nội hấp, thời gian bán hủy ngắn nên không gây ô nhiễm môi trường, ngoài ra việc sử dụng những chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh vừa ức chế vi sinh vật gây bệnh vừa không sợ vi sinh vật gây bệnh kháng thuốc. Chính vì vậy nhiều quốc gia đã chế tạo nhiều chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cây mà xạ khuẩn đóng vai trò chính. - MYCOSTOP của Phần Lan (hình 1.30), chế phẩm này có khả năng khống chế các loại nấm gây hại cây trồng như: Fusarium sp, Pythium sp, Phytophthora gây hại lên bộ phận rể cây. chế phẩm trên ở dạng bột bao gồm bào tử và khuẩn ty của chủng Streptomyces được lựa chọn trong môi trường đất tự nhiên với thành phần chính là Streptomyces griseoviridis chủng 61. Chủng xạ khuẩn này có khả năng cạnh tranh với nấm hại cây trồng về không gian sống và thức ăn bằng việc tranh lấy vùng sống quanh rể cây nhưng chúng không gây hại cho cây. Những nghiên cứu của nhà sản xuất đã cho thấy Mycostop được cây trồng tiếp nhận và vụ mùa có thể tăng 5 -15%, tác dụng của chế phẩm đến cây trồng có thể thấy rõ sau 3 – 6 tuần sử dụng.(theo www.agbio-inc.com/Mycostop.htm) 44 Hình 1.30: chế phẩm Mycostop - ACTINOVATE Plus/M của Mỹ (hình 1.31), chế phẩm ở dạng lỏng và được sử dụng tưới phun, Actinovate với thành phần chính là Streptomyces lydicus chủng 108 đã khống chế được nấm bệnh hại cây trồng đồng thời chế phẩm trên đáp ứng được yêu cầu của cây trồng trong trường hợp cây bị thiếu hụt khoáng đa lượng và vi lượng. Hình 1.31: chế phẩm Actinovate. 1.3.2.2. Sử dụng kháng sinh trong lĩnh vực bảo vệ thực vật: Ở Trung Quốc, chất kháng sinh “120” từ chủng Streptomyces hygroscopicus đã phòng chống cho 330 triệu ha cây trồng và làm giảm bệnh từ 50 – 98,9% tuỳ theo từng loại bệnh. Ở Nhật Bản, người ta đã có các chế phẩm chống bệnh đạo ôn và khô vằn rất có hiệu quả như : - Validacin (Validamycin A): C20H35NO13 là chất kháng sinh từ Streptomyces hygroscopicus var. limoneus. Thuốc ở dạng bột dễ hút ẩm, chúng tan được trong nước và nhiều dung môi hữu cơ; thuốc được dùng để trừ 45 nấm Rhizoctonia solani hại khoai tây, bệnh khô vằn hại lúa. Dạng chế phẩm Validacin 3L dùng 1,5+ 1,7 lít/ha trừ bệnh khô vằn, 1,7+ 2lít/ha trừ bệnh khô vằn ngô, để trừ bệnh khô vằn cổ bông lúa cần phun thuốc trước khi lúa trổ 5 + 7 ngày. Hình 32: Chế phẩm Kasumin - Kasumin (Kasugamycin): (hình 1.32) C14H28ClN3O10 là chất kháng sinh của Streptomyces kasugaensis. Thuốc ở dạng tinh chế, tan trong nước. Thuốc được sản xuất thành dạng dung dịch 2%, dạng bột thấm nước 2% và 5%, dạng hạt 2% và dạng hỗn hợp có tên là Kasuran 50WP (5% Kasumin +75,6% CuOCl = 45% Cu.) pha nước ở nồng độ 0,1% để phòng trừ bệnh phấn trắng, bệnh thối dưa chuột, dưa hấu, một số bệnh vi khuẩn và nấm hại chè, cam, chanh, cà chua, khoai tây; Kasurabcide (1,2% kasumin + 20% Fthalide) dạng bột thấm nước dùng 1,5kg/ha trừ đạo ôn, đốm sọc, vi khuẩn hại lúa. (Vũ Triệu Mân, 1998) (theo www.fedearroz.com) 46 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệu: 2.1.1. Các chủng vi sinh vật: - Streptomyces dicklowii (do phòng thí nghiệm bộ môn vi sinh trường Đại học sư phạm tp.HCM cung cấp). - Vi sinh vật kiểm định: nhận từ trường Đại học Y tp.HCM. ● Bacillus subtilis.(hình 2.1) ● Streptococcus sp.(hình 2.1) ● Echerichia coli (hình 2.1) Bacillus subtilis Echerichia coli Streptococcus sp. Hình 2.1: Các vi khuẩn kiểm định - Các chủng nấm gây bệnh cây trồng: nhận từ trung tâm nghiên cứu sản xuất hóa chất nông dược, thành phố HCM. ● Rhizoctonia solani. ● Fusarium oxysporum. ● Pythium sp. ● Sclerotium sp. ● Colletotrichum sp. 2.1.2. Các thiết bị: ● Máy lắc tròn – Gerhardt ● Cân điện – Sartorius. ● Máy đo pH – Hanna. 47 ● Tủ ấm – Memmert. ● Máy ly tâm – Hettich. ● Máy cô chân không – Heidolph (Germany) ● Nồi cách thủy. 2.1.3. Các môi trường sử dụng trong đề tài: Môi trường Gauze – 1(g/l) – MT1: Tinh bột tan 20g K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,5g KNO3 1,0g NaCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường Gauze – 2(g/l) – MT2: Peptone 5g Glucose 10g Cao thịt 5g NaCl 5g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường khoai tây (g/l) – MT3: khoai tây 300g Glucose 50g H2O 1000ml Cách làm : khoai tây cắt hạt lựu nấu với nước cất sau đó lọc lấy dịch trong ; bổ sung nước cho đủ 1000ml. Môi trường Czapek – dox (g/l) – MT4: Saccarose 30g NaNO3 3,5g K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường phân giải tinh bột (g/l) – MT5: Tinh bột tan 10g KH2PO4 1g 48 Peptone 5g MgSO4.7H2O 5g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường phân giải Protein – môi trường Frazie (g/l) – MT6: Gelatin 20g NaCl 3g K2HPO4 1,5g KH2PO4 1,5g Saccarose 0,05g Peptone 0,25g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường phân giải Cellulose (g/l) – MT7: CMC 20g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g NaNO3 3,5g Cao nấm men 0,1g K2HPO4 1,5g FeSO4.7H2O 0,1g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường ISP1 (g/l) – MT8: Trypton 5g Cao nấm men 3g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường ISP4 (g/l) – MT9: Tinh bột tan 10g CaCO3 2g K2HPO4 1g FeSO4.7H2O 0,001g MgSO4.7H2O 1g NaCl 1g (NH4)2SO4 2g ZnSO4.7H2O 0,001g MnCl2.7H2O 0,001g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường cơ sở (g/l) – MT10: 49 Dung dịch muối cơ sở: K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 1,5g NaCl 1,5g CaCO3 3g H2O 450ml Dung dịch muối vết: CuSO4 0,064g FeSO4.7H2O 0,11g MnCl2.7H2O 0,79g ZnSO4.7H2O 0,15g H2O 100ml Cách pha lấy 0,1ml dung dịch muối vết vào 30ml dung dịch muối cơ sở, sau đó bổ sung nước cất cho đủ 50ml. Môi trường vi khuẩn kiểm định – MPA (g/l) – MT11: Cao thịt 3g Peptone 10g NaCl 5g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường A – 4 (g/l) – MT12: Glucose 10g NaCl 5g Bột đậu tương 10g CaCO3 1g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường A – 4H (g/l) – MT13: Glucose 15g Bột đậu tương 15g NaCl 5g CaCO3 1g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường A – 12 (g/l) – MT14: Tinh bột tan 10g Rỉ đường 10g 50 Bột đậu tương 10g K2HPO4 2g CaCO3 1g NaCl 5g Agar 20g H2O 1000ml Môi trường khoai tây glucose agar – PGA (g/l) – MT15: Khoai tây 300g Glucose 50g Agar 20g H2O 1000ml Nước muối sinh lý 0,8% - MT16: H2O 1000ml NaCl 8g Môi trường nước chiết khoai tây – MT17: Khoai tây 300g Glucose 50g Nước cất 1000ml Dung dịch lugol: Iot 2,5g KI 5g H2O 1000ml Thuốc thử Salkowski: FeCl3 0,5M 15ml H2SO4 98% 300ml H2O 500ml Môi trường khảo sát khả năng sinh IAA: sử dụng môi trường ISP4 bổ sung 0,1g/l L-Triptophan. Thuốc thử Ninhydrin: Ninhydrin 0,1g Nước cất 100ml 51 Thuốc thử fehling: - Dung dịch A: CuSO4 35g H2SO4đđ 6ml Thêm nước đến 1000 ml - Dung dịch B: NaOH 33% 375ml C4H4O6KNa 200g Thêm nước cất đến 1000 ml - Pha dung dịch A và dung dịch B theo tỉ lệ 1:1 2.2. Phương pháp: 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật: 2.2.1.1. Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn: Đặt vào đĩa petri một miếng giấy lọc đã tẩm ẩm nước cất vô trùng, để miếng lam vô trùng lên đĩa petri sau đó đặt miếng thạch có kích thước 5mm x 5mm (môi trường MT1) cuối cùng dùng que cấy đầu tròn cấy xạ khuẩn (lấy từ ống giống thạch nghiêng) lên 4 cạnh đứng của miếng thạch, xong, đậy miếng lamen lên miếng thạch nuôi ở nhiệt độ phòng sau 2 – 3 ngày đem quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x100, thị kính x10. 2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch: Nguyên tắc: Để xác định hoạt tính kháng sinh người ta dựa vào sự khuếch tán kháng sinh trong thạch. Chổ nào có chất kháng sinh khuếch tán thì nơi đó vi khuẩn kiểm định bị ức chế bởi chất kháng sinh sẽ không mọc được và sẽ tạo thành vòng vô khuẩn. Hoạt tính kháng sinh được xác định bằng hiệu số giữa đường kính vòng vô khuẩn và đường kính lỗ đục. Hoạt tính kháng sinh = (D – d) mm 52 D: đường kính vòng vô khuẩn. d: đường kính lổ đục (d = 8mm) Phương pháp: Môi trường MT11 sau khi hấp khử trùng để nguội khoảng 45OC cho dịch nuôi cấy vi khuẩn kiểm định vào (với lượng 2ml giống/200ml môi trường) lắc đều và đổ ra đĩa petri (15ml/đĩa). Dùng khoang lá đục lỗ thạch, xong nhỏ dịch nuôi cấy xạ khuẩn vào lổ thạch; giữ đĩa thạch ở nhiệt độ thấp 4OC trong 3 – 5 giờ, lấy ra để ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ, thu kết quả. 2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối sinh vật: Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov [3], sinh khối được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối. Lấy 100ml dịch lên men lọc qua giấy lọc sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa sạch hệ sợi xạ khuẩn lần lượt bằng dung dịch HCl 1N và nước cất. Sấy khô ở 80 - 100oC tới trọng lượng không đổi. Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch giữa trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và trọng lượng tờ giấy lọc khô đã cân trước đó. 2.2.2. Phương pháp hóa sinh. 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn: - Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải tinh bột: Nguyên tắc: tinh bột khi gặp thuốc thử Lugol (có thành phần Iot) sẽ bắt màu xanh đậm. Nên chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzym phân giải tinh bột sẽ làm cho môi trường không bắt màu nơi tinh bột bị phân giải và ngược lại sẽ có màu xanh đậm khi enzym chưa khuếnh tán đến phân hủy tinh bột. Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đó chấm một điểm ở giữa đĩa petri có chứa môi trường MT5, sau 5 ngày nuôi cấy trong nhiệt độ phòng ta dùng Lugol nhỏ vào xung 53 quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt môi trường để yên trong vài phút; quan sát và đo đường kính vòng phân giải, đường kính khuẩn lạc. Hiệu suất phân giải tinh bột được tính bằng hiệu số của đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc. - Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải Cellulose: Nguyên tắc: Cellulose khi tác dụng với thuốc thử Lugol sẽ bắt màu đỏ huyết. Nên chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzym phân giải Cellulose sẽ làm cho môi trường không bắt màu với thuốc thử Lugol nơi Cellulose bị phân giải và chổ có sự hiện diện của Cellulose sẽ bắt màu với Lugol và có màu đỏ huyết. Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đó chấm một điểm ở giữa đĩa petri có chứa môi trường MT7, sau 6 ngày nuôi cấy trong nhiệt độ phòng ta dùng Lugol nhỏ vào xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt môi trường để yên trong vài phút; quan sát và đo đường kính vòng phân giải, đường kính khuẩn lạc. Hiệu suất phân giải Cellulose được tính bằng hiệu số của đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc. - Phương pháp xác định khả năng sinh enzym phân giải Protein: Nguyên tắc: Protein (gelatin) sẽ bị kết tủa khi tác dụng với acid TCA 10% làm cho môi trường hóa đục. Nên khi xạ khuẩn có khả năng phân giải được protein thì khi nhỏ TCA 10% thì nơi không có hiện diện Protein sẽ không tủa và ngược lại nơi có sự hiện diện Protein sẽ tạo tủa làm cho môi trường có màu trắng đục. Phương pháp: cho 3ml nước cất vào ống thạch nghiêng lắc nhẹ cho bào tử trộn đều với nước tạo dịch huyền phù. Dùng que cấy thẳng nhúng vào dịch huyền phù sau đó chấm một điểm ở giữa đĩa petri có chứa môi trường MT6, sau 6 ngày nuôi cấy trong nhiệt độ phòng ta dùng TCA 10% nhỏ vào xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn và tráng đều trên bề mặt môi trường để yên 54 trong vài phút; quan sát và đo đường kính vòng phân giải, đường kính khuẩn lạc. Hiệu suất phân giải Protein được tính bằng hiệu số của đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc. 2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật (ß – indole acetic acid (IAA)): IAA là một kích thích tố sinh trưởng đối với thực vật thuộc nhóm auxin. Dựa vào đặc điểm tryptophan là tiền chất để tổng hợp nên IAA, người ta đã đưa ra nhiều phương pháp nhằm xác định sự hiện diện cũng như hàm lượng IAA được tổng hợp. Chúng tôi chọn phươngpháp hóa học để phát hiện IAA thông qua thuốc thử Salkowski cải tiến (IAA cho màu hồng nhạt với FeCl3 - một thành phần của thuốc thử Salkowski cải tiến). 2.2.2.2.1. Định tính IAA: hay phương pháp xác định nhanh khuẩn lạc sinh IAA. Chủng xạ khuẩn được cấy vạch trên môi trường ISP4 có bổ sung L- triptophan ( 0,1g/l). Đặt khoang giấy lọc vô trùng lên trên vết cấy, sau đó nuôi cấy trong nhiệt độ phòng với thời gian là 5 ngày; đến ngày thứ 5 lấy khoang giấy lọc ra đặt lên mặt thạch một khoang giấy lọc khác đã bảo hòa trong thuốc thử Salkowski cải tiến. Nếu vùng giấy lọc ứng với vết cấy xạ khuẩn chuyển sang màu hồng nhạt thì chủng xạ khuẩn đó có khả năng sinh tổng hợp IAA. 2.2.2.2.2. Định lượng IAA: Xác định hàm lượng IAA thô và các hợp chất tương tự - dựng đồ thị chuẩn IAA: - Nguyên tắc: IAA và các hợp chất tương tự tác dụng với thuốc thử Salkowski cải tiến sẽ cho màu vàng nhạt đến hồng đậm phụ thuộc vào hàm lượng IAA thô và các hợp chất tương tự mà bắt màu với thuốc thử. - Dựng đường chuẩn: Pha IAA tinh khiết ở các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml ở môi trường kiềm. ở mỗi nồng độ IAA nói trên, lấy 2ml cho vào các ống nghiệm 55 chứa 8 ml thuốc thử Salkowski cải tiến, so màu ở bước sóng 530 nm. Đối chứng là 2ml nước cất + 8ml thuốc thử. Dựa vào chỉ số OD và nồng độ IAA để vẽ đường chuẩn. - Xác định hàm lượng IAA thô trong dịch nuôi cấy: Chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường ISP4 nuôi cấy lắc ở tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 5 ngày. Sau đó thu dịch nuôi cấy qua ly tâm ở tốc độ 4500 vòng/ phút trong 15 phút, lấy dịch trong. Nhỏ 2ml dịch nuôi cấy sau ly tâm vào ống nghiệm chứa sẳn 8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, đối chứng là 2ml nước cất + 8ml thuốc thử. Lắc đều, để yên trong 20 phút. So màu trên máy đo quang phổ ở bước sóng 530nm. Chỉ số OD được đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA trong dịch nuôi cấy. Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µmIAA/ml. 2.2.3. Phương pháp hóa lý. 2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh: Xạ khuẩn được nuôi lắc (200 vòng/phút) trên môi trường MT3 (pH = 7). Sau 96 giờ lấy dịch nuôi cấy ly tâm 3000 vòng/phút, trong 5 phút loại bỏ sinh khối đem đun ở các ngưỡng nhiệt độ: 40OC, 60OC, 80OC, 100OC kéo dài ở các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút. Làm nguội và xác định hoạt tính kháng sinh. 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh: Ở đây, chúng tôi trình bày phương pháp tách chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ. Chất kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp có thể nằm trong sinh khối và trong dịch nuôi cấy; vì vậy để tách chiết các kháng sinh trong sinh khối và dịch nuôi cấy xạ khuẩn thì cần phải lựa chọn dung môi thích hợp cho từng phương pháp tách chiết kháng sinh. - Ở phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối: khảo sát trên các dung môi: Aceton, Etyl acetat, Etanol, Metanol, n- Butanol, Izo-probanol. 56 - Ở phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy: khảo sát trên các dung môi : n-Butanol, n-Probanol, Toluen, Clorofooc. Trên cơ sở kiểm tra họat tính kháng khuẩn của kháng sinh thô sau khi tách chiết bởi phương pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá dung môi nào có khả năng tách chiết kháng sinh nhiều nhất sẽ được lựa chọn cho qui trình tách chiết kháng sinh, áp dụng cho cả 2 phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối và dịch thể. Trong qui trình tách chiết kháng sinh có những đặc điểm tách chiết như sau: Sau khi kết thúc quá trình nuôi cấy xạ khuẩn, các quá trình biến đổi vẫn tiếp tục xảy ra trong dịch nuôi cấy sẽ làm biến đổi những sản phẩm sau nuôi cấy thành những dẫn xuất, để tránh hiện tượng này chúng tôi bổ sung vào dịch nuôi cấy HCl 10% đến pH = 3,0 – 3,5 trong dịch nuôi cấy. Sau đó tách sinh khối ra khỏi dịch nuôi cấy qua ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút. Lúc bấy giờ, chúng ta sẽ tiến hành tách chiết chất kháng sinh từ sinh khối và dịch thể như sau: - Phương pháp tách kháng sinh từ sinh khối: phần sinh khối sau khi tách khỏi dịch nuôi cấy được tiến hành rữa bằng nước cất 2 lần, cho dung môi vào khuấy đảo liên tục ở nhiệt độ 45OC kéo dài 30 phút – pH = 7,0 sau đó tách sinh khối bằng ly tâm (3000 vòng/phút trong 5 phút) thu dịch lọc. Dịch lọc được cô chân không còn lại 1/3 sau đó làm giảm sự hoà tan của chất kháng sinh ở điều kiện nhiệt độ = 4OC làm chất kháng sinh tủa, thu chất kháng sinh tủa bằng phương pháp ly tâm rồi đem thử họat tính kháng sinh. - Phương pháp tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy: dịch chiết sau khi tách sinh khối được chỉnh pH = 7,0 – 8,0 bằng NaOH 1N rồi cho dung môi dùng tách chiết kháng sinh vào với tỉ lệ 4: 6 (dung môi : dịch nuôi cấy sau khi tách sinh khối), đưa tòan bộ vào bình lóng để tách lớp, thu lớp dung môi có kháng sinh hòa tan đem cô chân không còn 1:15. Tương tự như phương pháp tách chiết kháng sinh từ sinh khối, kháng sinh tủa ở nhiệt độ = 4OC có bổ sung thêm aceton, việc bổ sung aceton (hay etanol) nhằm làm giảm sức căng 57 bề mặt giữa chất hoà tan (chất kháng sinh) và dung môi làm cho sự tủa chất hoà tan trở nên dễ dàng hơn. Kháng sinh thô được đem kiểm tra họat tính kháng sinh. - Tinh sạch kháng sinh: để lọai bỏ các tạp chất có đặc tính hòa tan được trong dung môi tách chiết giống như chất kháng sinh người ta dùng phương pháp: thay đổi dung môi tách chiết. Có thể hiểu chất kháng sinh thô gồm: chất kháng sinh và một số tạp chất có tích chất tương tự chất kháng sinh, hoà tan được trong butanol. Hoà chất kháng sinh thô cần làm tinh sạch vào metanol (là dung môi tách chiết tốt kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii) rồi thu kháng sinh bằng phương pháp tủa ở nhiệt độ thấp (4OC); cuối cùng hoà chất kháng sinh vào aceton (là dung môi phân cực giống như metanol nhưng aceton có độ phân cực thấp nhất và thu kháng sinh tinh khiết ở dạng tủa. Qui trình tách chiết được trình bày tóm tắt như sau: 58 Hình 2.2: Sơ đồ tách chiết kháng sinh (Lê Gia Hy, 1995) 2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhóm chức trong cấu trúc hóa học của chất kháng sinh: Nguyên tắc: dùng những phản ứng hoá học để phân biệt các nhóm chức trong chất kháng sinh, việc xác định các nhóm chức trong cấu trúc hoá học của chất kháng sinh được tiến hành bằng cách dựa vào những phản ứng màu đặc trưng để xác định qua đó có thể sơ bộ phân loại chất kháng sinh theo cấu trúc. (Lê Ngọc Thạch, 2002) - Xác định vòng lacton trong cấu trúc của chất kháng sinh qua phản ứng với acid H2SO4đđ : cho chất kháng sinh vào ống nghiệm có sẳn 4ml H2SO4đđ với sự hiện diện của vòng lacton sẽ làm cho dung dịch có màu đỏ thẩm. 59 - Xác định nhóm –OH bằng phản ứng màu với H3PO4đđ : nếu phản ứng có màu chứng tỏ chất kháng sinh có vòng macrolid. - Xác định nhóm chức amin bằng phản ứng màu đặc trưng với Ninhydrin: cho chất kháng sinh đã tinh sạch vào ống nghiệm có sẳn 4ml ninhydrin, đun nóng. Nếu có hiện diện acid amin và liên kết peptid thì sẽ xuất hiện màu xanh tím. Có thể giải thích hiện tượng này như sau: nếu có hiện tượng dezamin hóa oxyhóa và decacboncyl hóa . Lúc đó sẽ tạo thành NH3, CO2, và aldehyt tương ứng. Do có xuất hiện NH3 sẽ xảy ra phản ứng diceto-oxy-hydrinden (pH lớn hơn 4) tạo phức mới, phức này tiếp tục chuyển sang dạng enol và kết hợp thêm một NH3 để tạo chất có màu tím xanh (tím Ruheman). - Xác định nhóm đường hay nhóm aldehyde bằng phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử Fehling: nguyên tắc các aldehyde dễ dàng bị oxy hoá bởi thuốc thử Fehling. Cho vào ống nghiện 2ml dung dịch Fehling A (có màu xanh dương) và 2ml dung dịch Feling B (không màu)lắc đều sau đó cho chất kháng sinh tinh sạch vào và đun cách thủy vài phút. Nếu có hiện diện các nhóm aldegyde sẽ có phản ứng khử Cu++ thành Cu+ , dung dịch có màu đỏ gạch kềt tủa dưới đáy ống nghiệm. - Xác định nhóm chức phenol ( )bằng phản ứng màu đặc trưng với FeCl3: nguyên tắc đa số phenol tạo thành phức chất có màu với FeCl3. Cho dung dịch FeCl3 5% vào 5ml dung dịch có chất kháng sinh cần xác định đun sôi nhẹ và xem màu của dung dịch, mỗi loại phenol cho màu khác nhau. Như vậy nếu phản ứng có sự thay đổi màu sắc thì có sự hiện diện của nhóm chức phenol trong cấu trúc phân tử của chất kháng sinh. - Với KMnO4 để xác định nối đôi C = C (Alken): theo tính chất của các nhóm hữu cơ thuộc nhóm Alken, Alken làm phai màu dung dịch KMnO4 trong nước. Cho chất kháng sinh cần xác định vào từ từ và lắc thật mạnh với du