Luận văn Khảo sát thành phần lớp chất lipit và hoạt tính sinh học của loài hàu Thái Bình Dương (crassostrea gigas)

5 ‰, tối đa ở Baealdo và tối thiểu ở Dontak, nhận thấy C. rivelaris có khả năng sinh sản vào tháng 6 và tháng 7. Giá trị kích thước của chiều cao vỏ lần lượt là 149,7 ± 19,8mm (Baealdo), 148,6 ± 21,3mm (cầu Seomjin) và 143,1 ± 17,6mm (Dontak) [46]. Các thử nghiệm về lấy giống và nuôi hàu sữa Crassostrea lugubris (Sowerby, 1871) của Cao Văn Nguyên và Nguyễn Tác An được tiến hành ở đầm Nha Phu từ năm 2003 - 2005, kết quả cho thấy: Thời gian lấy giống tốt nhất trong năm: vụ 1 từ 25/3 - cuối tháng 6 và vụ 2 khoảng từ 1/9 - 25/10. Tăng trưởng và tỷ lệ sống của ba hình thức nuôi hàu (cọc, giàn treo, rải đáy) như sau: i) Hình thức nuôi cọc tốc độ tăng trưởng bình quân đạt 9 ± 0,5 mm/tháng chiều dài vỏ, và trọng lượng tương ứng 9,6 ± 0,3g/tháng, tỷ lệ sống là 100%. ii) Hình thức nuôi giàn treo tốc độ tăng trọng trung bình 1 tháng tuổi tăng về chiều dài là 8,4 ± 0,5 mm, trọng lượng trung bình là 8,2 ± 0,5g, tỷ lệ sống đạt 97%. iii) Hình thức nuôi đáy tốc độ tăng trưởng bình quân đạt 7,6 ± 0,6mm/tháng chiều dài vỏ, và trọng lượng tương ứng 7,4 ± 0,6g/tháng, tỷ lệ sống 82% [47]. 1.2.4. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu – Hàu Thái Bình Dương ➢ Đặc điểm sinh vật Hàu Thái Bình Dương – Pacific oyster, Crassostrea gigas (Thunberg, 1793), là loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ thuộc giống Crassostrea, họ Ostreoidea, bộ Ostreoida. Chúng có nguồn gốc từ vùng biển Nhật Bản/Hàn Quốc và là một trong những loài nhuyễn thể có diện tích, sản lượng lớn nhất so với các loài nhuyễn thể khác. Hàu Thái Bình Dương là loài có kích thước lớn nhất trong các loài hàu có trên thế giới, kích thước trung bình từ 8 – 20 cm, có sức sinh trưởng nhanh có thể đạt 100mm trong 12 tháng đầu đời, tuổi thọ có thể đạt 13 năm. Hàu Thái Bình Dương có dạng giống với hàu cửa sông (C.rivularis), tuy nhiên hàu Thái Bình Dương có tỷ lệ chiều cao và chiều dài lớn hơn từ 1/2 – 26 1/3 hàu cửa sông. Hình dạng, kích thước, màu sắc có sự khác nhau tùy vào khu vực sinh sống [48, 49]. Các loài Hàu thuộc giống Crassostrea có đặc điểm lưỡng tính, trong đó hầu hết các cá thể non là đực. Sau đó, tỷ lệ giới tính trở nên ngang bằng, và cuối cùng hầu hết các cá thể lớn hơn trở thành cá thể cái. Tỷ lệ giới tính hàu Crassostrea không chỉ thay đổi theo thời gian mà còn thay đổi theo nhóm kích thước. Ở nhóm kích thước càng lớn thì tỷ lệ cá thể cái càng tăng và tỷ lệ cá thể đực giảm xuống. Chúng sống ở bờ biển, ở các ghềnh đá ven bờ biển hay các cửa sông, sống bám vào một giá thể như bám vào đá thành tảng, các rạn đá, móng cầu, ăn sinh vật phù du và các sinh vật trong bùn, cát, nước biển.... Loài hàu này là loài chịu được khoảng nhiệt rộng (-2) - 36oC và muối rộng 5 - 45‰ nên chúng đang được nuôi ở nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam [50-52]. Hình 1.9. Hình ảnh mẫu hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) ➢ Các nghiên cứu về loài Hàu Thái Bình Dương trên thế giới Hàu Thái Bình Dương đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu từ những năm cuối của thế kỉ 20. Các nghiên cứu về hình thái, phân bố bắt đầu từ năm 1971 của Stenze và một loạt các nghiên cứu tiếp theo về đặc điểm sinh học, phân loại của loài Hàu này cũng được thực hiện bởi các nhà khoa học Bernard (1983), Harry (1985) và Brock (1990). Thành phần sinh hóa của hàu Thái Bình Dương cũng đã được một số nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu. Năm 1996, nhóm nghiên cứu của 27 Antonio J. Pazos đã chỉ ra sự dao động trong hàm lượng lipit có liên quan đến nồng độ thực vật phù du và chu kỳ sinh dục. Sự thay đổi theo mùa trong hàm lượng lipit chủ yếu là do sự thay đổi của triacylglycerol, nhóm lipit chính. Hàm lượng axit béo không no đa nối đôi (PUFA) có mối tương quan nghịch với nhiệt độ, trong khi các axit béo n-6 có biến động nhỏ trong suốt cả năm và cho thấy không có sự thay đổi rõ ràng theo mùa [31]. Năm 1999, nhóm nghiên cứu của Philippe Soudant đã phân tích thành phần lớp chất lipit và axit béo của lipit phân cực và trung tính trong cơ, tuyến tiêu hóa và tuyến sinh dục của hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas. Kết quả chỉ ra rằng các lipit phân cực của cả ba vật liệu nghiên cứu trong điều kiện nuôi nhân tạo tương tự như trong điều kiện tự nhiên. Các lipit phân cực dao động ít, với giá trị phosphatidyl choline (PC) trung bình là 34%, phosphatidylethanolamine (PE) 25%, phosphatidylinositol (PI) + ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) 11%, và phosphatidylserine (PS) 9,5% [38]. Sau khi đánh giá về hàm lượng lipit tổng, phospholipid, axit béo và sterol ở quần thể Crassostrea gigas xâm lấn ở Vịnh Bourgneuf, Pháp, trong bốn mùa liên tiếp, nhóm của Flora Dagorn (2016) đã chỉ ra rằng hàm lượng lipit tổng (% trọng lượng khô) thay đổi từ 7,1% (mùa đông) đến 8,6% (mùa xuân). Trong đó, lipit phân cực (PLs) chiếm 28,1% (mùa xuân) đến 50,4% (mùa đông). Phosphatidylcholine là PL chiếm ưu thế trong suốt cả năm (lên đến 74% tổng số PL trong mùa đông). Ba mươi bảy axit béo đã được xác định trong PL. Axit eicosapentaenoic (20:5n-3 EPA/7,53% đến 14,5%) và axit docosahexaenoic (22:6n-3 DHA/5,51% đến 9,5%) là các FA không bão hòa đa nối đôi chiếm ưu thế trong tất cả các mùa. Hai mươi sterol tự do đã được xác định, bao gồm cholesterol chiếm 29,9% sterol tổng và phytosterol chiếm khoảng 33% [53]. Các nghiên cứu về quá trình sinh trưởng, sinh sản của hàu Thái Bình Dương cũng được nghiên cứu. Năm 2001, nhóm nghiên cứu M. Caers và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh sản loài Hàu C.gigas và thành phần các lớp chất lipit và axit béo của trứng loài C.gigas thu thập được ở miền Bắc xứ Wales nước Anh. Mẫu nghiên cứu đã được chia làm hai nhóm với hai chế độ 28 ăn khác nhau. Một nhóm cho ăn duy nhất một loại tảo xanh D. Tertiolecta. Một nhóm cho ăn tảo xanh D. Tertiolecta có bổ sung thêm EPA và DHA. Mẫu đối chứng cho ăn hỗn hợp tảo Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis suecica và Rhodomonas sp. với tỉ lệ 1:1:1 về trọng lượng khô. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở chế độ ăn tảo xanh D. Tertiolecta. có bổ sung thêm EPA và DHA, tỷ lệ tạo ấu trùng của nhóm hàu này so với nhóm đối chứng không có sự khác biệt đáng kể: 80% (mẫu đối chứng) và 63% sau 7 tuần; 87% (mẫu đối chứng) và 74% sau 8 tuần thử nghiệm. Tỷ lệ này cao hơn nhiều so với nhóm mẫu chỉ ăn D. Tertiolecta (24% và 41% sau 7 và 8 tuần thử nghiệm). Tuy nhiên, khi phân tích trứng của các mẫu Hàu thử nghiệm cho thấy ở trứng của nhóm Hàu ăn tảo xanh D. Tertiolecta có bổ sung thêm EPA và DHA có hàm lượng DHA 22:6n-3 trong lipit trung tính (NL:8.5-14.7%) và lipit phân cực (PL: 4.0- 13.4%) tăng đáng kể. Hàm lượng lipit trung tính đạt 62% lipit tổng, trong đó, TAG chiếm 65% trong NL [54]. Năm 2015, công trình nghiên cứu của Gianluca và cộng sự đã tiến hành đánh giá quá trình sinh trưởng của Hàu Cassostrea gigas nuôi ở biển nam Tyrrenian trong vòng 12 tháng, ở độ sâu 7 - 13 m dưới mặt nước biển, trên các đường dài liên kết với rạn san hô nhân tạo. Kết quả cho thấy có kích thước trung bình ban đầu là 11,50 ± 2,78 mm (0,0036 ± 0,01g trọng lượng khô) và đã đạt 47,50 ± 12,30 mm (0,13 ± 0,04g trọng lượng khô) ở độ sâu −7 m và 41 ± 11,43 mm (0,11 ± 0,04g trọng lượng khô) ở độ sâu −13 m, sau 12 tháng [55]. ➢ Các nghiên cứu về loài Hàu Thái Bình Dương ở Việt Nam Hiện tại hàu Thái Bình Dương được nuôi ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam, Việt Nam [56]. Tuy nhiên, nhu cầu thị trường không nhiều nên quy mô nuôi không lớn và chưa có sản phẩm xuất khẩu. Trong khi, hàu Thái Bình Dương cho thấy lợi thế về kích thước và khối lượng, cũng như thời gian sinh trưởng ngắn, thịt hàu giàu vitamin và dưỡng chất, có thể sử dụng trong cả thực phẩm và y học. Nhận thấy tiềm năng đó, nước ta đang ngày một mở rộng diện tích và nâng cao công nghệ nuôi loài hàu này. 29 Kết quả nuôi thử nghiệm hàu TBD Cà Mau cho thấy, hàu có khả năng sống và tăng trưởng tại các ao (Ao lắng, Quảng canh, Thâm canh) nhưng hàu TBD được nuôi trong ao Thâm canh có tỷ lệ sống cao (78,7%) và tăng trưởng kích thước cao nhất (51,7 con/tháng chiều dài vỏ; 67,2 con/tháng chiều cao vỏ) so với ao nuôi Quảng canh và Ao lắng. Điều kiện môi trường ở ao Thâm canh thích hợp cho hàu sinh trưởng hơn các ao khác, nhiệt độ nằm trong khoảng tối ưu cho hàu phát triển (27,5-28,9oC), độ mặn ổn định ít biến động (32,3-36,0‰). Bên cạnh nhiệt độ, độ mặn thì nguồn thức ăn (TVPD và mùn bã hữu cơ) cũng là yếu tố quan trọng đối với sự sinh trưởng của hàu TBD [57]. Nghiên cứu của Đoàn Trần Tấn Đào và cộng sự thực hiện từ 15/3 – 5/4/2011 về ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng của hàu cho thấy tỷ lệ sống của hàu ở độ mặn 25‰ là cao nhất và thấp nhất ở độ mặn 30‰ trong khoảng độ mặn nghiên cứu từ 15 - 30 ‰ [58]. Trần Thị Kim Anh và cộng sự nghiên cứu khả năng nuôi hàu Thái Bình Dương tại cửa sông Hoàng Mai, Nghệ An cho thấy sau 5 tháng hàu đạt chiều dài vỏ trung bình 33,0-38,0 mm (6,2-7,3 mm/tháng), chiều cao vỏ 48,5-60,6 mm (9,2-11,5 mm/tháng), khối lượng 18-22g (3,37-6,10 g/tháng), độ béo 21,3-24,6% và tỷ lệ sống dao động từ 43,2-55,9% [59]. Có thể nhận thấy các nghiên cứu ở nước ta hiện nay mới chỉ tập trung vào các vấn đề như: Nghiên cứu đặc điểm sinh học, đặc điểm sinh sản, khả năng thích nghi và tạo con giống hàu TBD thương phẩm. Chưa dành sự quan tâm đúng mức với có thành phần dinh dưỡng cũng như hoạt tính sinh học ở loài hàu này. 30 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu Hai mẫu hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas (Bivalvia, Ostreoida, Ostreide, Magallana) nuôi (H4-1) và tự nhiên (H5-1) thu thập vào tháng 3 năm 2018 tại Đầm Nha Phu, tỉnh Khánh Hòa. Mẫu được định danh bởi PGS. TS Đàm Đức Tiến, phòng Sinh thái và Tài nguyên Động vật biển, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển Hải Phòng. a) b) Hình 2.1. Hình ảnh mẫu hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas nuôi và hàu Crassostrea gigas tự nhiên a) Mẫu nuôi, b) Mẫu tự nhiên 2.1.2. Vật tư, thiết bị - Bản mỏng TLC 6 cm x 6 xm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga - Máy scan Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản) - GC-MS QP2010 của hãng Shimadzu, Nhật Bản - Máy Shimadzu LCMS-IT-TOF, do hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) - Bộ Mouse IL-2 (mouse) ELISA Kit - Assay Kit (Abcam, Cambridge, England) 31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp chiết lipit tổng Từ mẫu hàu tươi thu được, lipit tổng được chiết theo phương pháp của Folch J.F. – phương pháp được sử dụng thường quy cho mẫu sinh vật biển tại phòng thí nghiệm Hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên [60]. 50g mẫu hàu sau khi băm nhỏ, được chiết bằng 300ml hỗn hợp dung môi CHCl3:MeOH (2:1, theo thể tích) ở nhiệt độ 4oC trong 24h, chiết 2 lần. Dịch chiết thu được được bổ sung thêm 100ml H2O. Sau khi hỗn hợp phân lớp, lớp dưới chứa lipit được thu lại và cô quay loại bỏ dung môi. Lipit tổng được hòa tan trong dung môi CHCl3 tinh khiết và bảo quản ở -18oC trước khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipit Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipit được phân tích và xác định trên bản mỏng tráng sẵn (6 cm x 6 xm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga), hiện hình bằng dung dịch axit H2SO4/MeOH 5%, sấy đến khi các lớp chất hiện hình hoàn toàn; scan trên máy Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật Bản) với độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn. Phần trăm của các lớp chất trong lipit tổng được xác định dựa trên sự đo diện tích và cường độ màu trong chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, LB Nga. 2.2.3. Phân tích thành phần và hàm lượng axit béo lipit tổng Axit béo được methyl hóa sang dạng methyl ester theo quy trình sau: 3-5mg lipit tổng được bổ sung 2ml H2SO4/MeOH 1%. Quá trình phản ứng diễn ra ở nhiệt độ 80oC trong 2h. Sau khi kết thúc phản ứng, bổ sung vào hỗn hợp 300ml H2O và 1ml Hexan, lắc đều, để hỗn hợp phân lớp hoàn toàn và thu được phần dịch chiết hexan. Tiến hành rửa lặp lại với pha dưới bằng 1ml Hexan. Toàn bộ phần dịch pha hexan thu được, được loại bỏ dung môi, phần 32 metyleste của các axit béo được làm sạch trên bản mỏng TLC (6x6cm) với hệ dung môi hexan/dietylete = 95/5. Thành phần và hàm lượng các axit béo được xác định trên máy GC-MS QP2010 của hãng Shimadzu với của injector, detector ở nhiệt độ 250oC. Chương trình nhiệt độ biến thiên từ 160oC tăng đều 2oC/phút đến 260oC, sau đó giữ ở nhiệt độ cuối cùng 20 phút. Tổng thời gian phân tích cho một mẫu 70 phút. Cấu trúc của các axit béo được xác định bằng phổ khối lượng kết hợp với sự so sánh phổ MS chuẩn trên GC-MS. 2.2.4. Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất phospholipid trong các mẫu hàu nghiên cứu Thành phần các lớp chất phospholipid được xác định bằng TLC 2 chiều trên bản mỏng tráng sẵn (6 cm x 6 cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga), sử dụng các thuốc thử molybdate và ninhydrin; hàm lượng các lớp chất phospholipid được phân tích bằng máy Shimadzu LCMS-IT-TOF, do hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) cung cấp tại IBM-FEB-RAS. [61, 62]. 2.2.5. Phương pháp thủy phân tạo bột đạm hàu Thịt Hàu được rửa sạch, xay nhỏ; bổ sung H2O/nguyên liệu theo tỷ lệ 4/1, v/w; bổ sung enzyme Bromelanin (1.275% trọng lượng nguyên liệu); gia nhiệt cho hỗn hợp đến 49oC, giữ nguyên nhiệt độ; tiến hành thủy phân trong khoảng thời gian 4,5 giờ. Sau thủy phân, ly tâm, lọc tách riêng phần bã. Dịch lọc thu được bổ sung chất trơ, đem sấy phun thu được hỗn hợp bột hàu. 2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống suy giảm miễn dịch 2.2.6.1. Xác định khả năng tăng sinh tế bào Phương pháp được thực hiện theo Scudiero DA và cs. 1988. Tế bào lympho được phân lập trực tiếp từ lách chuột và ủ với mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau là 100µg/ml, 20µg/ml, 4µg/ml và 0,8 µg/ml. Sau 48h ủ với mẫu, khả năng kích thích tế bào phát triển của mẫu nghiên cứu được xác định bằng phương pháp MTT. Theo đó 20µl MTT (5mg/mL) được đưa vào các giếng và ủ trong 4 giờ. Sau khi loại bỏ hết môi 33 trường, màu formazan tạo thành được hòa tan bằng 100µl DMSO. Đọc kết quả bằng máy đo ELISA ở bước sóng 570nm. Sự phát triển của tế bào được xác định bằng công thức: % tế bào phát triển = [ODchất thử x 100] ODđối chứng âm 2.2.6.2. Xác định khả năng đại thực bào thông qua khả năng kích thích sự tăng tiết IL-2 Tế bào RAW264.7 được đưa ra các giếng của đĩa 96 giếng với nồng độ 2x105 tế bào/giếng, tế bào được nuôi ổn định trong tủ ấm CO2 qua đêm trước khi được ủ với mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau là 100µg/ml, 20µg/ml, 4µg/ml và 0,8 µg/ml với sự có mặt của LPS (5 µg/mL) trong 24 giờ. Sau đó dịch nổi được thu lại, ly tâm để loại bỏ tế bào, và giữ ở -20oC cho thí nghiệm tiếp theo. Sự sản suất IL-2 trong dịch nổi tế bào dưới tác động của mẫu thử được xác định bằng các bộ Mouse IL-2 (mouse) ELISA Kit theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Các số liệu được xử lí trên Excel, được trình bày dạng mean ± SE. Các thuật toán thống kê Student's t-test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng bệnh lý, với P < 0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa thống kê. 2.2.7. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống loãng xương 2.2.7.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Dòng tế bào MC3T3-E1 được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy alpha-MEM có bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS), 1% kháng sinh PS ở điều kiện 37oC và 5% CO2. Tế bào được cấy chuyển bằng Trypsin - EDTA (0,05%) sau 2 ngày nuôi cấy. Để xác định khả năng biệt hóa MC3T3-E1 thành nguyên bào xương, tế bào sau khi phủ 80% bề mặt nuôi cấy, được nuôi trong môi trường biệt hóa có bổ sung 10M β-glycerophosphate và 50 ng/mL axit ascorbic . 34 2.2.7.2. Phép thử sinh học xác định sự phát triển của tế bào dưới tác động của chất nghiên cứu Phương pháp MTT được sử dụng để xác định sự phát triển của tế bào MC3T3-E1 dưới tác động của chất nghiên cứu. Phương pháp này xác định sự phát triển của tế bào thông qua sự hình thành sản phẩm formazan màu khi đưa MTT vào giếng tế bào dưới tác động của enzyme trong tế bào sống. Phương pháp được thực hiện theo các bước sau: Tế bào MC3T3-E1 được đưa vào đĩa 96 giếng với nồng độ 1x104 tế bào/giếng; Tế bào trong đĩa được ủ với chất thử pha trong DMSO 10% để có nồng độ nồng độ 100µg/ml; 20µg/ml; 4µg/ml; 0.8µg/ml. Các giếng tế bào chỉ có dung môi pha mẫu được sử dụng làm đối chứng âm; Ủ đĩa tế bào thí nghiệm trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 trong 3 ngày; thêm vào mỗi giếng 20µl MTT (5mg/ml), ủ trong tủ ấm 37oC trong 4 giờ; - Loại bỏ dịch nổi, thêm vào mỗi giếng 100µl DMSO để hòa tan mầu formazan tạo thành, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio - Rad) để đọc kết quả ở bước sóng 490nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: % Sống sót = [ODchất thử x 100] ODđối chứng âm 2.2.7.3. Phương pháp xác định sự hoạt động của Alkalin phosphatase (ALP) Tế bào được đưa ra đĩa 96 giếng. Khi tế bào phủ kín 80% bề mặt nuôi cấy, tế bào được nuôi trong môi trường biệt hóa có bổ sung 10mM β- glycerophosphate và 50µg/mL ascorbic axit. Sau đó mẫu thí nghiệm được đưa vào với các nồng độ khác nhau. Môi trường cũng như mẫu thử được thay mới 2 - 3 ngày một lần. Hoạt động của ALP trong tế bào vào ngày thứ 7 được xác định bằng ALP Assay Kit (Abcam, Cambridge, England) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 35 % hoạt động ALP = [ODchất thử x 100] ODđối chứng âm 2.2.7.4. Xác định khả năng kích thích tạo Collagen Tế bào được nuôi trong môi trường biệt hóa và ủ với mẫu thử. Sau 10 ngày ủ hoạt chất, tế bào được rửa bằng PBS, cố định bằng dung dịch Bouin’s fluid trong 1 giờ. Sau khi cố định, đĩa thí nghiệm được rửa dưới vòi nước trong 15 phút và để khô. Sau đó tế bào được nhuộm bằng Sirius red 0,1% trong axit picric trong 1h và rửa bằng HCl 0,01M để loại bỏ thuốc nhuộm còn dư; Cuối cùng, màu nhuộm đã gắn với collagen tế bào được hòa lại trong NaOH 0,1M. Mật độ quang OD được xác định bằng máy đo ELISA (Bio- Rad) ở bước song 550nm. Khả năng kích thích tạo collagen dưới tác động của mẫu thử được so sánh với đối chứng âm theo công thức: % tạo collagen = [ODchất thử x 100] ODđối chứng âm 2.2.7.5. Xác định khả năng kích thích tạo khoáng Khả năng tạo khoáng dưới tác động của mẫu thử được xác định theo phương pháp nhuộm Anizarin red S. Sau 15 ngày ủ mẫu, tế bào được rửa 2 lần với PBS và cố định với ethanol ý nghĩa về mặt thống kê sinh học 70% trong 1 giờ. Tế bào sau đó được nhuộm với alirazin Red S 40mM (pH 4,4) trong 15 phút và rửa lại bằng nước cất khử ion. Lượng màu nhuộm gắn với canxi được hòa tan với cetylpyridinum chloride 10% và lắc nhẹ trong 15 phút. Đo mật độ quang học ở bước sóng 561 nm bằng máy đo Microplate Reader (Biorad). 36 Khả năng kích thích tạo khoáng dưới tác động của mẫu thí nghiệm được so sánh với đối chứng âm. % tạo canxi = [ODchất thử x 100] ODđối chứng âm Các số liệu được xử lí trên Excel, được trình bày dạng mean ± SD. Các thuật toán thống kê Student's t-test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng âm, với P < 0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê sinh học. 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG LIPIT VÀ AXIT BÉO TRONG MẪU HÀU THÁI BÌNH DƯƠNG C. GIGAS 3.1.1. Hàm lượng lipit tổng trong các mẫu hàu nghiên cứu Hàm lượng lipit tổng (TL) của 2 mẫu hàu nuôi và hàu tự nhiên nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.1, mỗi mẫu được lặp lại 3 lần. Bảng 3.1. Hàm lượng lipit tổng của các mẫu hàu nghiên cứu STT Mẫu Hàm lượng lipit tổng (% trọng lượng tươi) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1 Crassostrea gigas nuôi 1,59 1,48 1,43 1,50 2 Crassostrea gigas tự nhiên 2,17 1,92 2,12 2,07 Hàm lượng lipit tổng của 2 mẫu nghiên cứu khá cao, trong đó, mẫu hàu tự nhiên (2,07%) có hàm lượng lipit tổng trung bình cao hơn so với mẫu hàu nuôi (1,50). Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của nhóm Subasinghe M. M. thực hiện trên đối tượng hàu Crassostrea madrasensis nuôi và tự nhiên ở Sri Lanka vào năm 2019. Trong nghiên cứu đó chỉ ra rằng, hàm lượng lipit tổng của hàu tự nhiên cao hơn ở hàu nuôi (1,59 ± 0,01% so với 1,54 ± 0,02%), tuy nhiên sự chệnh lệch này là không đáng kể [32]. 3.1.2. Thành phần và hàm lượng axit béo trong các mẫu hàu nghiên cứu Kết quả nghiên cứu về thành phần và hàm lượng các axit béo được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.1. 38 Bảng 3.2. Thành phần và hàm lượng axit béo trong lipit tổng các mẫu hàu nghiên cứu TT Axit béo Tên thường Tên khoa học Hàm lượng axb trong C. gigas nuôi (%) Hàm lượng axb trong C. gigas tự nhiên (%) 1. 14:0 Myristic acid Tetradecenoic acid 7,2 5,1 2. i-15:0 Iso-pentadecanoic acid 13-Methyltetradecanoic acid 0,3 0,1 3. 15:0 Pentadecylic acid Pentadecanoic acid 1,4 0,8 4. i-16:0 Iso-palmitic acid 14-Methylpentadecanoic acid 0,2 - 5. 16:0 Palmitic acid Hexadecanoic acid 28,2 26,0 6. 16:1n-7 Palmitoleic acid 9-hexadecenoic acid 7,2 6,3 7. 16:1n-5 palmitvaccenic acid 11-hexadecenoic acid 0,2 0,2 8. i-17:0 Iso-margaric acid 15-methylhexadecanoic acid 0,8 0,3 9. a-17:0 Anteiso- margaric acid 14- Methylhexadecanoicacid 0,4 0,1 10. 17:0 Margaric acid Heptadecanoic acid 2,1 1,7 11. 16:3n-3 7,10,13- hexadecatrienoic acid 0,8 2,4 12. i-18:0 Iso-stearic acid 16-Methylheptadecanoic acid 0,2 0,2 13. 18:0 Stearic acid Octadecanoic acid 4,6 6,0 14. 18:1n-9 Oleic acid 9-octadecenoic acid 1,9 2,3 15. 18:1n-7 Vaccenic acid 11-octadecenoic acid 6,6 7,4 16. 18:2n-6 Linoleic acid 9,12-octadecadienoic acid 1,5 1,4 39 17. 18:3n-6 γ- Linoleic acid 6,9,12-octadecatrienoic acid 0,4 0,4 18. 18:3n-3 α- Linoleic acid 9,12,15-octadecatrienoic acid 1,3 1,0 19. 18:4n-3 Stearidonic acid 6,9,12,15 - octadecatetraenoic acid 1,7 1,4 20. 20:0 Arachidic acid Eicosanoic acid - 0,1 21. 20:1n-11 Gadoleic acid 9-eicosenoic acid 1,1 1,6 22. 20:1n-9 Gondoic acid 11-eicosaenoic acid - 0,2 23. 20:1n-7 13-Eicosenoic acid 1,5 2,7 24. 20:2n Eicosatetraenoic acid 0,3 0,3 25. 20:3n-6 Dihomo-γ- linolenic acid 8,11,14-eicosatrienoic acid 0,2 0,3 26. 20:4n-6 Arachidonic acid 5,8,11,14- eicosatetraenoic acid 3,8 3,5 27. 20:4n-3 8,11,14,17- eicosatetraenoic acid 0,3 0,3 28. 20:5n-3 EPA 5,8,11,14,17- eicosapentaenoic acid 12,7 13,9 29. 21:3n-3 12,15,18- Heneicosatrienoic acid - 0,2 30. 22:2n Docosadienoic acid 1,3 2,2 31. 21:5n-3 Heneicosapentaenoic acid 0,7 0,8 32. 22:4n-6 Adrenic acid 7,10,13,16- docosatetraenoic acid 0,3 0,3 33. 22:5n-6 n-6- Docosapentaenoic acid 4,7,10,13,16- docosapentaenoic acid 0,4 0,5 34. 22:5n-3 Docosapentaenoic acid 7,10,13,16,19- docosapentaenoic acid 1,0 1,0 35. 22:6n-3 DHA 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic acid 6,5 7,0 40 SFA 45,4 40,5 MUFA 18,5 20,7 PUFA 33,2 36,9 Khác 2,9 2,1 ω-3 25,0 28,0 ω-6 6,6 6,4 ω-3/ ω-6 3,76 4,38 Từ bảng 3.2 và hình 3.1 ta thấy, trong hai đối tượng hàu tự nhiên và hàu nuôi được nghiên cứu, thành phần và hàm lượng của các nhóm axit béo trong lipid tổng không có sự khác biệt rõ rệt. Một số axit béo như 20:0 (0,1%), 20:1n-9 (0,2%) và 21:3n-3 (0,2%) chỉ được phát hiện trong mẫu hàu tự nhiên mà không được tìm thấy trong mẫu hàu nuôi. Chỉ có axit béo i-16:0 (0,2%) được tìm thấy trong mẫu hàu nuôi mà không tìm thấy trong mẫu hàu tự nhiên. Tuy nhiên hàm lượng của các axit béo này không đáng kể (< 0,5%). Hàm lượng axit béo no (SFA) trong mẫu hàu nuôi (45,4%) cao hơn so với mẫu hàu tự nhiên (40,5%). Trong đó, axit béo 16:0 chiếm hàm lượng cao nhất trong lipit tổng của cả hai mẫu nghiên cứu (đạt 26,0% đối với mẫu hàu tự nhiên và 28,2% đối với mẫu hàu nuôi), tiếp theo đó là axit béo 14:0 (đạt 7,2% trong mẫu hàu nuôi và 5,1% trong mẫu hàu tự nhiên) và 18:0 (4,6% trong mẫu hàu nuôi và 6,0% trong mẫu hàu tự nhiên); các SFA còn lại như 15:0, 17:0 và 20:0 xuất hiện với hàm lượng nhỏ (0,1-2,1%). Axit béo không no một nối đôi (MUFA) được biết đến là có tác động tốt cho tim mạch do nó có tác dụng làm giảm cholesterol xấu trong máu mà không ảnh hưởng đến cholesterol tốt, giảm nồng độ triacylglycerol trong huyết tương hoặc cải thiện độ nhạy insulin và lipit huyết thanh [66]. Hàm lượng MUFA trong mẫu hàu tự nhiên chiếm 20,7% cao hơn so với mẫu hàu nuôi chiếm 18,5%. Trong nhóm này, các axit béo chủ yếu được tìm thấy ở cả 2 đối tượng nghiên cứu là là 16:1n−7 (6,3% đối với hàu tự nhiên và 7,2% đối với mẫu hàu nuôi), 18:1n−7 (6,6% ở mẫu hàu nuôi và