Luận văn Khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư dạ dày của một số rau xanh Việt Nam

thư dạ dày (BGC-823) có nguồn gốc từ ngân hàng tế bào Học viện Khoa học Trung Quốc, Thượng Hải, Trung Quốc. - Rau sam (Portulaca oleracea), rau diếp cá (Houttuynia cordata), và rau nhút (Neptunia oleracea) được mua ở các cửa hàng rau sạch đạt tiêu chuẩn Vietgap trên địa bàn quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh. - Dụng cụ, thiết bị, hóa chất Dụng cụ Thiết bị Hóa chất Ống nghiệm Cân Thuốc thử Folin- Ciocalteu Eppendorf Tủ sấy ABTS+ Falcon Máy cô quay MTT Becher Bếp đun cách thuỷ Môi trường DMEM Ống đong Tủ lạnh TCA 10% Pipet thuỷ tinh Tủ cấy K3[Fe(CN)6] Micropipet Máy đo quang phổ FeCl3 1% Bình định mức Bếp khuấy từ Axit gallic Cuvette Máy lắc vortex Vitamin C Microplate Tủ ủ CO2 DPPH 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tách chiết Mẫu rau được rửa sạch và cắt nhỏ (1 cm) trước khi đem phơi trong bóng râm 2 ngày. Mẫu sau đó được sấy ở tủ sấy với nhiệt độ 50 OC trong 3 ngày và sau đó được xay thành bột bằng cối xay sinh tố. Bột nguyên liệu khô được ngâm trong ethanol 96% theo tỷ lệ (1:8, w/v), ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ trong tủ lắc. Dịch chiết được thu nhận sau 24 giờ và lập lại quá trình chiết 3 lần. 28 Tất cả dịch chiết được tổng hợp lại và tiến hành cô quay chân không ở 40 OC để thu cao chiết tổng. Cao chiết thu nhận được sấy ở tủ sấy 50 OC đến khi đạt độ ẩm theo yêu cầu thì được cất giữ trong tủ lạnh 4 OC cho đến khi sử dụng. Cao tổng được sử dụng để tách chiết các cao phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng thông qua các dung môi có độ phân cực khác nhau như hexan, CH2Cl2, EtOAc, và Buthanol. Cao chiết tổng được hòa trong nước cất theo tỷ lệ 1:1 (w/v) trước khi được hòa với dung môi hexan theo tỷ lệ 1:1 (v/v). Hỗn hợp trong bình chiết được lắc kỹ và sau đó giữ yên đến khi có sự phân lớp hoàn toàn. Phân lớp hexan được chiết ra và quá trình lại lặp lại thêm 2 lần nữa. Phân đoạn hexan được cô quay chân không ở 40 OC và cao phân đoạn được sấy trong tủ sấy đến khi đạt độ ẩm theo yêu cầu. Tương tự như vậy, quy trình được lặp lại với các dung môi khác như CH2Cl2, EtOAc, và Buthanol. Công thức tính hiệu suất chiết cao: H (%)= Khối lượng cao thu được × (100−độ ẩm của cao) Khối lượng nguyên liệu ban đầu × (100−độ ẩm của nguyên liệu) × 100 2.3.2. Xác định độ ẩm mẫu Xác định độ ẩm của nguyên liệu là xác định tỉ lệ phần trăm lượng nước có trong nguyên liệu đó, nhằm kiểm tra xem nguyên liệu để nghiên cứu có đạt yêu cầu về độ ẩm hay không. Đồng thời, độ ẩm nguyên liệu còn cần thiết trong việc tính hiệu suất chiết cao. Độ ẩm mẫu được xác định nhờ vào máy cân sấy ẩm. Để đo được hàm lượng ẩm, khối lượng ban đầu của mẫu được ghi lại, sau đó đèn gia nhiệt của máy sẽ nóng lên đến nhiệt độ 120 OC và sấy khô mẫu đồng thời cũng tiến hành ghi khối lượng mẫu cho đến khi khối lượng không đổi, quá trình này ngừng lại, độ ẩm được ghi nhận. Tiến hành: cho mẫu vào máy với khối lượng quy định (≥ 0.5g), vận hành máy và ghi lại kết quả, lặp lại 3 lần, sau đó lấy giá trị trung bình. Độ ẩm được tính theo công thức: X (%) = (𝑎−𝑏) × 100 𝑎 29 Trong đó: - X: Độ ẩm của mẫu (%) - a: Khối lượng trước khi sấy (g) - b: Khối lượng sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) 2.3.3. Xác định hàm lượng tro toàn phần Cân chính xác 2,0 gam (m, gam) bột mẫu trong một chén nung đã được xác định khối lượng bì (m0, gam). Đem nung trong lò nung từ nhiệt độ 300 OC sau đó gia nhiệt từ từ lên đến 600 OC sao cho không để tạo thành ngọn lửa. Tiếp tục duy trì quá trình nung đến khi phần mẫu được tro hóa hoàn toàn, phần tro chuyển thành màu trắng. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân xác định khối lượng (m1, gam). Mẫu thử được thực hiện lặp lại ba lần và kết quả được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± SD. So sánh kết quả trung bình với yêu cầu chất lượng để kết luận. Hàm lượng tro toàn phần (A) được tính theo công thức sau: A (%) = [(m1 – m0) × 100]/m 2.3.4. Định lượng hợp chất phenol trong cao chiết Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu để xác định hàm lượng polyphenol tổng. Đường hiệu chuẩn là axit galic. Đo độ hấp thụ cực đại bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 765 nm. Tổng hàm lượng polyphenol được thể hiện tương đương axit galic trên mẫu gram cao chiết (mg GAE/g cao khô). Hàm lượng polyphenol tỉ lệ thuận với cường độ màu. Từ giá trị OD đo được, có thể xác định hàm lượng polyphenol tổng [68]. Tiến hành:  Dựng đường chuẩn axit galic - Pha dung dịch axit gallic có nồng độ 100 g/ml. Sau đó, pha dung dịch axit gallic theo dãy nồng độ 0, 20, 40, 60, 80, và 100 g/ml. - Lần lượt cho vào các eppendorf chứa 100 l dung dịch axit gallic theo từng nồng độ đã pha như trên 500 l Folin 10%, lắc đều và để yên 5 phút. Tiếp tục, cho 400 l Na2CO3 7,5% vào, lắc đều và ủ trong tối 60 phút. Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 765 nm. 30  Xử lý mẫu và xác định hàm lượng polyphenol trong cao chiết - Cân 0,001 g cao pha với 1 ml DMSO để được dung dịch cao của các loại rau có nồng độ 1000 g/ml. - Thực hiện tương tự như trên, thay dung dịch axit gallic bằng dung dịch cao chiết của các loại rau. - Dựa vào đường chuẩn axit galic và giá trị OD đo được của mẫu cao, xác định được hàm lượng polyphenol tổng theo công thức: 𝐆𝐀𝐄(mg/𝑔𝑐𝑎𝑜 𝑡ổ𝑛𝑔) = A − b a . 10−3 . 100 (100 − LOD) . V𝑚ẫ𝑢 m . K Trong đó: - A : Độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng 765 nm; - a : Độ dốc (slope) của đường chuẩn; - b : Hệ số chắn (intercept) của đường chuẩn; - m : Khối lượng mẫu cao (g); - Vmẫu : Thể tích mẫu tham gia phản ứng (ml); - LOD : Độ hao hụt khối lượng (%); - K : Hệ số pha loãng. 2.3.5. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa thông qua quét gốc DPPH Nguyên tắc: Các chất kháng oxy hoá sẽ trung hoà gốc tự do DPPH, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần, chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang OD càng thấp chứng tỏ bắt gốc tự do DPPH càng cao [69]. Tiến hành: - Pha dung dịch cao theo dãy nồng độ: 10, 20, 50, 80, 1000 µg/ml (cao chiết ethanol) và 10, 20, 40, 60, 80 µg/ml (EtOAc). - Pha dung dịch Vitamin C theo dãy nồng độ: 5, 7.5, 10, 15, 20 µg/ml. - Cho 0,1 ml dung dịch cao vào microplates. Kế đó cho 0,1 ml dung dịch DPPH 0,1 mM vào, ủ trong vòng 30 phút ở điều kiện thiếu sáng rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. - Đối với mẫu đối chứng cũng sẽ tương tự nhưng mẫu trắng bao gồm cao chiết và methanol, mẫu đối chứng dương gồm Vitamin C và DPPH. 31 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao và Vitamin C bằng phương pháp DPPH Hoá chất Mẫu phân tích Mẫu đối chứng âm Mẫu đối chứng dương Cao chiết (ml) 0,1 0 0 Vitamin C (ml) 0 0 0,1 DMSO (ml) 0 0,1 0 DPPH 0.1 mM (ml) 0,1 0,1 0,1 Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức dưới đây: % bắt gốc tự do=[1- ( OD's OD'c )] × 100 Trong đó: - OD’s là độ hấp thụ của mẫu phân tích/mẫu đối chứng dương - OD’c là độ hấp thụ của mẫu đối chứng âm Tính giá trị IC50 và so sánh khả năng bắt gốc tự do giữa Vitamin C và cao chiết. 2.3.6. Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng phương pháp ABTS+ Nguyên tắc: ABTS+ là một gốc tự do bền, màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất kháng oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất kháng oxy hóa sẽ khử ion ABTS+ thành ABTS (2,2’-azinobis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate). Sự giảm độ hấp thu của dung dịch ABTS+ ở bước sóng 734 nm chính là hiệu suất kháng oxy hóa của chất khảo sát [70]. Tiến hành: - Đầu tiên là pha loãng ABTS+ với nước cất sao cho dung dịch ABTS+ có độ hấp thụ 0,7 ± 0,002 đo ở bước sóng 734 nm. - Pha dung dịch cao theo dãy nồng độ: 10, 20, 50, 80, 100 µg/ml (cao ethanol), 10, 20, 40, 60, 80 µg/ml (EtOAc), và dung dịch Vitamin C theo dãy nồng độ: 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml. 32 - Cho 0,2 ml dung dịch cao phản ứng với 1,8 ml dung dịch ABTS+ trong 6 phút ở điều kiện thiếu sáng. Sau đó, đo độ hấp thụ ở bước sóng 734 nm. Đối với mẫu đối chứng, thay thế dung dịch cao bằng DMSO. Dung dịch Vitamin C cũng được thực hiện tương tự, nhưng mẫu đối chứng thay Vitamin C thành nước cất. Bảng 2.2. Bố trí thí nhgiệm khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao và Vitamin C bằng phương pháp ABTS+ Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức dưới đây: % bắt gốc tự do=[1- ( OD's OD'c )] × 100 Trong đó: - OD’s là độ hấp thụ của mẫu phân tích/ mẫu vitamin C - OD’c là độ hấp thụ của mẫu đối chứng cao/ mẫu đối chứng vitamin C Tính giá trị IC50 và so sánh khả năng bắt gốc tự do của cao và vitamin C. 2.3.7. Khảo sát độc tính của cao chiết lên tế bào Nguyên tắc: muối 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) khi được vận chuyển vào trong tế bào sẽ bị khử ở ty thể bởi enzyme mitochondria reductase tạo ra sản phẩm là formazan ở dạng tinh thể có màu tím có cực đại hấp thu ở khoảng 540 nm. Formazan sau khi tổng hợp được tích lũy trong ty thể, giải phóng ra ngoài khi phá vỡ tế bào và được hòa tan trong DMSO. Formazan giải phóng ra sẽ được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang [71]. Khả năng khử MTT thành formazan của tế bào cho thấy sự Hoá chất Mẫu đối chứng Cao Mẫu cao Mẫu đối chứng Vitamin C Mẫu Vitamin C Mẫu cao (ml) 0 0,2 0 0 Vitamin C (ml) 0 0 0 0,2 DMSO (ml) 0,2 0 0 0 Nước cất (ml) 0 0 0,2 0 ABTS+ (ml) 1,8 1,8 1,8 1,8 33 nguyên vẹn của ty thể, hay sự sống sót của tế bào. Do vậy, nếu tế bào được nuôi trong môi trường có chất thử nghiệm và MTT, tạo ra cường độ màu của formazan càng đậm chứng tỏ sự sống sót của tế bào càng cao, độc tính của chất thử nghiệm lên tế bào càng thấp. Tiến hành: quy trình được tiến hành theo mô tả của Hansen và cộng sự với một số điều chỉnh. Tế bào ung thư dạ dày được nuôi trong môi trường DMEM chứa 10% FBS, 5% CO2 và ở nhiệt độ 37 OC. Chuyển 200 µL tế bào lên các giếng trên đĩa 96 giếng, tiếp tục nuôi đến khi số lượng tế bào đạt đến mật độ khoảng 5×103 tế bào/giếng. Rửa nhẹ tế bào trong giếng 2 lần bằng môi trường DMEM sạch. Thêm môi trường DMEM mới có bổ sung cao chiết ở các nồng độ khác nhau và ủ trong 24 giờ. Hút loại bỏ môi trường và thêm vào mỗi giếng 50 µL MTT. Sau 4 giờ, thêm 150 µL DMSO vào để hòa tan muối formazan rồi đem đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ microplate reader. Khả năng gây độc tế bào được tính qua mức độ giảm màu so với các giếng đối chứng nuôi song song không bổ sung cao chiết. Phần trăm tế bào chết được tính bằng công thức: Độc tính (% tế bào chết) = (𝐴𝑏−As) Ab × 100 Trong đó: - As là độ hấp thu ở bước sóng 540nm của giếng có xử lý mẫu cao chiết - Ab là độ hấp thu ở bước sóng 540nm của giếng chứng, không xử lý mẫu cao chiết. 2.3.8. Khảo sát hình thái tế bào ung thư Nguyên tắc: tế bào sống sẽ có hình dạng đặc trưng của dòng tế bào đó và thành tế bào sẽ sáng và rõ nét dưới kính hiển vi. Đặc biệt, tế bào sống có thể chuyển hóa calcein-AM và phát sáng huỳnh quang. Khi tế bào chết thì tế bào không có hình dạng đặc trưng, tế bào co lại, thành tế bào gãy khúc gồ ghề và không có khả năng chuyển hóa calcein-AM. Tiến hành: tế bào được cấy vào đĩa 6 giếng với mật độ 2×105 tế bào/ml và được xử lý với cao phân đoạn EtOAc (100 và 200 µg/ml) trong 24 giờ. Hình thái tế bào sau đó được quang sát và chụp lại bằng kính hiển vi soi ngược ở độ 34 phóng đại ×10. Đối với thí nghiệm nhuộm huỳnh quang calcein-AM: tế bào sau khi được xử lý với mẫu thử thì được nhuộm với calcein-AM (5 µM, nồng độ cuối cùng) trong 60 phút trong tối. Mật độ phát huỳnh quang của mẫu được chụp dưới kính hiển vi soi ngược huỳnh quang ở độ phóng đại ×10. 2.3.9. Khảo sát về khả năng ức chế di chuyển của tế bào ung thư Nguyên tắc: tế bào ung thư có xu hướng di chuyển và bám kín bề mặt đĩa nuôi cấy khi tạo một vết cạo. Dựa vào mức độ làm lành vết cạo để xác định khả năng ức chế của cao chiết đối với sự di chuyển của tế bào ung thư. Tiến hành: tế bào được nuôi trên đĩa 6 giếng với mật độ 2×105 tế bào/ml. Một vết cạo được tạo thành bằng đầu típ ở tất cả các đĩa. Tế bào sau đó được xử lý với cao phân đoạn EtOAc (50 µg/ml) trong 24 giờ. Sự ức chế của cao phân đoạn đối với quá trình di chuyển của tế bào ung thư được quan sát dưới kỉnh hiển vi soi ngược ở độ phóng đại ×10. 2.3.10. Đánh giá mức biểu hiện gene của các phân thử tính hiệu bằng Realtime PCR Nguyên tắc: dựa trên phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR) nhằm khuếch đại và cùng lúc xác định được số lượng của phân tử DNA đích. Quy trình thí nghiệm theo nguyên tắc thông thường của phản ứng tổng hợp chuỗi, trong đó đặc điểm chính là đoạn DNA được nhân lên sẽ được phát hiện trong thời gian thực (real time). Cách để xác định được sản phẩm trong PCR định lượng là dựa vào các chất phát huỳnh quang không đặc hiệu gắn vào bất kỳ đoạn DNA mạch đôi. Tiến hành: tế bào ung thư dạ dày được nuôi trên đĩa với mật độ 2×105 tế bào/ml. Tế bào sau đó được xử lý với cao phân đoạn EtOAc (100 µg/ml) trong 24 giờ. Tế bào sau đó được thu nhận để tách chiết mRNA tổng dùng làm nguyên liệu cho phản ứng Realtime-PRC. Mồi khuếch đại các gene liên quan đến con đường apoptosis nội bào như caspase-3, caspase-8, caspase-9, và Bax được thiết kế dựa trên các trình tự thu nhận trên NCBI, sau đó đánh giá các thông số vật lý, độ đặc hiệu cũng như khả năng bắt cặp của mồi lên trình tự đích bằng các công cụ tin sinh học như OligoAnalyzer 3.1, Annhyb, BLAST, 35 Tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit RNeasy Mini Kit (QIAGEN) từ các dòng tế bào đã được ủ với cao chiết. Chuyển đổi RNA tổng số thành cDNA bằng kit QuantiTect Rev (QIAGEN). Transcription Kit và thực hiện phản ứng Realtime-PCR bằng kit QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). Tất cả quy trình được thực hiện dựa theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khảo sát sự biểu hiện gene dựa trên phương pháp định lượng tương đối 2-∆∆Ct của Livak như sau: Công thức tính hiệu số chênh lệch: ∆Cq = Cq (Tar) – Cq (Ref) Mức biểu hiện gene: ∆∆Cq = ∆Cq (Exp.) – ∆Cq (Con.) Trong đó: - Cq (quantification cycle): giá trị ngưỡng định lượng - Tar (Target): là gene đích; - Ref (Reference): là gene tham chiếu (GAPDH); - Exp. (Experimental): là mẫu thí nghiệm (có cao chiết); - Con. (Control): là mẫu đối chứng (mẫu trắng); 2.3.11. Xử lý số liệu Một số phần mềm được sử dụng cho việc xử lý số liệu trong luận văn như: Excel, Paint, Sigmaplot. 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT CÁC LOẠI RAU Nguyên liệu trước khi được sử dụng để khảo sát và đánh giá hoạt tính sinh học thường được kiểm tra về các chỉ tiêu như độ ẩm, hàm lượng tro, và hiệu suất thu hồi cao chiết. Sau khi tiến hành kiểm nghiệm và đánh giá chất lượng của nguyên liệu đầu vào gồm rau nhút, rau sam và rau diếp cá, chúng tôi thu được kết quả như được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả thu nhận cao chiết từ các loại rau Tên mẫu Dung môi Độ ẩm bột (%) Độ ẩm cao chiết (%) Hàm lượng tro (%) Hiệu suất thu hồi cao (%) Rau nhút Cao ethanol 7,5 ± 0,4 10,8 ± 0,4 5,5 ± 0,1 9,6 ± 0,1 Rau sam Cao ethanol 9,6 ± 0,6 11,8 ± 0,3 4,7 ± 0,2 10,4 ± 0,1 Rau diếp cá Cao ethanol 8,8 ± 0,4 10,8 ± 0,5 3,7 ± 0,4 11,7 ± 0,4 Kết quả cho thấy rằng độ ẩm của tất cả cao chiết đều không vượt quá 12% và hàm lượng tro không lớn hơn 8%. Điều này cho thấy bột nguyên liệu và cao chiết có thể đạt được tiêu chuẩn như được đề ra trong Dược điển Việt Nam và có thể được sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế sự sinh trưởng tế bào ung thư dạ dày. Ngoài ra, hiệu suất chiết cao cũng là tiêu chí để đánh giá hiệu quả chiết cao là nhiều hay ít. Trong nghiên cứu này, hiệu suất chiết cao chưa đạt đến mức tốt nhất, nằm trong khoảng từ 8,9 đến 12,8 %. Nguyên nhân có thể do quá trình tách chiết không có sự can thiệp của nhiệt độ nên chưa đạt được hiệu quả chiết tốt. Tuy nhiên, sự can thiệp của nhiệt độ cũng có mặt tiêu cực như làm biến tính hoặc thay đổi cấu trúc tự nhiên của chất trong nguyên liệu. 37 3.2. KẾT QUẢ VỀ ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT PHENOLIC TỔNG TRONG CAO ETHANOL TỪ CÁC LOẠI RAU Hợp chất phenolic hiện diện nhiều trong các bộ phận của thực vật với nhiều loại cấu trúc khác nhau. Nó đã được chứng minh với vai trò kháng nhiều loại ung thư thông qua ức chế quá trình phân chia, sinh trưởng, di căn, viêm, và gây chết tế bào theo con đường apoptosis. Thêm vào đó, nó còn có thể làm tăng đáp ứng của hệ thống miễn dịch và bắt các gốc tự do, góp phần bảo vệ tế bào bình thường trước nguy cơ trở thành tế bào ung thư [72, 73]. Chính vì vai trò nổi trội đó của hợp chất phenolic, nghiên cứu này cũng tiến hành định lượng thành phần phenolic tổng trong một số rau xanh được khảo sát. Kết quả khảo sát được thể hiện ở Hình 3.1 và Hình 3.2. Hình 3.1. Đường chuẩn axit galic Kết quả khảo sát hàm lượng phenolic tổng trong rau nhút, rau sam, và rau diếp cá được biểu thị theo đương lượng galic axit với đơn vị là mg/g cao khô. Kết quả cho thấy, hàm lượng phenolic tổng của rau nhút, rau sam và rau diếp cá khá cao, với giá trị lần lượt là 77,5; 71,3 và 70,2 mg/g cao. Hàm lượng phenolic tổng của rau nhút là cao nhất, tiếp sau là rau sam và diếp cá. Hàm lượng phenolic tổng của rau sam và diếp cá khác nhau không đáng kể. Đặc biệt, y = 0.0107x - 0.019 R² = 0.9964 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 20 40 60 80 100 120 O D ( 7 6 5 n m ) Nồng độ axit galic (µg/ml) 38 hàm lượng phenolic tổng trong rau nhút, rau sam và rau diếp cá được nhận thấy là cao hơn so với một số loại rau quả khác như rau ngải cứu (40,5 mg/g), đinh lăng (27,6 mg/g), bù ngót (71,5 mg/g), mã đề (21,4 mg/g), và trái khổ qua (24,7 mg/g) [74]. Hàm lượng phenolic tổng cao của rau nhút, rau sam và rau diếp cá có thể mang lại tiềm năng ức chế sinh trưởng và tiêu diệt tế bào ung thư, chẳng hạn tế bào ung thư dạ dày. Các thử nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu này sẽ được khảo sát liên quan đến hoạt tính ức chế sự sinh trưởng và tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày. Hình 3.2. Hàm lượng phenolic tổng của các loại rau 3.3. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VỀ HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CAO ETHANOL TỪ CÁC LOẠI RAU Để sàng lọc hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày, phương pháp MTT được sử dụng để đánh giá mức độ chết của tế bào khi được xử lý với cao chiết tổng của mỗi loại rau. Khả năng tiêu diệt của mỗi cao chiết đối với tế bào ung thư được biểu thị bằng giá trị IC50, nghĩa là tại một nồng độ của cao chiết mà ở đó 50% tế bào đã bị tiêu diệt. 39 Hình 3.3A. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau nhút Hình 3.3B. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau sam 40 Hình 3.3C. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau diếp cá Hình 3.4. Giá trị IC50 đối với hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các loại rau Kết quả khảo sát được thể hiện ở Hình 3.3A, 3.3B, 3.3C và hình 3.4. Kết quả cho thấy rằng, hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của rau nhút là cao nhất với giá trị IC50 đạt được là 301,7 ± 9,5 µg/ml, tiếp theo sau lần lượt là rau diếp cá với giá trị IC50 = 336,9 ± 20,4 µg/ml và rau sam với giá trị IC50 = 370,3 ± 13,6 µg/ml. Theo kết quả về khảo sát hàm lượng phenolic tổng, rau nhút có 41 hàm lượng phenolic tổng cao hơn so với rau sam và diếp cá. Điều này có thể phần nào góp phần làm cho hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư của rau nhút cao hơn so với rau sam và diếp cá. Mặc dù hàm lượng phenolic tổng của cao chiết rau nhút không cao vượt trội hơn so với các rau còn lại, nhưng hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của rau nhút lại cao hơn đáng kể so với rau sam và diếp cá. Điều này có thể liên quan đến sự hiện diện cũng như hàm lượng của các đơn chất phenolic ưu thế nào đó trong rau nhút, làm nên sự khác biệt so với các loại rau khác. Việc liên hệ với các nghiên cứu khác trên thế giới đã cho thấy rằng hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao chiết rau nhút cũng cao hơn đáng kể so với các dược liệu khác như gừng (IC50 > 5 mg/ml), hoa nghệ tây saffron (IC50 = 2,95 mg/ml), lô hội (IC50 > 5 mg/ml), và vỏ cà tím (IC50 = 1.87 mg/ml) [75,76]. Vì vậy, nghiên cứu sâu hơn trong tương lai liên quan đến phân lập các đơn chất phenolic từ rau nhút và đánh giá cơ chế hoạt động của chúng đối với khả năng tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày sẽ được hướng đến trong các nghiên cứu kế tiếp sau này. Từ kết quả sàng lọc trên, rau nhút sẽ được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo. 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HÀM LƯỢNG PHENOLIC TỔNG TRONG CÁC CAO PHÂN ĐOẠN RAU NHÚT Ethanol là một dung môi thông dụng được sử dụng cho việc tách chiết cao thô ban đầu. Cao chiết ethanol thường chứa nhiều thành phần từ không phân cực đến phân cực yếu và phân cực mạnh [77]. Tuy nhiên, để xác định hoạt tính sinh học nhất định của một nguyên liệu cụ thể được biểu hiện từ nhóm hợp chất nào, thì việc chiết cao phân đoạn thông qua sử dụng nhiều dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao là điều cần thiết. Việc chiết cao phân đoạn thường bắt đầu với dung môi không phân cực như hexane và petroleum ether, sau đó đến dung môi ít phân cực như diclomethan và ethyl acetat, và cuối cùng là dung môi phân cực mạnh như n-butanol và nước [78]. Trong nghiên cứu này, bốn dung môi có độ phân cực khác nhau gồm hexane, diclomethan (CH2Cl2), ethyl acetat (EtOAc), và n-butanol được sử dụng để tách cao phân đoạn có độ phân cực tương ứng từ cao tổng ethanol của rau nhút. Thêm vào đó, hàm lượng 42 phenolic tổng trong 4 cao phân đoạn sẽ được khảo sát. Kết quả khảo sát được thể hiện ở Bảng 3.2 và Hình 3.5. Bảng 3.2. Kết quả thu nhận cao phân đoạn từ rau nhút Dung môi Độ ẩm bột (%) Độ ẩm cao chiết (%) Hàm lượng tro (%) Hiệu suất thu hồi cao (%) Hexan - 11,9 ± 0,4 - 3,8 ± 0,4 CH2Cl2 - 9,0 ± 0,4 - 1,8 ± 0,2 EtOAc - 10,3 ± 0,2 - 0,9 ± 0,2 n-butanol - 11,8 ± 0,4 - 2,4 ± 0,1 Kết quả cho thấy cao phân đoạn EtOAc có hàm lượng phenolic cao nhất (126 ± 4,5 mg/g cao), tiếp theo sau lần lượt là n-butanol (84,3 ± 3,2 mg/g cao), CH2Cl2 (64,3 ± 2,1 mg/g cao), và hexan (26,3 ± 1,5 mg/g cao). Điều đó cho thấy rằng phenolic có độ phân cực trung bình chiếm hàm lượng cao trong rau nhút. Hình 3.5. Hàm lượng phenolic tổng trong các cao phân đoạn của rau nhút Tương tự như vậy, nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng xác nhận rằng cao phân đoạn EtOAc chứa hàm lượng phenolic tổng cao ở nhiều loại thực vật khác nhau như Retama raetam [79], Cymbopogon citratus [80], Musa acuminate [81], Rosmarinus officinalis [82], Camellia nitidissima [83], và Mentha spicata [84]. Hàm lượng cao của phenolic tổng trong cao phân đoạn 43 EtOAc của rau nhút có thể góp phần làm tăng hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày. Thử nghiệm về khả năng tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các cao phân đoạn trên sẽ được khảo sát trong phần tiếp theo. 3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VỀ HOẠT TÍNH TIÊU DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CÁC CAO PHÂN ĐOẠN RAU NHÚT Trong thử nghiệm này, hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của các cao phân đoạn như hexan, CH2Cl2, EtOAc, và n-butanol cũng được khảo sát thêm. Các cao phân đoạn hexan, CH2Cl2, EtOAc, và n-butanol được khảo sát ở dãy nồng độ 10 – 500 µg/ml. Kết quả khảo sát được thể hiện trên Hình 3.6A, 3.6B, 3.6C, 3.6D và Hình 3.7. Kết quả cho thấy các cao phân đoạn trên đều có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày cao hơn so với cao chiết tổng ethanol. Đáng chú ý, cao phân đoạn EtOAc có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư mạnh nhất so với các cao phân đoạn còn lại. Giá trị IC50 đối với việc tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn EtOAc là 172 ± 8,2 µg/ml, theo sau lần lượt là hexan (IC50 = 207,6 ± 7,4 µg/ml), CH2Cl2 (IC50 = 239,2 ± 36,6 µg/ml), và n- butanol (IC50 = 277,3 ± 8,6 µg/ml). Điều đó cho thấy các hợp chất có độ phân cực trung bình trong cao phân đoạn EtOAc của rau sam có ưu thế trong việc tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy rằng phân đoạn EtOAc thể hiện hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư một cách hiệu quả. Memariani và cộng sự đã chứng minh rằng phân đoạn EtOAc từ thân của cây Pseudocedrela kotschyi có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư vú và ung thư cổ tử cung [85]. Hidayat và cộng sự cũng chứng minh sự hiệu quả của cao phân đoạn EtOAc từ cây Dioscorea bulbifera đối với việc tiêu diệt tế bào ung thư biểu mô đại trực tràng [86]. Thêm vào đó, cao phân đoạn EtOAc từ tỏi Allium sativum và tai tượng đỏ Acalypha Wilkesiana cũng cho thấy tính hiệu quả trong việc tiêu diệt các dòng tế bào ung thư vú, ung thư gan, và ung thư cổ tử cung [87,88]. 44 Hình 3.6A. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn hexan từ rau nhút Hình 3.6B. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của cao phân đoạn CH2Cl2 từ rau nhút 45 Hình 3.6C. Hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư dạ dày của ca